內(nèi)皮細胞提取和UHPLCLTQOrbitrap法分析篩選苦碟子注射液中的活性成分

劉思燚　張紅柱　范菁　尚展鵬　王菲　李瑋婕　劉穎　盧建秋　張加余

[摘要] 應(yīng)用細胞生物色譜法及UHPLCLTQOrbitrap質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速篩選鑒定苦碟子注射液中可能的活性成分。選擇人臍靜脈內(nèi)皮細胞（huma umbilical vein endothelid cells，HUVEC）作為靶細胞，先使苦碟子注射液中的活性成分與靶細胞特異性結(jié)合，經(jīng)細胞靶點脫敏失活后，應(yīng)用LCMS快速鑒定與細胞靶向親和的化學(xué)成分，從而篩選得到苦碟子注射液中可能的活性成分。根據(jù)獲得的精確相對分子質(zhì)量數(shù)據(jù)、保留時間以及結(jié)合苦碟子注射液中的化學(xué)成分進行鑒定歸屬。最終，從細胞裂解液中共篩選鑒定出9個化學(xué)成分，其中包括倍半萜內(nèi)酯類成分4個、有機酸類成分3個以及黃酮類成分2個。應(yīng)用細胞生物色譜法與UHPLCLTQOrbitrap質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速篩選鑒定苦碟子注射液中可能的活性成分，可為苦碟子注射液藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一種快捷、有效的方法學(xué)借鑒。

[關(guān)鍵詞] 苦碟子注射液； 人臍靜脈內(nèi)皮細胞； 細胞生物色譜法； 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)

HUVECs extraction and UHPLC LTQ Orbitrap analysis for screening

vascular endothelium protective components in Kudiezi injection

LIU Siyi1，2， ZHANG Hongzhu3， FAN Jing4， SHANG Zhanpeng1， WANG Fei1，

LI Weijie1， LIU Ying1， LU Jianqiu1*， ZHANG Jiayu1*

（1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2. Center for Drug Evaluation， China Food and Drug Administration， Beijing 100038， China；

3. The First Hospital of Fangshan District， Beijing 102400， China； 4. WuXi AppTec， Shanghai 200131， China）

[Abstract] An effective method has been employed as a tool for screening active components in Kudiezi injection by using cell chromatography and sensitive UHPLCHRMSn method. The potential bioactive components in Kudiezi injection could be selectively bound to the HUVECs target cells first. After cell target desensitization and inactivation， the chemical constituents with cell target affinity were identified by LCMS， so as to screen the possible active components in Kudiezi injection. Based on the accurate mass measurements and the retention time， in total， 9 compounds were tentatively identified and characterized， including 4 sesquiterpene lactones， 3 phenolic acids and 2 flavonoids. HUVECs biospecific extraction coupled with UHPLCLTQOrbitrap analysis could provide a rapid and efficient method for the identification of potential bioactive components in Kudiezi injection， and provide the reference for further research on its effective materials basis.

[Key words] Kudiezi injection； HUVECs； cell chromatography； UHPLC LTQ orbitrap

苦碟子為菊科苦荬菜屬植物抱莖苦荬菜Ixerissonchifolia （Bunge） Hance的全草，具有清熱解毒、排毒止痛等功效[1]?？嗟幼⑸湟簽楸o苦荬菜提取精制而成的靜脈注射液，具有抗血小板凝聚、降血脂、改善微循環(huán)、抗腫瘤等作用，主要用于治療心絞痛、腦梗死、冠心病等病癥，臨床上已廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病[23]。然而，苦碟子注射液藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍有待進一步研究[46]。隨著中藥現(xiàn)代化進程的發(fā)展，明確中藥中的藥效活性物質(zhì)，成為系統(tǒng)研究和梳理的重點[7]。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，藥物可與細胞膜上的受體、通道、酶等特異性結(jié)合或進入細胞內(nèi)部是藥物發(fā)揮作用的一個重要原因[89]。細胞生物色譜法便是基于此理論發(fā)展而來的一種新興生物色譜技術(shù)。其通過藥物可與靶點結(jié)合的原理，將效應(yīng)物質(zhì)進行靶向富集分離，進而應(yīng)用于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選鑒定和作用機理研究[1011]?；诖?，本文應(yīng)用細胞生物色譜法聯(lián)合液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對臨床常用中藥苦碟子注射液中可能的活性成分進行篩選鑒定：先使苦碟子注射液與人臍靜脈內(nèi)皮細胞（huma umbilical vein endothelid cells，HUVEC）進行特異性結(jié)合，通過緩沖液洗掉未被細胞特異性結(jié)合的成分，而后使細胞靶點失活并將被結(jié)合的化學(xué)成分從細胞中釋放，應(yīng)用UHPLCLTQOrbitrap技術(shù)將該解離液按色譜條件進行色譜分析，以期對苦碟子注射液中可能的活性成分進行快速篩選鑒定，以及為藥效成分不明確中藥的藥效物質(zhì)研究提供快捷有效的方法。endprint

