菲律賓蛤仔過敏原的性質(zhì)研究

黃姝玲

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350002）

菲律賓蛤仔過敏原的性質(zhì)研究

黃姝玲

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350002）

文章以菲律賓蛤仔為對象，對其過敏原進行性質(zhì)研究。采用丙酮沉淀、等電點沉淀、硫酸銨鹽析及加熱處理等方法純化過敏原；采用SDS-PAGE和Western-blot鑒定該過敏原；通過pH穩(wěn)定性試驗、消化穩(wěn)定性試驗進一步分析其性質(zhì)。結(jié)果顯示菲律賓蛤仔中主要過敏原的分子量為35kDa，耐酸堿性良好，且具有較高的消化穩(wěn)定性，其降解產(chǎn)物仍具有抗原性。研究驗證了菲律賓蛤仔中的主要過敏原是原肌球蛋白（tropomyosin，TM），并對其性質(zhì)進行了分析，為過敏原的安全控制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

菲律賓蛤仔；過敏原；原肌球蛋白；性質(zhì)研究

過敏原是過敏發(fā)生的必要條件，是指能發(fā)生過敏反應(yīng)的抗原，常見的有2000-3000種，醫(yī)學(xué)文獻記載接近2萬種。與其他過敏原相比，食物過敏原的種類更多，成分更復(fù)雜，環(huán)境影響因素也較多。

貝類是最優(yōu)質(zhì)的食用蛋白質(zhì)資源之一，但貝類引起的過敏性現(xiàn)象較為常見，屬于聯(lián)合國糧農(nóng)組織公布的8大類容易引起過敏的食物之一[1-2]。菲律賓蛤仔，是我國四大養(yǎng)殖貝類之一，產(chǎn)量占全世界的90%以上[3]。蛤肉蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量低且含人體所需的必需氨基酸種類齊全，同時，富含脂肪酸、EPA和DHA，具有良好的保健作用[4]，深受消費者的喜愛，但其卻是引發(fā)人過敏反應(yīng)較為常見的食用貝類之一。

研究以菲律賓蛤仔為對象，對其主要過敏原進行分離純化，并通過SDS-PAGE分析其純化效果與分子量大小，隨之進行pH穩(wěn)定性的研究，再通過模擬胃腸液消化實驗分析其消化穩(wěn)定性并在此基礎(chǔ)上采用熱處理方法研究加工工藝對菲律賓蛤仔主要過敏原的影響，同時通過Western-blot來檢測其抗原性。此研究可為開發(fā)低過敏原甚至無過敏性的可食用貝類食品提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮的菲律賓蛤仔購于廈門市集美菜市場，取肉后立即進行實驗；Tris Base：美國Novon；SDS、TEMED（四甲基一烯二銨）、Pancreatin、麗春紅：美國Sigma；丙烯酰胺：美國Bio-Rad；脫脂奶粉：中國內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司；DTT：美國Bio-Rdd；APS、考馬斯亮藍R-250：中國廈門星隆達化學(xué)試劑有限公司；Glycine：美國Promega；β-巰基乙醇：美國Bio-Basic-Inc；Tween-20， C.P.：中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白：美國New Egnland Biolabs。

垂直電泳槽Mini protean：美國Bio-Rad；電轉(zhuǎn)移裝置PS-9：中國Jim-X；冷凍離心機Avanti-25：美國Beckman；凝膠成像儀Bio-profile：法國Vibler Lourmat；凝膠成像儀Alpha：美國Proteinsimple；超純水系統(tǒng)RIOS8：美國Millipore

1.2 實驗方法

1.2.1 菲律賓蛤仔過敏原的純化[5]

取蛤肉100g，加入10倍體積Buffer A（50mmol/L KCl，2mmol/L NaHCO3，10 mmol/L EDTA），搗碎勻漿，4℃離心，取沉淀重復(fù)操作4次，取上清；丙酮攪拌過濾，風(fēng)干；加入10倍體積的Buffer B（20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L KCl，10 mmol/L β-巰基乙醇），4℃離心，得上清；調(diào)節(jié)pH至4.5，充分沉淀，4℃離心，取沉淀，用20mmol/L Tris-HCl（pH7.5）溶解；加入41%～60%(NH4)2SO4，攪拌，靜置，4℃離心，所得沉淀溶于20mmol/L Tris-HCl（pH7.5）并于95℃水浴10min，4℃離心，所得的上清溶液分裝并于-20℃保存。

1.2.2 菲律賓蛤仔過敏原pH穩(wěn)定性的研究

將純化過敏蛋白分別加入不同pH值的緩沖液中（pH值1.0、2.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、13.0），置于4℃冰箱內(nèi)分別反應(yīng)0.5h和6h，之后取出，調(diào)節(jié)pH至7.0，立即進行SDS化，以置于pH7.0緩沖液的樣品為對照。

