一株高產(chǎn)金屬硫蛋白枯草芽孢桿菌的誘導(dǎo)發(fā)酵條件優(yōu)化

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(1.浙江海洋大學(xué),浙江舟山 316022; 2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所,福建廈門 361000; 3.福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心,福建廈門 361000)

一株高產(chǎn)金屬硫蛋白枯草芽孢桿菌的誘導(dǎo)發(fā)酵條件優(yōu)化

鄒俊杰1,2,3,張賓1,孫繼鵬2,3,*,閻光宇2,3

(1.浙江海洋大學(xué),浙江舟山 316022; 2.國(guó)家海洋局第三海洋研究所,福建廈門 361000; 3.福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心,福建廈門 361000)

金屬硫蛋白為一類廣泛存在于生物體內(nèi)的多功能誘導(dǎo)性蛋白,具有轉(zhuǎn)運(yùn)儲(chǔ)存金屬離子、清除自由基、激活(失活)鋅調(diào)節(jié)蛋白等功能,近年來(lái)已成為研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。本文以一株基因重組枯草芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)金屬硫蛋白發(fā)酵條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌最優(yōu)生長(zhǎng)條件為:培養(yǎng)溫度37 ℃,培養(yǎng)基初始pH7,搖床轉(zhuǎn)速220 r/min,接種量4%;最佳誘導(dǎo)發(fā)酵條件為:菌液OD600=3.9,IPTG終濃度1 mmol/L,搖床轉(zhuǎn)速220 r/min,誘導(dǎo)時(shí)間48 h,誘導(dǎo)金屬Cd2+終濃度為50 μmol/L,發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽為1% MgSO4、碳源為2%蔗糖、氮源為1.5%酵母浸出物+胰蛋白胨+氯化銨(2∶2∶1),枯草芽孢桿菌MT表達(dá)量達(dá)到最高為0.135 mg/mL。本研究為開(kāi)發(fā)天然、高效海洋源金屬硫蛋白提供了一定理論依據(jù)。

金屬硫蛋白,枯草芽孢桿菌,發(fā)酵

金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是一類低分子質(zhì)量、高巰基含量、能結(jié)合金屬離子,尤其對(duì)Cd2+、Zn2+、Cu2+、Au+、Ag+等重金屬具有較強(qiáng)親和力的蛋白質(zhì),其廣泛存在于從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物的多種生物體內(nèi),具有金屬解毒、清除自由基、抗電離輻射、抗細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗不良狀態(tài)的適應(yīng)能力等多種功能,因此在醫(yī)藥、環(huán)境檢測(cè)、保健品、化妝品等領(lǐng)域有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景[1]。

目前,由于MT在生物體內(nèi)具有十分重要的生物學(xué)功能,其應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣泛,開(kāi)發(fā)與利用MT已成為熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。自1957年Margoshes和Vallee[2]等報(bào)道從蓄積鎘的馬腎臟中分離出Cd-MT以來(lái),研究發(fā)現(xiàn)幾乎能從所有哺乳動(dòng)物、魚類、兩棲類和某些植物及真核、原核微生物中分離得到Cd-MT[3-4]。陸續(xù)有日本學(xué)者Naiki[5]等從釀酒酵母IFO 0044 RCU菌株中分離得到不含芳香族氨基酸的MT;Olafson[6]等在藍(lán)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)MT;Kneer[7]等發(fā)現(xiàn)粗糙脈孢菌能誘導(dǎo)類Cu-MT產(chǎn)生;吳傳松[8]篩選得到具有產(chǎn)金屬硫蛋白能力的酵母菌,并對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,MT的產(chǎn)量由0.885 mg/g提高到了1.366 mg/g;成玉梁[9]通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室誘變處理得到的金屬硫蛋白高產(chǎn)且遺傳性狀穩(wěn)定的釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵誘導(dǎo)條件的優(yōu)化,測(cè)得MT產(chǎn)量為0.074(以巰基活性計(jì)),較優(yōu)化前大幅提高。盡管可以從各種動(dòng)物器官、植物組織中分離提純MT,但從動(dòng)植物體中提純MT仍存在著成本高、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。而利用微生物發(fā)酵培養(yǎng),特別是依靠生物工程菌的培育來(lái)生產(chǎn)MT,因其具有無(wú)毒、來(lái)源可控、成本低廉、周期短等優(yōu)點(diǎn),必將受到市場(chǎng)開(kāi)發(fā)的青睞。其中,路延篤[10]構(gòu)建了猴金屬硫蛋白α域表達(dá)載體,并用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),得到了產(chǎn)野生型猴金屬硫蛋白的工程菌,MT產(chǎn)率0.76 mg/g。呂品[11]以綠色熒光蛋白為報(bào)告基因,構(gòu)建了金屬硫蛋白重組表達(dá)載體,并成功轉(zhuǎn)化出產(chǎn)金屬硫蛋白的畢赤酵母。蘇艷芳[12]采用乳酸乳球菌N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶AcmA的C端結(jié)構(gòu)域作為融合標(biāo)簽和錨定功能域,成功實(shí)現(xiàn)了人源Ⅰ型金屬硫蛋白在大腸桿菌體系的重組表達(dá)。

