產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選與鑒定

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(北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心;北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京 100048)

產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選與鑒定

劉英麗,丁立,謝良需,王靜*,張慧娟

(北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心;北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京 100048)

利用溶鈣圈法及牛津杯雙層平板法,從歐洲薩拉米香腸、新疆奶酪、自發(fā)酵泡菜和韓式辣白菜中分離篩選產(chǎn)細菌素的乳酸菌,通過形態(tài)學、生理生化鑒定、16S rDNA將菌株鑒定到種,并對其細菌素基因進行克隆,確定細菌素種類。結(jié)果表明:從分離純化到的206株乳酸菌中篩選出抑菌效果較好的菌株SA102、SA104、N105、N107、N108,在排除酸、過氧化氫等干擾因素后,菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對蛋白酶敏感,初步判定起抑菌作用的是細菌素。16S rDNA結(jié)果表明這5株產(chǎn)細菌素的菌株2株為乳酸乳桿菌,3株為植物乳桿菌,通過設(shè)計引物對菌株細菌素基因進行PCR快速篩選,結(jié)果表明菌株N107、N108含有IIb類細菌素PlantaricinKJ基因編碼序列,生理生化指標測試證實這些產(chǎn)細菌素菌株不產(chǎn)氣、不產(chǎn)氨、不產(chǎn)硫化氫、不產(chǎn)粘、不產(chǎn)色素,具有較好的生物安全性。最后對發(fā)酵液中細菌素粗提物的酸堿穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性進行了初步探究,以期為將來細菌素的進一步實際應(yīng)用提供一定的理論借鑒。

乳酸菌,細菌素,基因克隆

乳酸菌細菌素由乳酸菌代謝產(chǎn)生的一類具有抗菌作用的天然蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)[1]。乳酸菌產(chǎn)生的細菌素能被人體內(nèi)的蛋白酶降解,不易在體內(nèi)蓄積,同時具有較好的穩(wěn)定性,適合工業(yè)化生產(chǎn)[2],因而在開發(fā)食品天然防腐劑領(lǐng)域有廣闊的發(fā)展前景。根據(jù)細菌素的化學結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性,可將細菌素分為羊毛硫類抗生素、非羊毛硫抗生素類小分子熱穩(wěn)定肽、大分子熱不穩(wěn)定肽以及復(fù)合型細菌素等4 類[3],其中Ⅰ類細菌素如乳酸鏈球菌素(Nisin)的研究較為深入,已在乳制品、啤酒等食品生產(chǎn)中開展應(yīng)用[4-5],具有較高的有效性和安全性。Ⅱ類細菌素又可劃分為3類:Ⅱa類,具有N-末端 YGNGVXC保守序列的類片球菌素樣細菌素;Ⅱb類,需兩個肽共同作用的雙肽細菌素;Ⅱc類,其他未經(jīng)修飾的抗菌活性肽。Ⅱa類細菌素理化性質(zhì)穩(wěn)定,具有較強抗李斯特菌活性,有望進一步開發(fā)應(yīng)用于工業(yè)用途。劉國榮等對分離自我國內(nèi)蒙古傳統(tǒng)干酪的屎腸球菌(Enterococcusfaecium)LM-2所產(chǎn)Ⅱa類細菌素進行研究,發(fā)現(xiàn)其具有較好的食品加工耐受特性[6],此外,使用添加量為320 AU·g-1的乳酸菌細菌素(enterocinLM-2)并結(jié)合600 MPa 5 min超高壓對低溫切片火腿進行處理,發(fā)現(xiàn)其具有較好的防腐保鮮效果[7]。但目前關(guān)于Ⅱb類細菌素的研究較少,其抑菌機理及靶細胞識別機制尚未十分明確,因此,獲得產(chǎn)此類細菌素的天然菌株對于研究其作用機理及調(diào)控機制具有重要意義[8-9]。

本研究從來自不同地區(qū)的多類樣品中進行乳酸菌分離篩選,通過設(shè)計引物利用生物信息學的方法進行預(yù)測和尋找產(chǎn)Ⅱb類細菌素的菌株,并進行了菌株生物學特性、發(fā)酵條件的初步探索,為闡明該類細菌素的作用機理及拓寬其在食品防腐劑領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

國外優(yōu)質(zhì)薩拉米香腸(產(chǎn)自意大利)、手工自制奶酪(產(chǎn)自新疆)、自發(fā)酵泡菜(產(chǎn)自北京延慶)和韓式辣白菜(產(chǎn)自韓國)等發(fā)酵食品,貯藏于4 ℃冰箱備用。

