補(bǔ)體抑制活性物質(zhì)魚腥草總多糖中內(nèi)毒素的去除

張娟娟　張慶琳　盧燕 陳道峰

[摘要] 為建立補(bǔ)體抑制活性魚腥草總多糖中內(nèi)毒素的去除方法，將瓊脂糖疏水色譜及聚丙烯酰胺凝膠過濾色譜分別與多粘菌素親和吸附色譜聯(lián)用純化魚腥草多糖。以顯色基質(zhì)比色法檢測純化前后內(nèi)毒素的含量變化，細(xì)胞溶血法檢測純化前后體外抗補(bǔ)體活性變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疏水色譜與親和吸附色譜的聯(lián)用對內(nèi)毒素的清除效果優(yōu)于凝膠過濾色譜與親和吸附色譜的聯(lián)用，其清除率達(dá)42.85%。內(nèi)毒素清除前后，抗補(bǔ)體活性沒有明顯變化。表明疏水色譜與親和吸附色譜聯(lián)用可用于清除魚腥草總多糖中的內(nèi)毒素且不影響其抗補(bǔ)體活性。

[關(guān)鍵詞] 魚腥草總多糖； 內(nèi)毒素； 抗補(bǔ)體； 疏水色譜； 親和吸附色譜

Removal of lipopolysaccharides from anticomplementary crude

polysaccharides of Houttuynia Herba

ZHANG Juanjuan， ZHANG Qinglin， LU Yan*， CHEN Daofeng

（School of Pharmacy， Fudan University， Shanghai 201203， China）

[Abstract] An AffiPrep Polymyxin column was combined with a Phenyl Sepharose column and a Sephacryl S300 column， respectively， to remove the lipopolysaccharides（LPS） in the anticomplementary crude polysaccharides of Houttuynia Herba. The contents of LPS in the polysaccharides were determined by chromogenic tachypleus amebocyte lysate（TAL）method during the procedure of purifying. The anticomplementary activities of the polysaccharides were also compared before and after the removal of LPS. Less remanent LPS was detected after purified using Penyl Sepharose combined with polymyxin column， with the clearance rate of 42.85%. All the columns had no effect on the anticomplementary activity of the polysaccharides. Penyl Sepharose combined with polymyxin column would be sound for LPS removal of the anticomplementary polysaccharides without reducing their bioactivity.

[Key words] crude polysaccharides of Herba Houttuynia； LPS； anticomplementary； Penyl Sepharose； polymyxin

魚腥草Houttuynia Herba為三白草科Saururaceae蕺菜屬植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鮮全草和干燥的地上部分，具有利尿通淋、抗炎抗過敏、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效[13]。補(bǔ)體系統(tǒng)（complement system）是將對病原體的識別有效地轉(zhuǎn)化為宿主對最初感染發(fā)揮防御功能的主要機(jī)制之一。補(bǔ)體的過度激活會引起人體免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng)，參與多種疾病的病理過程[4]，臨床上目前尚無理想的治療藥物。近年來，本課題組致力于中藥補(bǔ)體抑制劑的研究，分離得到了一些高效、低毒的小分子化合物及大分子多糖類天然補(bǔ)體抑制劑[58]。其中，魚腥草總多糖抗補(bǔ)體活性較強(qiáng)[9]，同時(shí)具有顯著的解熱和防治內(nèi)毒素（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷藥效[1011]，臨床開發(fā)應(yīng)用前景良好。

LPS是革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁外層上的特有結(jié)構(gòu)，在革蘭陰性細(xì)菌感染與疾病演化中起到重要作用。LPS帶有極高的熱穩(wěn)定性，與許多大分子蛋白或多糖類在同一數(shù)量級[12]，在提取過程中易被保留于活性總多糖中，不易去除。LPS進(jìn)入人體內(nèi)后可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等嚴(yán)重后果[1314]。因此，如何從中藥提取物中去除LPS成為醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

