HPLC測定腦康沖劑中羥基紅花黃色素A的含量

郝玉英，菅艷艷

1.包頭市中心醫(yī)院藥學(xué)處，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭市食品藥品檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古包頭 014030

HPLC測定腦康沖劑中羥基紅花黃色素A的含量

郝玉英1，菅艷艷2

1.包頭市中心醫(yī)院藥學(xué)處，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭市食品藥品檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古包頭 014030

目的 建立HPLC測定腦康沖劑中羥基紅花黃色素A含量的方法。 方法 選擇該院藥房2014年3月—2016年3月期間收集的腦康沖劑作為該次研究的調(diào)查對象，而后予以HPLC進行測定，填充劑以及流動相分別為十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱和乙腈-0.7%磷酸溶液，檢測波長為403.0 nm，最后對檢測結(jié)果進行總結(jié)。 結(jié)果 羥基紅花黃色素A在0.075～1.869 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=7 110.467+3 689 880X r2=1。結(jié)論 該HPLC測定方法具有較強的專屬性和重現(xiàn)性，對羥基紅花黃色素A無任何影響，可用于腦康沖劑的質(zhì)量控制。

腦康沖劑；羥基紅花黃色素A；HPLC

腦康沖劑為該院在臨床使用五年以上的經(jīng)驗方，具有悠久的歷史與可靠的療效，處方由黃芪、當歸、川芎、紅花等12味中藥組成，它的功效是活血化瘀、散瘀通經(jīng)絡(luò)，用于腦出血、腦外傷、腦梗死患者恢復(fù)期使用[1-3]。據(jù)相關(guān)資料顯示，紅花的主要構(gòu)成為：黃酮類化合物、色素以及脂肪酸，同時還包括揮發(fā)油和多炔等。近年來，醫(yī)療技術(shù)日新月異的發(fā)展，HPLC測定法應(yīng)運而生，并取得了臨床的高度認可廣泛應(yīng)用[4]。與此同時，該檢測方測定羥基紅花黃色素A具有多種優(yōu)勢，如具有較高的專屬性和重現(xiàn)性。鑒于此，該次實驗為探究該檢測方法的臨床價值，選擇該院藥房2014年3月—2016年3月期間收集的腦康沖劑進行分析，現(xiàn)將研究過程和結(jié)果進行如下匯報。

1 使用儀器和試劑

使用儀器：該次研究中的檢測器型號為SPD-10Avp型，泵型號為C—10ATvp。同時配合電子天平和紫外分光光度儀。使用試劑：該次研究中的使用試劑為羥基紅花黃色素 A，包頭市中心醫(yī)院提供腦康沖劑膠囊 （批號：20120605、20130910、20140102）；準備自制的模擬樣品、高純度的水、色譜純以及分析純[5]。

2 研究方法

2.1 色譜參數(shù)

該次研究中將十八烷基硅烷鍵合硅膠作為色譜柱填充劑，phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）為該儀器的型號。

2.2 流動相

依據(jù)《中國藥典》選擇適宜的流動相，即：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液，同時選擇適宜的測定方法。值得注意的是，該次研究所提供的基紅花黃色素A分具有較高的理論板數(shù)和分離度，保留時間良好，因此符合檢測流動相的相關(guān)標準。

2.3 柱溫：室溫

選擇適宜的檢測波長：檢測波長的選擇：選取羥基紅花黃色素A，而后對其精密稱取，而后選擇甲醇，濃度為25%，將其制成溶液，確保1 mL含40 μg，波長掃描范圍需合理選擇，正常參數(shù)為300～500 nm之間。最后依據(jù)《中國藥典》對羥基紅花黃色素A的測定方法進行規(guī)范，檢測波長參數(shù)為404 nm，結(jié)果表明，檢測波長參數(shù)404 nm時，羥基紅花黃色素A吸收顯著[6-8]。明確理論板數(shù)：據(jù)大量研究表明，理論板數(shù)超過3 500，羥基紅花黃色素A具有較高的分離度，但是，由于理論版數(shù)的不同，使用的色譜柱也存在差異性，因此，在明確理論板數(shù)時，羥基紅花黃色素A峰不得在2 500以下。