抑菌實驗指示菌大腸桿菌(E.coli)ATCC25922、金黃色葡萄球菌(S.aureus)1.801均為本實驗室保存。

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,牛肉粉5.0 g,酵母粉4.0 g,葡萄糖20.0 g,吐溫80 1.0 mL,磷酸氫二鉀2.0 g,乙酸鈉5.0 g,檸檬酸三銨2.0 g,硫酸鎂0.2 g,硫酸錳0.05 g,配制1 L,固體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂粉,0.5%碳酸鈣。

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母提取粉5 g,氯化鈉10 g,配制1 L,固體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂粉。

細菌基因DNA提取試劑盒 購于天根試劑有限公司,PCR反應(yīng)用聚合酶 購于北京寶如億生物有限公司;過氧化氫酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶 購于北京華威銳科化工有限公司;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水碳酸鈣、硫酸鎂、硫酸錳、乙酸鈉、亞硝酸鈉、蔗糖、氯化鈉、水楊酸、中性紅、溴酚藍、二氧化錳、檸檬酸三鈉、鄰苯二甲醛、磷酸氫二鉀、甘氨酸等分析純試劑 購于北京國藥集團。

奈氏試劑的配制:將10 g碘化汞和7 g碘化鉀溶于10 mL水中,另將24.4 g氫氧化鉀溶于內(nèi)有70 mL水的100 mL容量瓶中,并冷卻至室溫。將上述碘化汞和碘化鉀溶液慢慢注入容量瓶中,邊加邊搖動。加水至刻度,搖勻,放置2 d后使用。試劑應(yīng)保存在棕色玻璃瓶中,置暗處。

生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司;高壓滅菌鍋 上海云泰儀器儀表有限公司;超凈工作臺 上海蘇凈實業(yè)有限公司;微型旋轉(zhuǎn)離心機 北京科博賽爾生物科技公司;高速離心機HITACH;凝膠成像系統(tǒng)美國UVP公司。

1.2實驗方法

1.2.1 產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選 初篩:在無菌條件下分別取樣品表層和5 mm以下的內(nèi)部部分,切碎,用組織搗碎機絞碎,稱取25 g加入到225 mL的無菌生理鹽水中,振蕩均勻,稀釋涂布到MRS固體培養(yǎng)基上,37 ℃ 培養(yǎng)48 h[10]。挑取具有溶鈣圈形狀不同的單個菌落進行革蘭氏染色,因為乳酸菌為革蘭氏陽性菌,故選取革蘭氏陽性菌,分別接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中,37 ℃ 過夜培養(yǎng),將篩選得到的乳酸菌編號后于MRS固體培養(yǎng)基上劃線純化,挑取單菌落進行液體培養(yǎng),并用15%甘油保存待用。

復(fù)篩:將分離純化的乳酸菌株接種于裝有5 mL MRS液體培養(yǎng)基的離心管中30 ℃發(fā)酵72 h,發(fā)酵液經(jīng)10000 r/min,4 ℃條件下離心10 min取上清液,采用牛津杯雙層平板法測定上清液的抑菌活性。培養(yǎng)皿于4 ℃冰箱中擴散5 h,37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈,十字測量法測量抑菌圈直徑,未接種的培養(yǎng)基上清液為空白對照,每個處理重復(fù)3次。

1.2.2 產(chǎn)細菌素菌株的確定 乳酸菌在生長過程中產(chǎn)生的有機酸、過氧化氫等物質(zhì)也具有一定的抑菌能力,因此需首先排除這些因素的干擾。此外,細菌素做為天然蛋白質(zhì)或多肽類物,可通過蛋白酶敏感性實驗進一步驗證產(chǎn)生抑菌作用的物質(zhì)是否為細菌素[11]。

有機酸排除實驗:除乳酸菌素外,酸性物質(zhì)也可使發(fā)酵上清液對指示菌產(chǎn)生抑制作用,如乳酸等有機酸。為排除酸及酸性產(chǎn)物的干擾,通過用乳酸及2 mol/L NaOH溶液調(diào)配不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)的MRS液體培養(yǎng)基進行抑菌實驗,記錄不同pH下的抑菌圈直徑,找到酸作用的臨界pH。將菌液以10000 r/min離心10 min,取上清液調(diào)至臨界pH,并以臨界pH的MRS作為對照,以金黃色葡萄球菌(G+)和大腸桿菌(G-)分別進行抑菌實驗,記錄抑菌圈直徑,通過比較兩者抑菌圈大小排除有機酸抑菌效果,實驗重復(fù)三次。