現(xiàn)常用的LPS清除方法主要有活性炭吸附、微孔濾膜、陰離子交換色譜法、疏水色譜與分子篩法、親和色譜法、吸附法與相分離法[1618]。但吸附法、化學(xué)降解、超濾膜、離子交換色譜等內(nèi)毒素去除方法的選擇性不很高，不適于從一些相對分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu)與內(nèi)毒素十分相近的多糖樣品中去除LPS，用于多糖內(nèi)毒素去除的研究較少[15]。目前內(nèi)毒素去除的主要側(cè)重點(diǎn)已轉(zhuǎn)移到親和介質(zhì)方面，可選用多粘菌素B、組氨酸等作為配基[1920]載于基質(zhì)上制成相應(yīng)的親和介質(zhì)，該法內(nèi)毒素去除率高、方法選擇性好。本實(shí)驗(yàn)通過柱色譜聯(lián)用去除魚腥草總多糖中的LPS，以顯色基質(zhì)比色法定量檢測內(nèi)毒素含量，比較疏水色譜與親和吸附色譜的聯(lián)用及凝膠過濾色譜與親和吸附色譜的聯(lián)用對LPS的清除率，同時(shí)比較LPS清除前后魚腥草總多糖體外補(bǔ)體抑制活性的變化，為中藥活性多糖藥物中LPS的去除提供方法參考。

1 材料

魚腥草購買于上海養(yǎng)和堂藥業(yè)連鎖經(jīng)營有限公司，經(jīng)復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室盧燕副教授鑒定為三白草科Saururaceae 蕺菜屬植物蕺菜H. cordata的干燥地上部分。魚腥草總多糖為采用課題組前期優(yōu)化工藝自制[9]。endprint

Sephacryl S300（GE Healthcare）；AffiPrep Polymyxin Matrix（BioRadLaboratories）；Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare）；LPS對照品（Pharmacia Biotech）；顯色基質(zhì)法鱟試劑盒（廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司）；透析袋（Merck公司，14 000 Da）。氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸及苯酚均為國產(chǎn)AR級，苯酚用前重熏。

電子天平（梅特勒托利多儀器（上海）有限公司），TDL4型低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Well scan MK3型酶標(biāo)儀（Thermo Labsystems公司，芬蘭）；EYELAOSB2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化EYELA公司，日本）精達(dá)水浴恒溫振蕩器；德國Martin Christ RLPHR 12 LD型冷凍干燥器；UV759S 紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HL2S型橫流泵（上海滬西分析儀器廠）；BSZ100型自動部分收集儀（上海滬西分析儀器廠）。

2 方法

2.1 顯色基質(zhì)法[21]定量檢測LPS含量

2.1.1 反應(yīng)試劑的配制 按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解鱟試劑，鱟試劑應(yīng)于溶解后10 min內(nèi)使用。按標(biāo)示量加內(nèi)毒素檢查用水溶解顯色基質(zhì)。按標(biāo)示量加反應(yīng)終止劑HCl配制偶氮化試劑1。按標(biāo)示量加內(nèi)毒素檢查用水溶解偶氮化試劑2，3。

2.1.2 對照品及待測樣品溶液的配制 精密稱取適量對照品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成濃度分別為0.01， 0.025， 0.05， 0.1 EU·mL-1或0.1， 0.25， 0.5， 1.0 EU·mL-1。精密稱取適量待測樣品，加內(nèi)毒素檢查用水配制成待測樣品溶液。

2.1.3 陰性對照品溶液的配制 取100 μL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液及100 μL待測樣品溶液，加入100 μL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，混勻，即為陰性對照品溶液。

2.1.4 內(nèi)毒素含量測定方法 取300 μL對照品，加入鱟試劑100 μL，混勻，根據(jù)其內(nèi)毒素濃度范圍分別于37 ℃溫浴45 min或8 min后，加入顯色基質(zhì)溶液100 μL，混勻，37 ℃溫浴6 min，繼續(xù)加入偶氮化試劑1、偶氮化試劑2和偶氮化試劑3溶液各500 μL，混勻靜置5 min，于545 nm下測定其吸光度。