為解決制約MT產(chǎn)業(yè)發(fā)展原料來(lái)源瓶頸,本實(shí)驗(yàn)室以海洋源貝類為原料,選擇安全的食品級(jí)微生物(益生菌)為表達(dá)宿主,通過(guò)構(gòu)建MT表達(dá)載體,獲得益生菌重組菌株,MT初始產(chǎn)率為0.073 mg/mL。其中,枯草芽孢桿菌作為很有吸引力的外源基因表達(dá)的宿主,具有以下優(yōu)點(diǎn):遺傳學(xué)先進(jìn),生長(zhǎng)迅速,培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單,大部分枯草芽孢桿菌可以形成自然感受態(tài),攝取外源DNA;枯草芽孢桿菌具有強(qiáng)大的蛋白質(zhì)分泌能力,外源蛋白在枯草芽孢桿菌中表達(dá)后,蛋白跨越細(xì)胞膜,被加工或直接釋放到培養(yǎng)基中而不發(fā)生聚集,回收和純化蛋白較為簡(jiǎn)單;枯草芽孢桿菌分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不會(huì)混雜有胞被內(nèi)毒素,被廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)的食物,飲料發(fā)酵,食用防腐劑的生產(chǎn);枯草芽孢桿菌是許多工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌,因此具有良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)。另外,食品安全級(jí)工程菌(益生菌)作為表達(dá)宿主,其生物毒性低、遺傳性狀穩(wěn)定,且該菌株八種蛋白酶缺陷,能大幅降低蛋白酶對(duì)MT的分解作用。

本研究以WB-800枯草芽孢桿菌工程菌(本實(shí)驗(yàn)室重組獲得)為研究對(duì)象,綜合考察其誘導(dǎo)表達(dá)金屬硫蛋白發(fā)酵條件,獲得MT高效表達(dá)最佳途徑,得到MT樣品,為開(kāi)發(fā)天然、高效海洋源重金屬生物解毒劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

菌種:WB-800枯草芽孢桿菌工程菌(由國(guó)家海洋局第三海洋研究所保藏)。

麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉、氯化鋅、氯化鈣、氯化銨、氯化鎘、亞硒酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、乙腈、甲醇、氫氧化鉀、硼酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等,以上試劑均為分析純 西隴化工股份有限公司。

Tris-(2-carboxylethyl)-phosphine(三(2-酰乙基)磷鹽酸鹽)、Ammnium 7-Fluoro-2,1,3-bzoxadiazole-4-sulfonate(SBD-F衍生劑)、兔肝金屬硫蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(≥90%),Sigma-Aldrich上海貿(mào)易有限公司。

LB培養(yǎng)基、技術(shù)瓊脂粉、Glycerol(甘油)、Neomycin Sulfate(硫酸新霉素)、Chloramphenicol(氯霉素)、IPTG Dioxane Free(異丙基硫代半乳糖苷)等,以上試劑均為分析純 北京索萊寶科技有限公司。

平板培養(yǎng)基:酵母浸出物5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,氯化鈉10 g/L,瓊脂粉15 g/L,自然pH。

LB培養(yǎng)基:酵母浸出物5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,氯化鈉10 g/L,自然pH。

UV-1780紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 島津儀器有限公司;Waters e2695高效液相色譜儀 2475熒光檢測(cè)器,沃特世科技有限公司;QTY-70S恒溫?fù)u床 上海知楚儀器有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠等。