1 材料

Accela超高效液相色譜儀與LTQOrbitrap XL質(zhì)譜，配有電噴霧離子源（ESI），Xcalibur 2.1 工作站（美國Thermo Scientific公司）；R200D電子分析天平（1/10萬，德國Sartorius 公司）；Millipore Synergy UV型超純水機（美國Millipore 公司）；KQ250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；8000系列水套二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo scientific公司）；YJCJIFD 雙人單面超凈臺（吳江市凈化設(shè)備總廠）；細胞計數(shù)板（中國化工儀器廠）；細胞培養(yǎng)瓶（美國Corning公司）；CK40F200倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；超聲細胞破碎儀（美國BIORAD公司）。

苦碟子注射液（規(guī)格10 mL/支，批號141209，吉林通化藥業(yè)有限公司）；乙腈和甲醇（質(zhì)譜級，德國Merck公司），甲酸（色譜級，德國Merck公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Corning公司）；胎牛血清（美國Corning公司）；胰蛋白酶（美國HyClone公司）；PBS磷酸緩沖液（美國Corning公司）；青霉素、鏈霉素混合溶液（美國HyClone公司）。

人臍靜脈內(nèi)皮細胞系（HUVEC）（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 10%培養(yǎng)基 取青霉素鏈霉素溶液200 μL，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）5 mL，補足DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified eagle′s medium，DMEM）至50 mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 藥液處理 取苦碟子注射液以0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 細胞培養(yǎng)

細胞復(fù)蘇后，用含200 μL青霉素鏈霉素溶液、10%FBS的DMEM培養(yǎng)基接種于細胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5%CO2空氣飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞每2 d更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)生長至80%時，用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，以1∶2傳代培養(yǎng)。

2.3 苦碟子注射液與HUVECs特異性結(jié)合

①將HUVECs培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，當(dāng)細胞密度達到90%時，倒掉培養(yǎng)液。加入無血清的DMEM溶液，在37 ℃，5%CO2的條件下孵育0.5 h，倒掉無血清的DMEM溶液，加入上述配制好的藥品。②在37 ℃，5%CO2的條件下孵化1 h后，倒掉藥液，用2 mL PBS沖洗細胞7次。取1 mL最后一次洗脫液與乙腈溶液按照1∶10比例混溶，渦旋2 min，1萬r·min-1離心10 min，取上清液備用。③細胞經(jīng)過-80 ℃反復(fù)凍融3次，加10 mL乙醇超聲破碎，將裂解液減壓揮干，用0.5 mL超純水溶解，1萬r·min-1離心10 min，取上清液備用。將最后一次洗脫液和細胞裂解液進行LTQOrbitrap檢測分析。④以同樣的方法用無血清的DMEM溶液代替藥液作空白細胞的裂解液。

2.4 液質(zhì)分析方法的建立

2.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UHPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相0.1%甲酸水溶液（A）乙腈（B）；梯度洗脫（0～10 min，2%～10%B；25～30 min，20%～30%B；40～43 min，45%B；44～47 min，90%B；48～51 min，2%B）；流速0.25 mL·min-1；進樣量3 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件 負離子檢測模式，毛細管溫度350 ℃，輔助氣流速10 arp，鞘氣流速30 arp，毛細管電壓-35 V，噴霧電壓3 kV，管透鏡電壓-110 V。樣品采用傅里葉變換（Fourier transform，F(xiàn)T）進行全掃描（full scan，F(xiàn)S）和母離子列表（parent ion list，PIL）掃描，掃描范圍m/z 100～1 200，隔離寬度2，分辨率為3萬；二級和三級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描（data dependent scan，DDS），選取上一級豐度最高的3個峰進行碰撞誘導(dǎo)解離（collision induced dissociation，CID）碎片掃描，激活時間30 ms，CID激活單位0.25 q，歸一化碰撞能量為35%。