以吸光度值為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程。

陰性對照品溶液或待測樣品溶液的內(nèi)毒素濃度測量法同上。

2.1.5 供試品干擾實(shí)驗(yàn) 由于要考察試驗(yàn)中各因素對鱟試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品反應(yīng)的影響，故需進(jìn)行供試品干擾實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率?；厥章视?jì)算方式如下：

R=（Cs-Ct）/Cr×100%

Cr：選取靠近內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)的濃度；Cs：配制含有內(nèi)毒素濃度為Cr的供試品溶液，其測量所得的內(nèi)毒素濃度值記為Cs；Ct：未添加內(nèi)毒素的供試品所測得的內(nèi)毒素濃度值。

當(dāng)R在50%～200%時(shí)，認(rèn)為此實(shí)驗(yàn)條件下對供試品溶液不存在干擾。若R超出此范圍則需進(jìn)一步對供試品進(jìn)行稀釋，重復(fù)供試品干擾實(shí)驗(yàn)至R進(jìn)入50%～200%。一般選擇R接近100%時(shí)的供試品濃度進(jìn)行供試品的內(nèi)毒素含量測定。

2.2 凝膠柱色譜法[22]

Sephacryl S300柱（1.5 cm×50 cm），以三蒸水平衡，再以0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液消毒0.5 h，最后以大于3倍體積的三蒸水洗脫、平衡。取20 mg的魚腥草粗多糖，以適量的三蒸水溶解，1萬 r·min-1離心10 min，上清上樣，然后以三蒸水洗脫（0.8 mL·min-1），10 min/管收集流分。檢測每管糖含量（按硫酸苯酚法[9]制備樣品溶液，490 nm波長下測定吸光度值），記錄洗脫圖，根據(jù)檢測結(jié)果合并流分，濃縮、凍干。

2.3 疏水柱色譜法[23]

Penyl Sepharose 6 FF柱（1.5 cm×50 cm），以三蒸水平衡，再以0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液消毒0.5 h，繼續(xù)以大于3倍體積的2 mol·L-1氯化鈉洗脫、平衡。稱取20 mg魚腥草總多糖，以適量的2 mol·L-1氯化鈉溶解，1萬 r·min-1離心10 min，上清上樣，然后以2 mol·L-1氯化鈉洗脫（0.8 mL·min-1），10 min/管收集流分。檢測每管糖含量（硫酸苯酚法，490 nm下測定吸光度值），記錄洗脫圖，根據(jù)檢測結(jié)果合并流分，濃縮、凍干。

2.4 親和吸附色譜柱法[24]

PBS緩沖液的配制：將62 mL母液A（精密稱取71.6 g磷酸二氫鈉，溶于1 000 mL超純水中）與38 mL母液B（精密稱取31.2 g磷酸氫二鈉，溶于1 000 mL超純水中）混合，配制成100 mL的0.2 mol·L-1 PBS（pH 7.0）溶液，用時(shí)將0.2 mol·L-1 PBS按比例適當(dāng)稀釋成0.05 mol·L-1 PBS。

裝AffiPrep Polymyxin柱（1.0 cm×30 cm），以3倍體積的0.1 mol·L-1氫氧化鈉再生，再以10倍柱體積的三蒸水平衡，最后以大于3倍柱體積的0.5 mol·L-1 PBS洗脫、平衡。稱取10 mg經(jīng)凝膠柱色譜或疏水柱色譜純化的魚腥草總多糖，以適量的0.05 mol·L-1 PBS溶解，1萬 r·min-1離心10 min，上清上樣，然后以0.05 mol·L-1 PBS洗脫（0.8 mL·min-1），10 min/管收集流分。檢測每管糖含量（硫酸苯酚法，490 nm下測定吸光度值），記錄洗脫圖，根據(jù)檢測結(jié)果合并流分，濃縮、凍干。endprint