1.2菌種培育和優(yōu)化

將-20 ℃保存菌種轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基,37 ℃活化24 h。取一環(huán)活化菌種,接入裝有50 mL LB培養(yǎng)基的200 mL三角燒瓶中,37 ℃,200 r/min育種20 h。取一定體積OD600=3.5的種子液,接入裝有50 mL LB培養(yǎng)基的200 mL三角燒瓶中,保持裝液量和37 ℃條件不變,分別優(yōu)化培養(yǎng)基初始pH、搖床轉(zhuǎn)速和接種量對(duì)菌種培育影響。各影響因素設(shè)計(jì)如下:培養(yǎng)基初始pH:5.0、6.0、7.0、8.0、9.0;搖床轉(zhuǎn)速180、200、220、240 r/min;接種量1%、2%、4%、8%,每組設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),每2 h取樣測(cè)定菌液OD600,確定最佳菌種培育條件。

1.3誘導(dǎo)發(fā)酵和優(yōu)化

菌株在最佳條件下(培養(yǎng)基初始pH為7,培育轉(zhuǎn)速為220 r/min,接種量為4%)培養(yǎng),分別加入一定體積的葡萄糖、IPTG誘導(dǎo)劑、ZnSO4、Na2SeO3、CdCl2,37 ℃下?lián)u瓶誘導(dǎo)發(fā)酵。分別考察了菌液OD600、IPTG終濃度、搖床轉(zhuǎn)速、金屬添加量及誘導(dǎo)發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株表達(dá)MT影響。各影響因素設(shè)計(jì)如下:菌液OD6001.0、2.0、3.0、3.9;IPTG誘導(dǎo)劑量0、50、100、500、1000 μmol/L;搖床轉(zhuǎn)速180、200、220、240 r/min;誘導(dǎo)時(shí)間24、48、72 h;ZnSO4、Na2SeO3、CdCl2分別設(shè)立0、50、100、200、500、700 μmol/L,每組設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn),測(cè)定發(fā)酵液中MT含量,確定最佳誘導(dǎo)發(fā)酵條件。

同時(shí)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中2%碳源(甘油、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖);1.5%氮源(牛肉浸出粉(一號(hào))、酵母浸出物+胰蛋白胨+氯化銨(2∶2∶1)(二號(hào))、酵母浸出物+胰蛋白胨+尿素(2∶2∶1)(三號(hào))、酵母浸出物+胰蛋白胨(1∶1)(四號(hào)));1%無(wú)機(jī)鹽(硫酸鎂、磷酸氫二鈉+磷酸二氫鈉(1∶1)、空白、氯化鈉)分別進(jìn)行考察,擇出最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基條件。

1.4 MT測(cè)定方法

取20 μL MT上清液,依次加入3 μL 20%TCEP,10 μL 1 mg/mL SBD-F,75 μL反應(yīng)緩沖液(1 mol/L硼酸、30 mmol/L EDTA、0.8 mol/L KOH,pH10.5)振蕩混勻,50 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min后,加入10 μL 4 mol/L HCl終止反應(yīng),用定容緩沖液(20 mmol/L K2HPO4、20 mmol/L KH2PO4,pH7.5)定容至1 mL,振蕩混勻,采用高效液相色譜法測(cè)定(流動(dòng)相:乙腈∶甲醇∶定容緩沖鹽=18∶2∶80;色譜柱:伊利特ODS-BP C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:35 ℃;洗脫時(shí)間:20 min;流速:0.5 mL/min;激發(fā)波長(zhǎng):380 nm,發(fā)射波長(zhǎng):510 nm)[13]。

1.5數(shù)據(jù)處理方法

精確量取兔肝MT標(biāo)準(zhǔn)品,逐級(jí)稀釋至0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL,HPLC法測(cè)定后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(方法同1.4),將所測(cè)樣品峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到MT含量。

2 結(jié)果與討論

2.1菌種培育條件優(yōu)化

2.1.1 初始pH對(duì)菌種培育的影響 在菌體培育過(guò)程中,因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和菌體生長(zhǎng)代謝所產(chǎn)生的分泌物,導(dǎo)致菌液pH上升或下降,此過(guò)程通常不可控,所以大多數(shù)發(fā)酵培養(yǎng)僅對(duì)培養(yǎng)基的初始pH進(jìn)行優(yōu)化調(diào)控。培養(yǎng)基的初始pH主要影響菌體細(xì)胞膜電荷、膜滲透性及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)離子化程度,合適的初始pH能顯著促進(jìn)菌體對(duì)養(yǎng)分的分解與吸收。如圖1所示,在初始pH6～8范圍內(nèi),枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)狀況良好,穩(wěn)定期內(nèi)菌體密度較大。初始pH為7時(shí),菌體24 h內(nèi)生長(zhǎng)最為活躍,在24～36 h內(nèi)的生長(zhǎng)穩(wěn)定期菌體密度大,宋文龍[18]等發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基初始pH低于6.8或高于7.6均不利于枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng),當(dāng)pH為7.2時(shí)活菌數(shù)最高,與本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論接近,故選初始pH7為培養(yǎng)基最佳初始pH。