過氧化氫排除實驗:將過氧化氫酶溶解在50 mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.0)中配成母液,將母液加入到發(fā)酵液中使過氧化氫酶的終濃度為5 mg/mL,在37 ℃水浴中溫育2 h后取出,檢測過氧化氫酶處理后發(fā)酵液的抑菌活性[12]。抑菌圈實驗重復(fù)三次取平均值。

蛋白酶敏感性實驗:將木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶分別溶解在3 mmol/L pH7.5的磷酸緩沖液中配成母液,分別加入到被檢測菌發(fā)酵離心上清液中,使它們的終濃度為0.5 mg/mL,在37 ℃水浴中溫育2 h后取出,將pH調(diào)到4.5,以加入等量緩沖液的發(fā)酵上清液原液為對照,用牛津杯法檢測抑菌活性,檢測木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對乳酸菌發(fā)酵上清液抑菌活性的影響[13]。抑菌圈實驗重復(fù)三次取平均值。

1.2.3 菌株的生理生化指標檢測 從產(chǎn)酸產(chǎn)氣、產(chǎn)硫化氫、精氨酸產(chǎn)氨、產(chǎn)粘和產(chǎn)色素能力等幾個方面對菌株進行生理生化檢測[14]。

產(chǎn)酸產(chǎn)氣能力的檢測:取1/3試管體積的MRS液體培養(yǎng)基于大試管中,向試管中加入不含氣泡的倒置杜氏小管,于121 ℃高溫高壓滅菌鍋中20 min滅菌后分別接種100 μL實驗菌株,37 ℃發(fā)酵24 h觀察是否產(chǎn)生氣泡。

用pH計測量發(fā)酵24 h上清發(fā)酵液的pH,確定是否具有產(chǎn)酸能力。

產(chǎn)硫化氫的檢測:在裝有滅菌的MRS液體培養(yǎng)基的試管中接種實驗菌株,將醋酸鉛試紙用試管塞塞在試管口處,試紙不能接觸到液體,塞好后用封口膜封口。置于37 ℃發(fā)酵24 h,試紙條變黑為陽性反應(yīng),證明產(chǎn)生硫化氫。

精氨酸產(chǎn)氨檢測:將實驗菌株接種于含精氨酸的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)1～3 d,后取一定量發(fā)酵液于比色皿中,滴加少量奈氏試劑,如果產(chǎn)生橙黃或褐色沉淀則證明產(chǎn)氨。以不接種實驗菌株為對照。顏色反應(yīng)強于對照組的為陽性反應(yīng)。

產(chǎn)粘和產(chǎn)色素檢測:從MRS平板上挑取菌落直接觀察。

1.2.4 16S rDNA菌種鑒定 以目標菌株的基因組DNA為模板,選取27F、1492R為通用引物,進行16S rDNA的PCR擴增[15]。

50 μL反應(yīng)體系:DNA模板2 μL,10 μmol/L上游引物1 μL,10 μmol/L下游引物1 μL,2×Taq PCR MasterMix 10 μL,dd H2O 36 μL,空白對照不加入DNA模板。

PCR擴增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共30個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,最終降溫到4 ℃反應(yīng)終止。標準條件下用1%瓊脂糖凝膠電泳使PCR產(chǎn)物形成條帶,送至華大基因測序公司進行檢測。測序結(jié)果處理后到GenBank比對,用MEGA6軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹[16]。

1.2.5 乳酸菌產(chǎn)細菌素基因克隆 根據(jù)16S rDNA菌種鑒定結(jié)果,在NCBI中搜索乳酸菌細菌素相關(guān)基因,重點搜尋Ⅱb類細菌素基因,同時結(jié)合文獻中所使用的特異性引物[11],設(shè)計使用多種引物進行特異性擴增(序列見表1)。模板為培養(yǎng)12 h的新鮮目標菌液基因組DNA。

表1 乳酸菌細菌素相關(guān)基因PCR擴增引物Table 1 Specific PCR primers used for detection of genes involved in Lactobacillus