2.5 經(jīng)典途徑抗補(bǔ)體活性測定[5]

采用細(xì)胞溶血法測定抑制補(bǔ)體激活經(jīng)典途徑50%溶血所需最小供試品濃度，即CH50。

3 結(jié)果

3.1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程的建立

當(dāng)LPS濃度范圍為0.01～0.1 EU·mL-1時(shí)，回歸方程為Y=0.872 9X-0.040 9，R2=0.992 8；LPS濃度范圍為0.1～1.0 EU·mL-1時(shí)，回歸方程為Y=6.183 1X-0.002 5，R2=0.995 3。

3.2 魚腥草總多糖中內(nèi)毒素的去除

3.2.1 凝膠過濾色譜法與親和吸附色譜法聯(lián)用 將魚腥草總多糖經(jīng)Sephacryl S300柱洗脫后的洗脫液6～10管合并、透析、凍干，記為H1；將H1樣品再次經(jīng)AffiPrep Polymyxin柱純化，其洗脫液的3～5管合并、透析、凍干，記為H1′， 見圖1。

3.2.2 疏水色譜法與親和吸附色譜法聯(lián)用 將魚腥草總多糖經(jīng)Penyl Sepharose 6 FF柱洗脫后的洗脫液6～13管合并、透析、凍干，記為H2；將H2樣品經(jīng)AffiPrep Polymyxin柱洗脫后的3～5管合并、透析、凍干，記為H2′，見圖2。

3.3 供試品干擾實(shí)驗(yàn)

為避免試驗(yàn)中各因素對鱟試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品反應(yīng)的影響，對供試品進(jìn)行了干擾實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率，并選擇回收率接近100%時(shí)的供試品濃度進(jìn)行供試品的內(nèi)毒素含量測定。魚腥草總多糖的質(zhì)量濃度達(dá)到0.000 79 g·L-1時(shí)，回收率為接近100%；H1的質(zhì)量濃度達(dá)到0.000 78 g·L-1時(shí)，回收率為接近100%；H1′的質(zhì)量濃度達(dá)到0.001 25 g·L-1時(shí)，回收率為接近100%；H2的質(zhì)量濃度達(dá)到0.000 85 g·L-1時(shí)，回收率為接近100%；H2′的質(zhì)量濃度達(dá)到0.001 g·L-1時(shí)，回收率為接近100%，見表1。

3.4 內(nèi)毒素的含量測定與抗補(bǔ)體活性測定

取魚腥草總多糖及3.2項(xiàng)不同程度純化樣品H1， H1′， H2， H2′，根據(jù)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別配置回收率接近100%的各樣品溶液，以2.4項(xiàng)所述方法測定其內(nèi)毒素含量；取上述各樣品按2.5項(xiàng)方法測定抗補(bǔ)體活性CH50。魚腥草總多糖不同方法純化前后的內(nèi)毒素含量及抗補(bǔ)體活性變化結(jié)果見表2。

LPS去除率=（總多糖LPS量-純化片段LPS量）/總多糖LPS量×100%

凝膠過濾柱Sephacryl S300對魚腥草總多糖中的LPS幾無影響，而疏水柱Penyl Sepharose與親和吸附柱AffiPrep Polymyxin對魚腥草總多糖中的LPS都有一定的清除效果，清除率約20%，兩柱聯(lián)用可達(dá)到42.85%的清除率。此外，抗補(bǔ)體活性結(jié)果表明，3種柱色譜純化對魚腥草總多糖的抗補(bǔ)體活性均無明顯影響。