圖1 初始pH對(duì)菌種培育的影響Fig.1 Effect of pH on cultivation of Bacillus subtilis

2.1.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌種培育的影響 枯草芽孢桿菌為好氧性細(xì)菌,搖瓶中的氧氣量將直接影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和活性物質(zhì)的產(chǎn)生。當(dāng)裝液量一定時(shí),搖床轉(zhuǎn)速為影響瓶?jī)?nèi)氧氣量的重要因素。如圖2所示,在180～240 r/min之間,隨著轉(zhuǎn)速的增加,菌體生長(zhǎng)加快,但培養(yǎng)42 h后,220 r/min與240 r/min兩組的OD600較高,這可能是因?yàn)楹笃诰w密度增大,過(guò)低的搖床轉(zhuǎn)速已經(jīng)不能滿足所有菌體的供氧需求。周映華[19]等對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)設(shè)立搖床轉(zhuǎn)速:150、200、220、250、300 r/min,發(fā)現(xiàn)隨著轉(zhuǎn)速提高,OD600值升高,并在220 r/min時(shí)菌體密度達(dá)到峰值,與本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。故選取220 r/min為最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

圖2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌種培育的影響Fig.2 Effect of rotate speed on cultivation of Bacillus subtilis

2.1.3 接種量對(duì)菌種培育的影響 在發(fā)酵過(guò)程中,一般選取生長(zhǎng)穩(wěn)定期內(nèi)的菌體用于后期誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),這樣既可保持高的細(xì)胞活力,又可獲得盡可能多的細(xì)胞數(shù)。如圖3所示,培養(yǎng)26 h時(shí),接種量4%與8%組就已達(dá)到生長(zhǎng)最高峰,而1%組別的生長(zhǎng)最高峰出現(xiàn)在34 h?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中的時(shí)間成本,故剔除1%與2%組別。對(duì)于8%組別,由于接種量過(guò)大,會(huì)造成菌體早衰,導(dǎo)致發(fā)酵后勁不足,張曉玲[20]等在利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)胞外多糖的實(shí)驗(yàn)中也認(rèn)為,由于枯草芽孢桿菌屬好氧菌,當(dāng)接種量過(guò)高時(shí),導(dǎo)致氧氣量和底物量不足,影響其生長(zhǎng)繼而影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的表達(dá),故本實(shí)驗(yàn)選取4%為菌體培育最佳接種量。

圖3 接種量對(duì)菌種培育的影響Fig.3 Effect of inoculum rate on cultivation of Bacillus subtilis

2.2誘導(dǎo)發(fā)酵條件優(yōu)化

圖4 轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)OD600、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG劑量對(duì)MT產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of rotate speed,OD600,Induction time,and IPTG on production of MT

2.2.1 誘導(dǎo)OD600、IPTG劑量、轉(zhuǎn)速和誘導(dǎo)時(shí)間 同2.1.2所述,發(fā)酵過(guò)程中的氧氣量決定了外源蛋白的表達(dá)量,如圖4所示,在200～240 r/min范圍內(nèi),MT的表達(dá)水平差距較小,為避免因過(guò)高的搖床轉(zhuǎn)速引起菌體機(jī)械損傷,故選220 r/min為最佳誘導(dǎo)搖床轉(zhuǎn)速。

誘導(dǎo)劑的加入觸發(fā)誘導(dǎo)菌體啟動(dòng)子,菌體的生長(zhǎng)受到抑制,合理選擇誘導(dǎo)劑加入的時(shí)間點(diǎn),可使培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)得到合理消耗,從而提高目的產(chǎn)物的表達(dá)量。如圖4所示,隨著誘導(dǎo)OD600的增加,發(fā)酵液中MT的含量也隨之增加,這說(shuō)明MT的表達(dá)量是與菌體密度成正相關(guān),OD600=3.9時(shí),正是菌體生長(zhǎng)的最高峰,細(xì)胞活性高,菌體密度大,為此選取OD600=3.9為最佳誘導(dǎo)OD600。