50 μL反應(yīng)體系:模板1 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,2×Taq PCR MasterMix 10 μL,ddH2O 36 μL,其中空白對照組用ddH2O補足。PCR擴增條件:94 ℃,5 min 預(yù)變性;(94 ℃,30 s;Tm-5 ℃,30 s;72 ℃,30 s)共33 個循環(huán),72 ℃延伸10 min,4 ℃保溫。所得PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳在標準條件下進行檢測,將與預(yù)期大小相符的PCR產(chǎn)物進行純化后,送至北京華大基因有限公司測序,并將測序結(jié)果登陸NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對。

1.2.6 酸堿對發(fā)酵液抑菌能力的影響 選取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為指示菌,將產(chǎn)細菌素菌株接種在培養(yǎng)基中,發(fā)酵72 h后,離心,取發(fā)酵上清液,將其pH到4.0、4.5、5.0、6.0(2 mol/L NaOH),保持3 h。以未處理的發(fā)酵上清液為對照,測定發(fā)酵液對指示菌的抑菌效果[17]。

1.2.7 溫度對發(fā)酵液抑菌能力的影響 選取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為指示菌,將產(chǎn)細菌素菌株接種在培養(yǎng)基中,發(fā)酵72 h后,離心,取發(fā)酵上清液在50、70、100、121 ℃各處理30 min,以未處理的發(fā)酵上清液為對照,觀察抑菌圈大小[18]。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS軟件(SPSS 17.0 for windows,SPSS Inc,Chicago,IL)對實驗結(jié)果進行方差分析,均值比較采用最小顯著差異法(LSD),顯著性水平p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選

2.1.1 乳酸菌的初篩 本實驗從不同樣品中共計篩得206株菌,具體來源及菌株數(shù)詳見表2。篩選出菌株的菌落基本都呈現(xiàn)乳白色或微黃色,單菌落大小不一但差別不大,均濕潤、光滑、邊緣整齊,發(fā)酵培養(yǎng)基無不良氣味,革蘭氏染色陽性,過氧化氫酶實驗陰性,有較大而透明的溶鈣圈,初步鑒定均為乳酸菌(圖1)。

表2 實驗菌株及來源Table 2 Strains and origin

圖1 乳酸菌的革蘭氏染色圖(a)及平板上的溶鈣圈(b)Fig.1 Gram staining(a)and calcium dissolving ring(b) in plate of lactic acid bacteria

2.1.2 復(fù)篩 利用牛津杯雙層平板法從分離得到的206株乳酸菌中篩選出12株對金黃色葡萄球菌有抑制效果的菌株,其中來源于薩拉米香腸(SA)和新疆發(fā)酵干酪(N)編號為SA102,SA104,N105,N107,N108的五個菌株抑菌效果較明顯(表3),作為下一步實驗用。

表3 乳酸菌復(fù)篩結(jié)果Table 3 Second screening of lactic acid bacteria

注:單位:mm,牛津杯直徑8 mm。

2.2產(chǎn)細菌素菌株的確定

表4 不同pH條件下MRS液體培養(yǎng)基的抑菌效果(mm)Table 4 The inhibitory effect of MRS medium under different pH conditions(mm)

表5 菌液在調(diào)酸、過氧化氫酶、木瓜蛋白酶及復(fù)合蛋白酶處理后的抑菌效果(mm)Table 5 The inhibitory effect of strains at pH4.5 with catalase,protease treatment(mm)

注:單位:mm,牛津杯直徑8 mm,“-”表示無抑菌作用。

2.2.1 酸排除實驗 不同pH條件下MRS液體培養(yǎng)基的抑菌效果見表4,結(jié)果表明無發(fā)酵液的培養(yǎng)液在pH4.0以下具有一定的抑菌效果,pH4.5以上的條件下對致病菌失去了抑菌活性,說明乳酸的抑菌pH范圍在4.0以下,因此選擇pH4.5為酸排除的臨界pH。將發(fā)酵液調(diào)至 pH=4.5,以金黃色葡萄球菌(G+)和大腸桿菌(G-)為指示菌,抑菌效果見表5。SA102、SA104、N105、N107、N108 五個菌株在排除酸的作用下仍然具有顯著的抑菌活性,而相同pH的乳酸水溶液則無抑菌效果,因此可以判斷五個菌株發(fā)酵液中存在除酸以外的抑菌活性物質(zhì)。

2.2.2 過氧化氫排除實驗 將pH4.5的5株實驗菌的上清發(fā)酵液經(jīng)過氧化氫酶處理,觀察測量酶處理前后抑菌圈大小,實驗結(jié)果如表5所示。去除過氧化氫后,發(fā)酵液抑菌直徑?jīng)]有顯著變化,排除過氧化氫的抑菌效果。