1.2.3 菲律賓蛤仔過敏原消化穩(wěn)定性的研究

1.2.3.1 體外模擬胃液消化[6]

總反應(yīng)體系為1mL，胃蛋白酶（12 U/mg）與純化過敏蛋白的比例為1:50（w:w）。將含有胃蛋白酶的模擬胃液SGF（50mmol/L NaCl，pH1.2）于37℃預(yù)熱15min，加入純化的過敏蛋白混勻，振蕩反應(yīng)；分別在反應(yīng)0、1、2、5、10、15、30、60 min時取100 μL反應(yīng)液，加入30μL、200mmol/L Na2CO3混勻，置于冰上。對照試驗不加胃蛋白酶。

1.2.3.2 體外模擬腸液消化[7]

總反應(yīng)體系為1mL，胰蛋白酶（390 U/mg）與純化的過敏蛋白比例為1:50（w:w），胰凝乳蛋白酶（360 U/mg）與底物的比例是1:1000（w:w）。將含有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的模擬腸液S I F（50mmol/L KH2PO4，pH7.5）在37℃預(yù)熱15min，加入純化的過敏蛋白混勻，振蕩反應(yīng)；分別在反應(yīng)0、1、5、15、30、60、120、240 min時取100μL反應(yīng)液，95℃加熱5min，置于冰上。對照反應(yīng)不加蛋白酶。

1.2.3.3 二相模擬胃腸液消化實驗

將含有胃蛋白酶的SGF于37℃預(yù)熱15min，加入純化的過敏蛋白混勻，反應(yīng)一定時間后取出100μL反應(yīng)液，加入30μL 200mmol/L Na2CO3，混勻后置于冰上。加入Na2CO3中和終止反應(yīng)并使消化環(huán)境pH值在7.5左右，加入胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶或胰酶，反應(yīng)一定時間后取100μL反應(yīng)液，95℃下加熱5min，置于冰上。其中，0min樣品是將含有蛋白酶的SGF與SIF先加熱失活終止反應(yīng)，再加入底物。對照反應(yīng)不加蛋白酶，其余步驟相同。

1.2.4 SDS-PAGE電泳分析

各階段的純化效果及純化蛋白質(zhì)的分子量用SDS-PAGE分析，以分子量為116.0-14.4kDa的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作為對照，方法是在Leammli等[8]的基礎(chǔ)上略作改動。分離膠和積層膠濃度均為12%，上樣量為8 μL，Marker上樣量為4μL，染色液為考馬斯亮藍R250。

1.2.5 Western-blotting免疫分析

Western-blotting參照Towbin[9]等的方法進行。標(biāo)準(zhǔn)蛋白使用Prestained Marker，染液為麗春紅，用5%脫脂奶粉作封閉液，兔抗鋸緣青蟹TM特異性多克隆抗體作為一抗，羊抗兔多克隆抗體作為二抗，鋸緣青蟹TM作為陽性對照，牛血清蛋白（BSA）作為陰性對照，并采用ECL法進行顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 菲律賓蛤仔過敏原的分離純化結(jié)果與Westernblotting確認

菲律賓蛤仔肉經(jīng)過丙酮沉淀、等電點沉淀、硫酸銨鹽析及加熱處理等方法處理后，分離得到純化的過敏原，進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1所示，該過敏原分子量在35kDa左右。

圖1 菲律賓蛤仔主要過敏原純化電泳圖

據(jù)國內(nèi)外研究表明，蝦和貝類動物中的主要過敏原為原肌球蛋白（Tropomyosin，Tm），是一種種間交叉反應(yīng)明顯的糖蛋白[10-11]。研究以此為據(jù)，將通過電泳分離得到的菲律賓蛤仔蛋白質(zhì)凝膠進行Western-blotting免疫分析，主要以兔抗鋸緣青蟹TM特異性多克隆抗體作為一抗、鋸緣青蟹TM為陽性對照進行分析。經(jīng)ECL顯色，結(jié)果如圖2所示，純化的過敏蛋白（泳道1）和青蟹TM（泳道2）均與抗體發(fā)生陽性反應(yīng)，而BSA（泳道3）未與抗體發(fā)生特異性結(jié)合。因此，可確認菲律賓蛤仔中的主要過敏蛋白為原肌球蛋白。

圖2 純化蛤仔TM的Western-blot分析

2.2 菲律賓蛤仔過敏原pH穩(wěn)定性的SDS-PAGE分析

菲律賓蛤仔原肌球蛋白pH穩(wěn)定性試驗結(jié)果如圖3所示，在不同pH條件下，分別反應(yīng)0.5h（圖3a）與6h（圖3b），TM條帶均未出現(xiàn)消減現(xiàn)象，由此說明菲律賓蛤仔TM在酸堿條件下都具有良好的穩(wěn)定性。