2.4 溶劑的提取以及結(jié)果分析

選擇適宜的溶液：通過查閱《中國藥典》可知，溶劑的提取選擇甲醇，且濃度為25%?？疾焯崛⌒剩禾崛∫哼x擇濃度為25%的甲醇，使用劑量為50 mL，在超聲引導(dǎo)下進行提取，功率參數(shù)和頻率參數(shù)分別為300 W、50 kHz。要想被測成分完全提出得以保證，需選擇合理的考察時間，超聲提取時間為30、40 min以及50 min時，最后分析提取效率對羥基紅花黃色素A含量的影響。結(jié)果顯示：羥基紅花黃色素A的含量在超聲提取30、40 min以及50 min時，含量未發(fā)生任何變化，因此臨床選擇40 min作為提取時間。提取溶劑加入量結(jié)果分析：提取溶劑為25 mL時，會降低樣品羥基紅花黃色素A的含量，而提取溶劑為50、75 mL時，樣品羥基紅花黃色素A含量雷同，未發(fā)生變化，且提取效果顯著，因此，50 mL作為提取溶劑的加入量。

2.5 專屬性

選擇適量羥基紅花黃色素A作為對照品溶液，稱定時需確保精密，而后加入濃度為25%的甲醇，最后制成的樣品確保每1 mL含30 ug溶液。選取2 g該品的粉末制備稱供試品，待精密稱量后在塞錐形瓶中放置，與此同時，將50 mL甲醇加入其中，濃度為25%，對其整體重量進行稱定。待上述操作完成后進行超聲處理，功率參數(shù)和頻率參數(shù)分別為300 W、50 kHz，時間為40 min，在低溫度下保存，而后再次對重量進行稱定，減失的重量會用甲醇進行補足，最后進行搖勻和過濾[9-11]。陰性對照供試品選擇雷同制備工藝進行，陰性對照溶液方法以供試品的方法為主，在以上敘述的色譜條件下，對對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照溶液進行選取，劑量均為20 uL，在液相色譜儀中將上述3種溶液分別注入，檢測結(jié)果顯示：陰性對照組色譜圖結(jié)果同對照品和供試品進行比對，在相應(yīng)的保留時間處色譜峰均未出現(xiàn)，由上述結(jié)果可知，陰性對照組溶液不會影響羥基紅花黃色素A。

2.6 線性關(guān)系分析

選擇適宜的羥基紅花黃色素A對照品，待完成精密稱量后，將25%甲醇加入其中，確保制成的樣品每1 mL含0.3 mg的溶液，將其充當對照品溶液；而后對上述制成的溶液進行精密量取，劑量分別為0.6 mg、1.2、2.4、3、6 mL以及15mL，待量取完成后在25mL的量瓶中分別置入，隨后將甲醇加入其中，直至達到刻度線為止，充分搖勻。在色譜儀中加入精密吸取10 μL溶液，而后對其進行檢測，回歸分析峰面積和濃度的相關(guān)性，檢測結(jié)果表明：在0.075～1.869 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y= 7 110.467+3 689 880X r2=1。除此之外，另選同一份供試品溶液，測定時間分別為0、2、6、10 h以及12 h。結(jié)果表明：12 h內(nèi)，羥基紅花黃色素A的峰面積積分值穩(wěn)定性較好。

2.7 精密度及準確度

選取批號相同的樣品進行重復(fù)性試驗，研細，取6份，供試品的選取劑量為10 μL，而后在液相色譜儀中注入，對每份樣品的含量進行測定，計算方法依據(jù)外標法。精密稱量供試品9份，劑量均為1 g，在9個具塞錐形瓶中分別置入，隨后均分3組，每組樣品各3份，在此期間，將羥基紅花黃色素A對照品溶液加入其中，濃度需確保0.311 5 mg/mL，使用劑量分別為2、3 mL以及4 mL，與此同，將48、47、46 mL的甲醇溶液也加入其中，測定每份含量，計算回收率。