4 討論

LPS于革蘭陰性菌感染過程中起到重要作用，進(jìn)入體內(nèi)易引發(fā)一系列炎癥及微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等嚴(yán)重后果。文獻(xiàn)中已有多種方法用于藥品及生物樣品中LPS的去除，但由于多糖在分子量和結(jié)構(gòu)上與LPS十分相近，適用于從活性多糖中選擇性去除LPS的方法還很少。LPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)主要為多糖和類脂A，類脂A部分都含有多個磷酸酯基，在一定條件下呈電負(fù)性，文獻(xiàn)報(bào)道陰離子交換層析法可去除類人膠原蛋白溶液內(nèi)97.92% 的LPS，且膠原蛋白回收率可達(dá)98.01%[25]，但不適用于帶負(fù)電荷的多糖樣品?；钚蕴糠ㄅc超濾法成功用于去除三七總苷溶液的LPS，去除率可達(dá)81.03%～91%[26]，但該方法同樣對LPS與活性多糖無選擇性?；瘜W(xué)降解法也可用于LPS去除，但強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或氧化劑可能會造成目標(biāo)產(chǎn)物活性喪失，現(xiàn)已很少使用。王雪薇等[15]使用Triton X114萃取法去除腦膜炎球菌莢膜多糖內(nèi)LPS，去除率可達(dá)85%，多糖回收率不低于80%，但適用范圍有待考證。

LPS類脂A 中的胺基葡萄糖基會與某些特定的物質(zhì)基團(tuán)產(chǎn)生特異性親和作用，因此可利用此特性來進(jìn)行親和吸附分離；疏水色譜法則使內(nèi)毒素類脂A部分因疏水性而凝集，無法與層析介質(zhì)結(jié)合而去除內(nèi)毒素；凝膠過濾色譜則通過分子排阻原理清除內(nèi)毒素[27]。本研究選用這3種柱色譜法對魚腥草總多糖進(jìn)行純化，結(jié)果證實(shí)各方法皆不影響多糖樣品的體外抗補(bǔ)體活性，而疏水柱色譜與親和吸附柱色譜的聯(lián)用技術(shù)清除LPS的效果明顯優(yōu)于凝膠過濾柱色譜與親和吸附柱色譜的聯(lián)用。本研究所用魚腥草總多糖樣品的LPS最初含量較低，如果對于實(shí)際生產(chǎn)中LPS混雜較嚴(yán)重的多糖樣品，采用疏水柱色譜與親和吸附柱色譜聯(lián)用的方法純化，很有可能達(dá)到更高的LPS清除率。因此，疏水柱色譜聯(lián)合親和吸附柱色譜用于活性多糖樣品中LPS的去除有良好的應(yīng)用前景，該方法對于不同植物活性多糖中LPS的清除效果也值得進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Wu Y S，Chen Y Y，Ueng P S，et al. Effects of medicinal herbs "Plantago asiatica"， "Houttuynia cordata" and "Mentha haplocalyx" on nonspecific immune responses of cobia（Rachycentron canadum）[J]. Fish Shellfish Immun，2016，58：406.

[2] 許貴軍，李志軍，王琦，等. 魚腥草的抗炎活性成分[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，47（3）：294.

[3] Sekita Y，Murakami K，Yumoto H，et al. Antibacterial and antiinflammatory effects of ethanol extract from Houttuynia cordata poultice[J]. Biosci Biotechnol Biochem，2016，80（6）：1205.endprint

[4] Werner J. Functional mechanisms of temperature regulation，adaptation and fever：complementary system theoretical and experimental evidence[J]. Pharm Thera，1988， 37（1）：1.

[5] Jiang Y，Lu Y，Zhang J J，et al. Anticomplementary constituents of Houttuynia cordata and their targets in complement activation cascade[J]. Nat Prod Res，2014，28（6）：407.

[6] Wu M，Li H，Zhang H，et al. Development of a C3cbased ELISA method for the determination of anticomplementary potency of Bupleurum polysaccharides[J]. Acta Pharmacol Sin，2015，5（4）：316.

[7] 姚士，徐乃玉，陳道峰，等. 藍(lán)萼香茶菜的抗補(bǔ)體活性成分研究[J]. 中國中藥雜志，2013，38（2）：199.