如圖4所示,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí),MT的表達(dá)量達(dá)到最高,繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間MT的產(chǎn)量基本穩(wěn)定,原因可能是當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間足夠長(zhǎng)時(shí),由于累積產(chǎn)物的自我抑制作用以及生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的其他不利物質(zhì)的影響和作用,導(dǎo)致菌體誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中整體效果變差,目的產(chǎn)物積累趨于穩(wěn)定[17],故選48 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

IPTG會(huì)抑制菌體生長(zhǎng),誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá),一般IPTG誘導(dǎo)濃度在0.1～1 mmol/L之間。如濃度過(guò)低,菌體生長(zhǎng)過(guò)快消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),使目的蛋白表達(dá)較少;濃度過(guò)高,細(xì)菌受到太強(qiáng)的抑制而生長(zhǎng)不良,目的蛋白表達(dá)減少[8]。如圖4所示,IPTG終濃度在1 mmol/L達(dá)到最大MT表達(dá)量。

2.2.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基 氮是構(gòu)成重要生命物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸的主要元素,占菌體干重的12%～15%,是微生物發(fā)酵的主要營(yíng)養(yǎng)[22]?？莶菅挎邨U菌利用有機(jī)氮源的能力優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源,其中,因酵母浸出物富含氨基酸、維生素以及未知生長(zhǎng)因子為枯草芽孢桿菌優(yōu)良生長(zhǎng)氮源。如圖5所示,酵母浸出物+胰蛋白胨+氯化銨(2∶2∶1)組別相較其他組別為最佳誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源,其峰值MT表達(dá)量達(dá)到0.083 mg/mL。

圖5 培養(yǎng)基對(duì)MT產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of culture medium on production of MT

除水分外,碳源是微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵需要最多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),占細(xì)胞含量的50%[23]。秦艷[21]等認(rèn)為枯草芽孢桿菌利用單糖和二糖的能力優(yōu)于多糖,故本實(shí)驗(yàn)選用無(wú)機(jī)碳源:麥芽糖、蔗糖、葡萄糖三組,有機(jī)碳源:甘油一組。如圖5所示,甘油和麥芽糖相比對(duì)照組葡萄糖其MT表達(dá)量較小,而蔗糖組的MT表達(dá)量達(dá)到0.075 mg/mL,故選用2%的蔗糖作為誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

蛋白表達(dá)過(guò)程中,除碳源和氮源外,微量元素對(duì)生物活性有很大的調(diào)節(jié)作用。如圖5所示,無(wú)機(jī)鹽對(duì)MT表達(dá)量有利的順序依次為:硫酸鎂>磷酸鹽>空白>氯化鈉。硫酸鎂組別MT的表達(dá)量達(dá)到0.090 mg/mL,相較空白組別提高了17%,故選用1%的硫酸鎂作為誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽。

2.2.3 誘導(dǎo)金屬量 MT的合成可被許多因素如重金屬、激素等所誘導(dǎo),并可與多種金屬結(jié)合。MT對(duì)常見(jiàn)金屬的相對(duì)親和力依次為Ag>Hg>Cu>Cd>Zn>Co=Ni[14]。如若金屬流入量超過(guò)了現(xiàn)有的MT存留量時(shí),金屬離子則被其他蛋白質(zhì)利用,同時(shí)啟動(dòng)MT的基因轉(zhuǎn)錄,加速誘導(dǎo)MT的合成,降低游離金屬離子的水平,同時(shí)也有效減少刺激MT合成的因素,從而使細(xì)胞內(nèi)金屬離子數(shù)量維持相對(duì)平衡[15]。

如圖6所示,Se4+終濃度在50～700 μmol/L范圍內(nèi),MT的整體表達(dá)水平相較Cd2+和Zn2+并不理想,可能是由于Se4+自身雙性特質(zhì),并且需將四價(jià)Se4+還原至二價(jià),導(dǎo)致半胱氨酸殘基對(duì)Se4+的結(jié)合能力有限。其中,當(dāng)Se4+終濃度為100 μmol/L時(shí),MT表達(dá)量達(dá)到峰值0.105 mg/mL。

圖6 誘導(dǎo)金屬量對(duì)MT產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of metal dose on production of MT

苗蘭蘭[17]等發(fā)現(xiàn)MT的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域包含20個(gè)半胱氨酸(Cys)殘基,通常能和7個(gè)Zn2+結(jié)合。Zn2+終濃度在50～700 μmol/L范圍內(nèi),MT的表達(dá)量差異性較小,當(dāng)Zn2+終濃度為700 μmol/L時(shí),MT表達(dá)量達(dá)到峰值0.115 mg/mL。