3 測定樣品

對3批樣品的含量進行測量，與此同時，對同批的模擬樣品進行測量。前者的批號分別為 20120605、20130 910、20140102，后者的批號為20150301。

4 結(jié)果

羥基紅花黃色素A對照品溶液利用流動相進行配置，而后使用紫外可見分光光度計進行吸光度掃描，波長參數(shù)在200～50 nm之間，結(jié)果顯示：在226 nm處和402 cm處可見兩個吸收峰，如圖1、圖2。由此可見，檢測波長參數(shù)為226 nm時，雜質(zhì)干擾相對嚴重，檢測波長參數(shù)為402 nm時，雜質(zhì)峰相對較少，無任何干擾，具有較高的靈敏度，因此檢測波長選擇402 nm。

選取羥基紅花黃色素A，而后對上述制成的溶液進行精密量取，劑量分別為 0.10、0.25、0.50、1.00 mL以及2.00 mL，待量取完成后在5 mL的量瓶中分別置入，對其進行分離和檢測。結(jié)果顯示：羥基紅花黃色素A在0.075～1.869 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=7 110.467+ 3 689 880X r2=1。

圖1 可見吸收廣譜

圖2 對照品與樣品的色譜圖

5 結(jié)論

腦康沖劑的主要成分為紅花、枸杞、枳實，還包括當歸以及川芎等，該藥物可以起到填精益髓和補腎養(yǎng)血的作用，在老年癡呆、血管癡呆、小兒腦癱以及腦血管病中較為適用。紅花為菊科紅花屬植物紅花的干燥花，屬于新興的油料作物，不僅可以活血痛經(jīng)，同時可以祛瘀止痛。與此用時紅花可以將心腦血管病的血液流變參數(shù)予以改善，心肌可以得到保護，同時將患者的心功能有效改善。除此之外，紅花可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外鈣離子，對血管內(nèi)皮細胞的凋亡和壞死進行預(yù)防。近年來，種植面積的不斷增加，產(chǎn)量也逐年提升，在天然食用色素和保健食品中大量紅花被應(yīng)用，據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)結(jié)果顯示，紅花可以通過清除氧自由基而減輕實驗性腦缺血再灌注損傷，且其具有抗凝血、血栓形成的作用，與此同時，紅花具有降血壓和降血脂的作用。尤其在腦血管疾病方面具有顯著的效果。近期研究表明[11]，紅花的主要成分為羥基紅花黃色素A，且測定方法主要為兩種，一種為分光光度法，另一種為感官評定法，但是對其功效成分含量的測定研究少之又少。有學(xué)者利用高效液相色譜法對紅花中黃色素的含量進行測定，結(jié)果表明，3個產(chǎn)地紅花中的羥基紅花黃色素A和紅花黃色素A占黃色素總量的88%。從該次研究結(jié)果結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，羥基紅花黃色素A在0.075～1.869 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=7 110.467+3 689 880X r2=1，而在Tian-xue等專家[12]的研究中，羥基紅花黃色素A在0.278～1.528 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，對應(yīng)回歸方程為：Y=4 220 000X-52 200，r=0.999 6，這一研究結(jié)果與該次研究結(jié)果基本一致。與此同時，紅花黃色素A藥理活性較強，其中含量最高的為羥基紅花黃色素。

通過HPLC測定可知，該方法具有較強的專屬性和重現(xiàn)性，對羥基紅花黃色素A無任何影響，可用于腦康沖劑的質(zhì)量控制。

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[1]周軍，張蕾，王杰.HPLC-DAD法測定腦血栓片中苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸、丹酚酸B和丹參酮ⅡA[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2015（3）：34-38.