[8] 阮姝楠，盧燕，陳道峰. 廣藿香的抗補(bǔ)體活性成分[J]. 中國中藥雜志，2013，38（13）：2129.

[9] 張娟娟，盧燕，陳道峰. 魚腥草抗補(bǔ)體活性多糖的制備工藝研究[J]. 中國中藥雜志，2012，37（14）：2071.

[10] Xu Y Y，Zhang Y Y，Ou Y Y，et al. Houttuynia cordata Thunb. polysaccharides ameliorates lipopolysaccharideinduced acute lung injury in mice[J]. J Ethnopharmacol，2015，173：81.

[11] 陳道峰，姜韻，盧燕，等. 魚腥草總多糖及其制備方法和在制藥中的用途：中國，ZL201010022880.4[P].20101002.

[12] Wyns H，Plessers E，Backer P D，et al. In vivo porcine lipopolysaccharide inflammation models to study immunomodulation of drugs[J]. Vet Immunol Immunopathol，2015，166（3/4）：58.

[13] 鄧仲端，瞿智玲，楊麗敏. 內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α[J]. 中華病理學(xué)雜志，2003，32（5）：51.

[14] 李榮芳，李曉文，王吉，等. 細(xì)菌脂多糖及其免疫應(yīng)激研究進(jìn)展[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2015（4）：23.

[15] 王雪薇，王建華. Triton X114萃取法去除腦膜炎球菌莢膜多糖中的內(nèi)毒素[J]. 中國生物制品學(xué)雜志，2008，21（5）：438.

[16] 李友，龔慕辛，關(guān)懷，等. 動態(tài)濁度法比較不同方法對內(nèi)毒素的清除效率[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（14）：1175.

[17] 周康，劉康達(dá)，陳梅芳，等. 去除內(nèi)毒素的研究及臨床應(yīng)用（一種新型親和層析膜內(nèi)毒素清除初步應(yīng)用）[J]. 鎮(zhèn)江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998，8（4）：465.

[18] 張順財(cái)，朱無難，周康，等. 多粘菌素B瓊脂糖層析柱清除體液中內(nèi)毒素[J]. 上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，19（1）：9.

[19] 唐守萬，孔亮，歐俊杰，等. 柱親和介質(zhì)用于內(nèi)毒素去除的研究[J]. 分析化學(xué)研究報(bào)告，2006，34（4）：455.

[20] 商振華，周冬梅，郭為，等. 去除內(nèi)毒素的柱親和介質(zhì)與膜親和介質(zhì)的制備與特征[J]. 分析化學(xué)，1997（9）：1010.

[21] 曹春雨，劉婷，郭靜，等. 顯色基質(zhì)法檢測6種中藥注射液內(nèi)毒素含量[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（9）：88.

[22] 李賀，張培因，衛(wèi)紅飛，等. 重組卡介苗熱休克蛋白70的純化及內(nèi)毒素去除的效果評價(jià)[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2010，36（1）：35.

[23] 王貽杰，劉勇，程海，等. 提高內(nèi)毒素去除效果的質(zhì)粒DNA層析純化工藝的優(yōu)化[J]. 中國生物制品學(xué)雜志，2009，22（1）：81.

[24] 鄭麗君，姚勇，何國振. 利用純化工藝去除降纖酶細(xì)菌內(nèi)毒素[J]. 廣東藥學(xué)，1999，9（2）：29.

[25] 朱曉麗，范代娣，馬戎. 陰離子交換法去除類人膠原蛋白中的內(nèi)毒素[J]. 化學(xué)工程，2011， 39（3）：67.

[26] 李存玉，鄭云楓，李紅陽，等. 細(xì)菌內(nèi)毒素定量法研究活性炭與超濾法熱原去除工藝[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29（2）：142.

[27] 邵英光，李京華，魏桂林，等. 內(nèi)毒素的去除政策[J]. 廣州化學(xué)，2003，28（2）：38.

[責(zé)任編輯 丁廣治]endprint