圖3 純化蛤仔過敏蛋白的pH穩(wěn)定性電泳圖

2.3 純化菲律賓蛤仔TM的模擬胃腸液消化試驗分析

2.3.1 純化菲律賓蛤仔TM單相模擬胃腸液消化

純化菲律賓蛤仔TM的體外SGF、SIF消化結(jié)果見圖4。從圖中可知，胃蛋白酶與蛤仔TM比例為1/50進行SGF消化，條帶幾乎沒有發(fā)生變化，消化1h后TM仍然沒有被降解，說明TM對胃蛋白酶有很強的耐降解性（圖4a）；而胰蛋白酶與蛤仔TM以1/100的比例反應(yīng)，1min后TM即開始降解，60min后，TM被完全分解，隨著反應(yīng)時間的延長，在20～30 kDa之間也逐漸產(chǎn)生降解條帶，消化4h后，僅在20 kDa處能觀察到一條微弱的蛋白條帶（圖4b）。同樣的，胰凝乳蛋白酶與TM以比值為1/1000進行實驗，反應(yīng)1min TM即開始降解，隨著反應(yīng)時間的延長，原始TM條帶被分解，并主要在30 kDa左右逐漸產(chǎn)生降解條帶，消化4h后，在30kDa處仍能觀察到一條清晰的蛋白條帶（圖4c）。

圖4 純化蛤仔原肌球蛋白的模擬胃腸液消化

圖5 純化蛤仔原肌球蛋白的模擬二相胃腸液消化

2.3.2 純化菲律賓蛤仔TM二相模擬胃腸液消化

人的消化過程是由口腔開始，經(jīng)食道進入胃，再由小腸進行消化與營養(yǎng)吸收，一般而言，食物在胃部停留30～60min，在小腸停留約8h。過敏原若未經(jīng)過胃蛋白酶消化，可能導(dǎo)致胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用位點不會完全暴露出來。同時，相比于胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶，胰酶更接近于人體內(nèi)小腸中的消化酶。因此，按照人體的消化順序、消化時間分別進行了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶對TM的消化試驗以及胃蛋白酶與胰酶對TM的消化試驗，然后通過SDS-PAGE分析，進行對比。如圖5所示，菲律賓蛤仔TM對胃蛋白酶有較強的穩(wěn)定性，反應(yīng)60 min完全沒有被降解（圖5a，圖5c）；相比之下，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶反應(yīng)15 min，菲律賓蛤仔TM即開始降解，但在240 min后蛋白原始條帶仍然未完全降解（圖5b）；胰酶對菲律賓蛤仔TM的消解效果與之相似，反應(yīng)15 min出現(xiàn)降解條帶，但在240 min后原始蛋白條帶被完全降解(圖5d)。推測可能是由于胰酶中含有更多種類的消化酶從而促使了菲律賓蛤仔TM的降解?？傮w而言，2組實驗對TM的降解效果差異不明顯。

圖6 免疫印跡檢測模擬胃腸液對TM的消化情況

2.4 純化菲律賓蛤仔TM模擬胃腸液消化Westernblotting分析

為了確認蛤仔TM經(jīng)消化降解后其抗原性的變化情況，采用兔抗青蟹TM特異性多克隆抗體以Western-blot鑒定TM的降解過程及其產(chǎn)物。圖6a顯示，胃蛋白酶對原肌球蛋白的降解作用微弱，反應(yīng)60min后，主條帶仍然未被降解，其抗原性也沒有發(fā)生明顯的變化。在模擬腸液消化實驗中，以胰蛋白酶作為消化酶時，反應(yīng)5min即有降解產(chǎn)物生成，并在30kDa和23kDa處產(chǎn)生降解條帶。隨著反應(yīng)時間的延長，這些降解條帶被進一步分解（圖6b），這些降解條帶都存在一定的抗原性。胰凝乳蛋白酶分解TM的結(jié)果與胰蛋白酶相似，但胰凝乳蛋白酶作用后主要在28 kDa處產(chǎn)生1條帶（圖6c）。不同的酶作用TM產(chǎn)生的降解條帶不同，這與消化酶對底物的作用位點不同有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

雖然已有研究證實原肌球蛋白是貝類動物的主要過敏原，但是不能排除不同物種間存在差異的可能性。文章以菲律賓蛤仔為研究對象，通過分離得到純化的過敏原，采用免疫印跡法，以兔抗青蟹TM特異性多克隆抗體對其進行分析，結(jié)果顯示該致敏蛋白分子量為35kDa，同國內(nèi)報道的原肌球蛋白分子量相近[12]，并且與蟹類TM抗體具有較強的交叉反應(yīng)，故確認菲律賓蛤仔中的主要過敏蛋白為原肌球蛋白TM。