[2]李耿,王秀麗,劉金欣,等.UPLC法同時測定樂脈顆粒中11種成分[J].中草藥,2013,44(11)：1435-1439.

[3]厲瑤,郭正泰,龔行楚,等.丹參紅花混煎液中丹參素、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸B的HPLC測定方法[J].中國中藥雜志,2013,38(11)：1653-1656.

[4]王亞洲.HPLC法同時測定蝎龍酒中芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸[J].中成藥,2012,34(10)：1925-1928.

[5]宋永貴,蘇丹,耿璐璐,等.HPLC-DAD同時測定通達顆粒中4種活性成分的含量[J].中成藥,2010,32(7)：1137-1140.

[6]劉征輝,葉挺祥,趙琳琳,等.HPLC多波長法同時測定血府逐瘀顆粒中多指標成分的含量[J].中國中藥雜志,2010,35 (16)：2157-2160.

[7]王辰雯,彭代銀.超高壓液相色譜法同時測定桃紅四物湯中四種主要有效成分的含量[J].安徽醫(yī)藥,2013,17(7)：1110-1112.

[8]閆高穎,董娟妮,楊洋,等.HPLC法同時測定心腦康膠囊中6種成分[J].中成藥,2013,35(8)：1672-1675.

[9]莊惠清,柯鵬頡,劉智煒.HPLC法測定心腦康膠囊中葛根素和芍藥苷的含量[J].福建醫(yī)藥雜志,2012,34(3)：73-75.

[10]N,Alépée J,Barroso A,De Smedt B,et al.Use of HPLC/ UPLC-spectrophotometry for detection of formazan in in vitro Reconstructed human Tissue(RhT)-based test methods employing the MTT-reduction assay to expand their applicability to strongly coloured test chemicals[J].Toxicology in vitro：an international journal published in association with BIBRA,2015,29(4)：741-761.

[11]Lukas Reitzle,Barbara Maier,Silvia Stojanov,et al.Quantification of mevalonate-5-phosphate using UPLC-MS/MS for determination of mevalonate kinase activity[J].Clinical biochemistry,2015,48(12)：781-787.

[12]Tian-xue Li,Lang Hu,Meng-meng Zhang,et al.A sensitive UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of eleven bioactive components of Tong-Xie-Yao-Fang decoction in rat biological matrices[J].Journal of chromatography.B,Analytical technologies in the biomedical and life sciences,2014（944）：90-100.

HPLC in Measuring the Content of Hydroxysafflor Yellow A in the Naokang Instant Granules

HAO Yu-ying1,JIAN Yan-yan2
1.Department of Pharmacy,Baotou Central Hospital,Baotou,Inner Mongolia,014040 China；2.Baotou Food and Drug Inspection and Testing Center,Baotou,Inner Mongolia,014030 China

Objective To establish a method of HPLC in measuring the content of hydroxysafflor yellow A in the naokang instant granules.Methods The naokang instant granules collected in our hospital from March 2014 to March 2016 were selected and measured by the HPLC,and the filler and mobile phase were respectively octadecylsilane chemically bonded silica and acetonitrile-0.7%phosphoric acid solution and the detection wavelength was 403.0 nm,and finally the test results were summarized.Results The liner relationship of hydroxysafflor yellow A in the 0.075～1.869 μg was good,and the regression equation was Y=7 110.467+3 689 880X r2=1. Conclusion The specificity and reproducibility of the HPLC measurement method are strong,which has no effect on the hydroxysafflor yellow A and it can be used as the quality control of naokang instant granules.

Naokang instant granules;Hydroxysafflor yellow A;HPLC

R927

A doi10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.02.13

2017-03-10；

2017-03-25

郝玉英（1971-），女，內(nèi)蒙古包頭人，本科，副主任藥師，研究方向：醫(yī)院制劑的研發(fā)。