2.2.3 蛋白酶敏感性實驗 檢測木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對乳酸菌發(fā)酵上清液抑菌活性的影響,抑菌結(jié)果見表5,結(jié)果表明5個菌株的發(fā)酵上清液中的抑菌活性物質(zhì)對蛋白酶敏感,上清發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)類[19]。

以上結(jié)果可以初步推斷發(fā)酵液中起抑菌作用的物質(zhì)為細菌素。

2.3菌株生理生化指標的檢測

如表6所示,篩選出的5株菌株不產(chǎn)氣、不產(chǎn)氨、不產(chǎn)硫化氫、不產(chǎn)粘,具有很好的生物安全性,不產(chǎn)色素,添加到食品中也不會改變食品顏色,可以考慮作為發(fā)酵劑直接添加到食品中的菌株[20]。

表6生理生化指標的檢測Table 6 The detection of physiological and biochemical indexes

注:(-)代表反應(yīng)結(jié)果為陰性。

圖2 菌株SA104系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of strain SA104

2.4 16S rDNA菌種鑒定

對乳酸菌菌株的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,擴增產(chǎn)物分子量大約為750 bp左右。將所測序列在NCBI中用BLAST搜索引擎進行比對,得到與其同源的基因序列,并用 MEGA軟件對這些序列進行分析,以菌株SA104為例,構(gòu)建系統(tǒng)進化樹如圖2所示。由圖可知,菌株SA104與Lactobacillusplantarumgp1在同一分支,說明它們的同源性最高,故可確定菌株SA104 為植物乳桿菌屬的一個種。5個菌株的鑒定結(jié)果見表7。

表7 5個菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定結(jié)果Table 7 The phylogenetic tree identification results of 5 strains

2.5菌株產(chǎn)細菌素基因克隆

通過設(shè)計并合成7對細菌素合成相關(guān)基因的特異性引物,以SA102、SA104、N105、N107、N108菌體基因組DNA為模板進行PCR擴增,SA102、SA104、N105未擴增出特異性片段,只有菌株N107、N108以 plaKF/R為引物的PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期片段長度相同(圖3),說明菌株N107、N108基因組DNA中含細菌素的編碼基因。將PCR產(chǎn)物純化測序后進行NCBI比對,分析結(jié)果表明得到的該片段存在2條全長為146、149 bp的開放閱讀框,與LactobacillusplantarumNC8的PlnJ,PlnK基因同源性達97.95%和98.62%(圖4),所編碼的成熟肽與Plantaricin J相差1個氨基酸,與PlantaricinK序列完全相同,說明菌株N107、N108基因組DNA中含IIb類雙肽細菌素PlantaricinJK的編碼基因。

圖3 菌株N107(a)和N108(b)細菌素合成相關(guān)基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Agarose electrophoresis of N107(a)and N108(b)PCR products注:1-7為不同引物1：PlnKF、R;2：PlnA1F、R;3：PlnA:2F、R4：LactMF、R;5：LactBFR;6：Nis F、R；7：EntAF、R。

圖4 含有 PlnK(A),PlnJ(B)菌株N107核苷酸序列比對分析Fig.4 PlnK and PlnJ gene nucleotide sequence aglinmentsof strain N107

表8 不同pH條件下發(fā)酵上清液的抑菌效果Table 8 The inhibitory effect of fermentation supernatant under different pH conditions

注:單位:mm,牛津杯直徑8 mm,“-”表示無抑菌作用。

表9 不同溫度熱處理對發(fā)酵上清液抑菌效果的影響Table 9 The effect of different temperature heat treatment on the antibacterial effect of fermentation supernatant

注:單位:mm,牛津杯直徑8 mm。

2.6酸堿條件對發(fā)酵液抑菌能力的影響

由表8可知,5個菌株產(chǎn)生的細菌素在較低pH條件下才表現(xiàn)活性,并且隨著pH升高,抑菌效果明顯下降,當pH高于5.0時,抑菌物質(zhì)活性被破壞。

2.7溫度對上清發(fā)酵液抑菌物質(zhì)穩(wěn)定性的影響

由表9可知,5個菌株產(chǎn)生的細菌素都對熱較為穩(wěn)定,在50、70 ℃熱處理30 min也不會降低抑菌活性,但是當溫度達到100、121 ℃時,抑菌活性發(fā)生一定程度下降。