3 結(jié)果

3.1 空白對照組

空白的HUVECs細胞裂解液的總離子色譜圖（TIC）見圖1A，總離子流圖中未檢測到苦碟子注射液中的化學(xué)成分。同時，細胞的第7次洗脫液中未檢測到苦碟子注射液中的化學(xué)成分，見圖1B，說明第7次的洗滌已經(jīng)把物理吸附細胞膜上的成分清洗干凈，在加藥的細胞裂解液中的成分應(yīng)為與細胞膜有相互作用的成分。

3.2 苦碟子注射液化學(xué)成分在HUVECs中的吸收

在樣品吸收后HUVECs細胞裂解液的提取離子流圖（EIC）見圖2A。用提取離子流的方法結(jié)合苦碟子注射液整體化學(xué)成分分析、相關(guān)參考文獻數(shù)據(jù)以及根據(jù)UHPLCESIMS檢測得到細胞裂解液中各化學(xué)成分的精確相對分子質(zhì)量數(shù)據(jù)、保留時間對其中的成分進行鑒定歸屬。最終，從細胞裂解液中共篩選鑒定出9個化學(xué)成分，其中包括機酸類成分3個、倍半萜內(nèi)酯類成分4個以及黃酮類成分2個，見圖2，表1。

在加藥的細胞裂解液中所檢測到的苦碟子注射液中的成分均未在加藥細胞的最后一次洗脫液和空白對照組中檢測到，應(yīng)為細胞有吸收的成分。在HUVECs細胞裂解液中鑒定出奎寧酸、綠原酸、隱綠原酸、異鼠李素O槐糖苷、ixeriside A、木犀草素7OβD葡萄糖醛酸苷、3OβDglucopyranosyl8βhydroxyguauan10（14）ene6，12olide、11，13αdihydroixerin Z及11βhydroxyleucodin11Oβglucopyranoside等9種苦碟子注射液中的化學(xué)成分，這些成分可能為苦碟子注射液中的活性成分。所鑒定化合物結(jié)構(gòu)見圖3。endprint

3.3 與細胞靶向親和的化學(xué)成分相關(guān)藥理研究

引起腦缺血性疾病的重要因素之一是由自由基的增加引起的脂質(zhì)過氧化作用，從而導(dǎo)致細胞和神經(jīng)元損傷。因此，治療腦缺血性疾病不僅需要改善缺血區(qū)血流從而恢復(fù)供氧和需氧平衡，而且還應(yīng)清除毒性氧自由基[12]。Heilmann等[12]通過實驗證明，隱綠原酸具有很強的捕獲超氧陰離子和羥自由基的能力。另有實驗研究發(fā)現(xiàn)雙咖啡?？鼘幩峒捌溲苌锞哂锌寡趸饔茫⒂脛游锬Ｐ妥C實了雙咖啡?？鼘幩峒捌溲苌飳ρ軆?nèi)皮損傷具有抑制作用[13]。

核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factorkappa B，NFκB）是一種重要的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，NFκB在有細胞因子、炎性因子等參與的腦組織缺血、缺氧損傷過程中起著極為重要的作用，通常處于非激活狀態(tài)。當(dāng)急性腦缺血時，血管內(nèi)皮細胞、膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元中NFκB便會被激活[14]。Christina Akesson等[15]通過實驗證明，奎寧酸可顯著抑制脾細胞內(nèi)NFκB的活性并明顯升高損傷脾細胞的存活率。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD 活性的高低間接反映腦缺血腦細胞的損害程度。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPX）是機體內(nèi)廣泛存在的一種含硒抗氧化酶，它可以非酶促反應(yīng)的形式直接與氧自由基結(jié)合，達到清除氧自由基的目的，也可作為GSHPX 催化反應(yīng)中的底物，起到清除氧自由基的作用。丙二醛（malondialdehyde，MDA）是氧自由基對不飽和脂肪酸引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用的終產(chǎn)物，其含量可直接反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，并間接反映氧自由基對細胞的損傷程度。相關(guān)研究表明，木犀草素7OβD葡萄糖醛酸苷能夠降低血清中MDA的含量，增強血清SOD及GSHPX的活力。從而對腦缺血具有一定的保護作用，起到抗腦缺血損傷的作用[16]。關(guān)于異鼠李素O槐糖苷藥理研究的報道不多。