當(dāng)Cd2+終濃度為50 μmol/L時(shí),MT表達(dá)量達(dá)到峰值0.135 mg/mL,隨著Cd2+濃度的增大,由于Cd自身毒性作用較強(qiáng),在誘導(dǎo)的同時(shí)也會(huì)抑制菌體活性,使MT表達(dá)量下降[16]。再者,考慮后期金屬脫除實(shí)驗(yàn)中Cd2+的脫除,故選用50 μmol/L為Cd2+誘導(dǎo)終濃度。

綜合考慮MT表達(dá)量和金屬誘導(dǎo)劑量,選擇Cd2+為最佳誘導(dǎo)金屬,其終濃度為50 μmol/L。

3 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的一株高產(chǎn)MT的枯草芽孢桿菌WB-800為對(duì)象,進(jìn)行培育誘導(dǎo)條件優(yōu)化?？莶菅挎邨U菌最優(yōu)生長(zhǎng)條件為:培養(yǎng)溫度37 ℃,培養(yǎng)基初始pH7,搖床轉(zhuǎn)速220 r/min,接種量4%;最佳誘導(dǎo)發(fā)酵條件為:菌液OD600=3.9,IPTG終濃度1 mmol/L,搖床轉(zhuǎn)速220 r/min,誘導(dǎo)時(shí)間48 h,誘導(dǎo)金屬Cd2+終濃度為50 μmol/L,發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽為1% MgSO4、碳源為2%蔗糖、氮源為1.5%酵母浸出物+胰蛋白胨+氯化銨(2∶2∶1),MT表達(dá)量達(dá)到0.135 mg/mL,相較于初始MT產(chǎn)率0.073 mg/mL,優(yōu)化效果顯著。

現(xiàn)如今極大部分工程菌對(duì)MT實(shí)行胞內(nèi)分泌,后期純化過(guò)程中需經(jīng)過(guò)細(xì)胞反復(fù)凍融破壁,采用有機(jī)溶劑粗提、濃縮后才能進(jìn)一步提純,導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本較高。而本實(shí)驗(yàn)所采用菌株對(duì)MT實(shí)行胞外分泌,MT產(chǎn)率基數(shù)大并且發(fā)酵液可直接通過(guò)升溫、離心、膜分離等物理手段進(jìn)行提取分離,其操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì),且有效規(guī)避了因添加有機(jī)溶劑等對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物造成污染,本研究可為MT的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供可行性技術(shù)途徑。

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Optimizationofinducedfermentationconditionsforahigh-yieldingBacillussubtilisofmetallothionein

ZOUJun-jie1,2,3,ZHANGBin1,SUNJi-peng2,3,*,YANGuang-yu2,3

Metallothionein(MT)is a kind of multifunctional inducible protein widely distributed in the organism,with the functions of transportation and storage of metal ions,scavenging free radicals function,activation(inactivation)function of zinc regulatory proteins,and has been one of the hot fields of biology and medicine in basic research and applied research in recent years. In this paper,the fermentation conditions of a strain of high yield recombinantBacillussubtilisstrain were optimized. Through the single factor experiment,the optimal conditions for the growth of recombinantBacillussubtilisas follows,temperature 37 ℃,initial pH7,rotation speed 220 r/min,inoculation amount 4%,and the optimal fermentation conditions of induction as follows,OD600=3.9,IPTG concentration 1 mmol/L,the rotate speed 220 r/min,the induction time 48 h,50 μmol/L Cd2+,MgSO4(1%),sucrose(2%),nitrogen source(1.5%yeast extract+peptone+ammonium chloride)(2∶2∶1),the expression of MT reached 0.135 mg/mL. This study provides some theoretical basis for the development of the natural,efficient marine source metallothionein.

metallothionein;Bacillussubtilis;fermentation

2017-03-03

鄒俊杰(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與利用，E-mail：610720754@qq.com。

*通訊作者:孫繼鵬(1980-)，男，博士，研究方向：海洋藥物與食品化學(xué)，E-mail：jpsun@tio.org.cn。

國(guó)家海洋局第三海洋研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(海三科2016031)；福建省科技計(jì)劃引導(dǎo)性項(xiàng)目“海洋源金屬硫蛋白基因重組高效表達(dá)及發(fā)酵技術(shù)研究”。

(1.Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China;2.Third Institute of Oceanography,State Oceanic Administration,Xiamen 361000,China;3.Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources,Xiamen 361000,China)

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0130-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.025