3 結(jié)論

本研究利用溶鈣圈法及牛津杯雙層平板法從來自不同地區(qū)的香腸、奶酪及泡菜等多類樣品中分離純化得到206個菌株,通過排酸、過氧化氫及蛋白酶實驗后獲得5個能產(chǎn)細菌素的菌株SA102、SA104、N105、N107、N108,生理生化指標測試證實這些產(chǎn)細菌素菌株不產(chǎn)氣、不產(chǎn)氨、不產(chǎn)硫化氫、不產(chǎn)粘,不產(chǎn)色素,具有較好的生物安全性,經(jīng)16S rDNA鑒定這5個菌株2株為乳酸乳桿菌3株為植物乳桿菌。通過設(shè)計細菌素特異性引物對5個菌株細菌素編碼基因進行PCR擴增,結(jié)果顯示植物乳桿菌N107、N108同時含有PlnK和PlnJ基因,屬于產(chǎn)Ⅱb類細菌素菌株。隨后,對發(fā)酵液中細菌素粗提物的酸堿穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性進行了初步探究,發(fā)現(xiàn)其對pH高于5.0的環(huán)境不耐受,對熱的穩(wěn)定性相對較好,121 ℃熱處理30 min后菌株仍保持較好的抑菌活性。

傳統(tǒng)的依賴功能性測定進行細菌素篩選的方法耗時、步驟繁瑣且容易漏篩,基于 PCR 方法的快速篩選可以作為一種有效手段,根據(jù)已知的細菌素 DNA 序列進行保守引物的設(shè)計或可用于在未知乳酸菌群中不易發(fā)現(xiàn)細菌素的挖掘。本研究中SA102、SA104、N105未擴增出特異性片段,可能是由于引物特異性不強而無法克隆得到產(chǎn)物,這也是PCR 方法雖然有快速靈敏準確度高的優(yōu)點,但是仍受限于目前生物信息學限制的缺點。菌株N107、N108屬于產(chǎn)Ⅱb類細菌素菌株,此類細菌素發(fā)揮抗菌作用需要2條肽鏈的協(xié)同作用,可使抑菌活性明顯增強,抑菌能力甚至可增加約1000倍[21]。本研究中僅對發(fā)酵液粗提物進行了酸堿和溫度穩(wěn)定性的初步研究,通過分離純化細菌素PlnK和PlnJ或者實現(xiàn)其異源表達,有助于進一步詳細了解2條肽鏈的協(xié)同作用,完善其在食品防腐保鮮領(lǐng)域的潛力和功能。

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Screeningandidentificationofbacteriocinproducedbylacticacidbacteria

LIUYing-li,DINGLi,XIELiang-xu,WANGJing*,ZHANGHui-juan

(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

In order to obtain bacteriocin producing strains,lactic acid bacterias were isolated from European salami sausages,Xinjiang cheeses,self fermented pickles,Korean cabbages in chili sauce by using calcium dissolving ring and Oxford cup double plate methods. The strains were identified to species on the basis of morphological,physiological,biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis,and the bacteriocin related gene was analyzed to determine bacteriocin types. The results showed that 5 strains(SA102,SA104,N105,N107,N108)had better antibacterial activity among the 206 strains. The antimicrobial role of this bacteriocin was confirmed by eliminating the interference of organic acid,hydrogen peroxide and by conducting protease sensitivity. Two of these 5 strains wereLactobacilluscaseiand three wereLactobacillusplantarum.The rapid screening of PCR amplification showed that N107,N108 contained IIb plantaricins JK gene. Physiological and biochemical tests confirmed that 5 strains with good biological safety produced no gas,ammonia,hydrogen sulfide,viscosity and pigment. pH stability and temperature stability of the crude extract of fermentation were explored to provide some information and resources for the further study of bacteriocin.

lactic acid bacteria;bacteriocin;gene clone

2017-03-08

劉英麗(1981-)，女，博士，副教授，主要從事食品品質(zhì)改良的研究，E-mail:liuyingli@th.btbu.edu.cn。

*通訊作者:王靜(1976-)，女，博士，教授，主要從事食品品質(zhì)改良的研究，E-mail:wangjing@th.btbu.edu.cn。

北京市教委一般項目(SQKM201610011004);國家自然科學基金項目(31601564,31571940);科技創(chuàng)新服務(wù)能力建設(shè)-科研水平提高定額-食品特色項目(科研類)(19005757057);北京市教委科研類專項科技創(chuàng)新平臺(19008001226); 北京市優(yōu)秀人才培育資助青年拔尖團隊項目。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0146-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.028