過敏原通常具有良好的穩(wěn)定性，文章對TM的pH穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性進行了研究、分析。從pH穩(wěn)定性試驗的結(jié)果可以看出，TM在不同酸堿環(huán)境中均能保持良好的穩(wěn)定性，由此可知，當(dāng)人體攝入TM后，胃酸并不能使TM降解；研究模擬人體消化酶對菲律賓蛤仔過敏蛋白的分解作用，結(jié)果表明TM對胃蛋白酶具有很強的耐消化性，酶/蛋白比值為1/50（w/w）反應(yīng)60min后，TM仍然沒有被降解；胰蛋白酶與蛤仔TM反應(yīng)，1min后TM即出現(xiàn)微弱的降解，60min后原始蛋白條帶已被完全降解，在分子量為23、30 kDa處出現(xiàn)降解產(chǎn)物條帶。同樣的，TM與胰凝乳蛋白酶反應(yīng)1min開始出現(xiàn)降解，并在28kDa左右出現(xiàn)降解條帶，隨后繼續(xù)消化1h，僅剩下小分子量的降解產(chǎn)物，TM原始蛋白條帶完全被分解。該結(jié)果與其他學(xué)者對食品過敏原的消化特征的研究結(jié)果相似[13，14]。菲律賓蛤仔TM被3種蛋白酶降解過程中，產(chǎn)生不同分子量的降解條帶，主要是因為不同消化酶對肽段的特異性分解位點不同所致[15]。如胰蛋白酶特異選擇Lys和Arg殘基的P1位置，而胰凝乳蛋白酶則優(yōu)先選擇靠芳香族氨基酸（Tyr，Trp，Phe）和Leu的P1位置。但文章未探討酶解過程中過敏蛋白的結(jié)構(gòu)變化，尚待進一步深入研究分析。

[1]Moneret-Vautrin DA. Epidemiologiede Ialler gieal imentaire etpreva-lencere lativede stroph allergenes[J].Cah Nutr Diet，2001，36(4): 247-252.

[2]Schafer T. Epidemiology of food allergy/food intolerance in adults: associations with other manifestations ofatopy[J].Allergy，2001，56(12): 1172-1179.

[3]張國范，閆喜武. 菲律賓蛤仔養(yǎng)殖學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社，2010:11-12.

[4]吳云霞，梁健，閆喜武，等. 菲律賓蛤仔營養(yǎng)成分分析與評價[J]. 營養(yǎng)學(xué)報，2012，34(4): 409-413.

[5]Huang MC，Ochiai Y. Fish fast skeletal muscle tropomyosins show species-specific thermal stability[J]. Comp Biochem Physiol，2005，141(4): 461-471.

[6]Thomas K，Aalbers M，Bannon GA，et al. A multilaboratory evaluation of a common in vitro pepsin digestion assay protocolused in assess ing the safety of novel proteins[J]. Regul Toxico Pharmacol，2004，39(2): 87- 98.

[7]Astwood JD，Leach JN，F(xiàn)uchs RL. Stability of food allergens to digestion in vitro[J]. Nat Biotechnol，1996（14）:1269-1 273.

[8]Leammli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Natural，1970，227(15):680- 685.

[9]Towbin H，Staehelin T，Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocelluLose sheets:Procedure and some applications[J]. PNAS，1979，76(9): 4350-4354.

[10]Dual CB，Slattery M，Reese G，et al. Identification of the major brown shrimp (Penaeus aztecus) as the muscle protein tropomyosin[J]. Int Arch Allergy Immunol，1994，105(1): 49-55.

[11]Leung PS，Chu KH. cDNA cloning and molecular identification of the major oyster allergen from the Pacific oyster Crassostrea gigas[J]. Clin Exp Allergy，2001，31(8): 1287-1294.

[12]呂良濤，藺海鑫，高卿，等. 菲律賓蛤仔過敏原原肌球蛋白的鑒定與分子克隆[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2015，6(11): 4538-4544.

[13]Fu TJ，Abbott UR，Hatzos C. Digestibility of food allergens and nonallergenic proteins in simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid-A comparative study[J]. Food Chem，2002，50: 7154-7160.

[14]Shimakura K，Tonomura Y，Hamada Y，et al. Allergenicity of crustacean extractives and its reduction by protease digestion[J]. Food Chem，2005，91: 247-253.

[15]劉光明，黃園園，蔡秋鳳，等. 淡水魚類主要過敏原的模擬腸胃液消化[J]. 水產(chǎn)學(xué)報， 2010，34(7): 1136-1142.

TS254.7

：A

：1007-550X（2017）04-0038-06

10.3969/j.issn.1007-550X.2017.04.003

2017-02-13

黃姝玲（1989-），女，福州永泰人，助理工程師，碩士，主要研究方向：微生物學(xué)。