到目前為止，共從苦碟子中分離得到近50個倍半萜內(nèi)酯類化合物[1]，但是對其藥理活性研究較少。陳曦[17]對旋覆花中2種倍半萜內(nèi)酯類成分的抗炎作用及其機制進行研究，結(jié)果表明，實驗中2種倍半萜內(nèi)酯類成分可抑制核因子κB 抑制蛋白（IκB）的磷酸化及降解，繼而抑制了NFκB p65的核轉(zhuǎn)移。故而，推測部分倍半萜內(nèi)酯類化合物可通過抑制NFκB活性從而影響血管損傷的發(fā)展。本實驗從活性追蹤出發(fā)，篩選出ixeriside A、3OβDglucopyranosyl8βhydroxyguauan10（14）ene6，12olide、11，13αdihydroixerin Z、11βhydroxyleucodin11Oβglucopyranoside等候選活性成分，可使后續(xù)研究有目的地對苦碟子注射液中倍半萜內(nèi)酯類成分進行分離，為倍半萜內(nèi)酯類化合物的活性研究提供一個簡便快捷的途徑，從而為倍半萜內(nèi)酯類化合物的進一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

通過查閱相關(guān)文獻，苦碟子注射液可通過多途徑、多靶點對HUVECs發(fā)揮作用，如提高一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性、下調(diào)小窩蛋白1（caveolin1，Cav1）的表達、抑制NFκB信號通路、下調(diào)PKCδ/MARCKS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，從而起到對內(nèi)皮細胞的保護作用[1819]。

4 討論

傳統(tǒng)中藥有效成分的篩選往往是先將中藥混合物的各化學(xué)組分分離提純，再確定其化學(xué)特性，最后才是確定其活性與毒性等，致使中藥研究速度緩慢，耗時耗力且在分離工作上存在較多盲目性。目前，越來越多的研究者從活性追蹤出發(fā)，先確定活性成分，再進行系統(tǒng)分離，這不僅可節(jié)省大量的人力、物力，還可以有目標(biāo)地富集分離需要的化合物，是研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的新思路。細胞生物色譜法便是基于此理論發(fā)展而來的一種新興生物色譜技術(shù)，在中藥化學(xué)成分研究方面具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢，成為中藥及復(fù)方活性成分的分離、篩選、鑒定一體化的強有力的分析工具[2021]。

目前，文獻報道已從苦碟子藥材中分離出黃酮類、有機酸類、倍半萜內(nèi)酯類、腺苷等成分，較為全面地揭示了其含有的固有成分，并對苦碟子注射液中的主要成分進行了含量測定，為本研究的開展奠定了堅實的基礎(chǔ)[47]。同時，有學(xué)者對苦碟子注射液中總黃酮和總有機酸2 類成分進行研究，表明總黃酮及總有機酸化合物對大鼠急性心肌缺血有明顯保護作用。并推測有機酸類化合物及黃酮類化合物是苦碟子注射液治療心腦血管疾病的活性物質(zhì)[2223]。然而對苦碟子注射液中倍半萜內(nèi)酯類成分研究較少，對該注射液中各類活性單體化合物的活性研究也較為匱乏。因此，本研究應(yīng)用細胞生物色譜法聯(lián)合液質(zhì)聯(lián)用色譜儀快速篩選和鑒定苦碟子注射液中可能的活性成分。根據(jù)獲得的精確相對分子質(zhì)量數(shù)據(jù)、保留時間以及結(jié)合苦碟子注射液中的成分鑒定結(jié)果對特異性結(jié)合的化學(xué)成分進行鑒定歸屬。最終，在細胞裂解液中共篩選鑒定出9個苦碟子注射液中的化學(xué)成分，其中包括倍半萜內(nèi)酯類成分4個、有機酸類成分3個及黃酮類成分2個。另外，通過查閱相關(guān)文獻：與細胞靶向親和的化學(xué)成分極有可能具有一定的藥理活性。證實了本文建立的篩選中藥中藥效成分的方法穩(wěn)定可靠，可為苦碟子注射液藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)，同時此方法也可應(yīng)用于其他中藥的藥效成分的篩選，為中藥復(fù)雜體系物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]endprint