馬克斯克魯維酵母高密度發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

, ,江月,,, ,

(1.江蘇大學 食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.新疆天潤生物科技股份有限公司,新疆烏魯木齊 830088)

馬克斯克魯維酵母高密度發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

王亮1,胡曼1,王江月1,鞏小芬1,劉朋龍2,詹濤2,李陽2

(1.江蘇大學 食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.新疆天潤生物科技股份有限公司,新疆烏魯木齊 830088)

對影響馬克斯克魯維酵母高密度發(fā)酵的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件展開分析研究。單因素實驗發(fā)現(xiàn),YPD作為基礎培養(yǎng)基有利于馬克斯克魯維酵母的增殖;培養(yǎng)基成分響應面分析和培養(yǎng)條件正交實驗結果表明,當培養(yǎng)基成分為蔗糖67.37 g/L,酵母浸粉29.7 g/L,玉米漿15.61 g/L,KH2PO44.13 g/L,MgSO40.3 g/L,初始pH為6.0、發(fā)酵溫度為30 ℃、攪拌速度為160 r/min時,發(fā)酵培養(yǎng)18 h馬克斯克魯維酵母的生物量最大,為(9.34±0.12) g/L。進一步進行乳飲品發(fā)酵實驗,優(yōu)化培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母與乳源培養(yǎng)基培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母,在菌種的生物量和乳飲品的口感風味上無明顯差異。因此,優(yōu)化后的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方和工藝條件適宜于馬克斯克魯維酵母菌的高密度發(fā)酵。

馬克斯克魯維酵母,高密度發(fā)酵,增殖速率,固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)作為一種廣泛存在于發(fā)酵乳中的酵母,不僅可以發(fā)酵乳糖,更能對半乳糖進行利用,發(fā)酵過程中可以單獨或與乳酸菌一起用于發(fā)酵乳品,賦予了產(chǎn)品獨特的風味及營養(yǎng)特性[1],因而備受國內(nèi)外眾多研究者的關注。由于馬克斯克魯維酵母在多種發(fā)酵乳中具有產(chǎn)酒精量低、發(fā)酵風味好的特點,國內(nèi)對于馬克斯克魯維酵母菌的應用,主要集中在新型乳飲品的研發(fā)上。李新玲等人對馬克斯克魯維酵母生產(chǎn)奶啤和乳清飲料的工藝進行了探討[2]。陳成等人利用馬克斯克魯維酵母生產(chǎn)乳清酒,并對乳清酒所含的可溶性乳清蛋白肽進行了分析[3]。國外對于馬克斯克魯維酵母的應用,主要集中在利用馬克斯克魯維酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生某些風味物質(zhì)和生產(chǎn)乙醇等方面。馬克斯克魯維酵母能發(fā)酵乳液中的乳糖,并對蛋白質(zhì)進行降解[4],生成酯類、羧酸、醇類、乙酸異戊酯等風味物質(zhì)[5]。Michael Crafack等人利用馬克斯克魯維酵母和畢赤克魯維酵母增加了可可的風味[6]。Christian L?ser等人對如何提高馬克斯克魯維酵母規(guī)模化生產(chǎn)乙酸乙酯進行了探討[7]。因此,馬克斯克魯維酵母在發(fā)酵乳制品方面具有廣闊的應用前景。

研究者已經(jīng)認識到馬克斯克魯維酵母的商業(yè)化價值,但嚴重缺乏相關馬克斯克魯維酵母高密度培養(yǎng)的研究。而發(fā)酵工藝中的一個重要的任務就是如何盡可能地提高細胞密度,從而降低發(fā)酵劑的制備生產(chǎn)成本[8]。因此,為了馬克斯克魯維酵母發(fā)酵劑的制備和應用,提高馬克斯克魯維酵母的商業(yè)化價值,需要對馬克斯克魯維酵母菌進行高密度培養(yǎng)。

針對影響馬克斯克魯維酵母高密度發(fā)酵的營養(yǎng)因素及培養(yǎng)條件進行了研究,尋找出了最佳的馬克斯克魯維酵母增殖培養(yǎng)條件,為將來馬克斯克魯維酵母的擴培以及凍干粉的生產(chǎn),提供了可靠的研究基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

馬克斯克魯維酵母菌株,江蘇大學食品學院實驗室保藏;白砂糖、純牛奶、復合穩(wěn)定劑、玉米漿干粉,市售。

YGC瓊脂培養(yǎng)基(含氯霉素) 青島海博生物技術有限公司。用于實驗室酵母菌的保存。

YPD液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母浸粉10 g/L,蛋白胨20 g/L,121 ℃滅菌20 min。用于酵母菌的種子液的活化。

YPD固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L,酵母浸粉10 g/L,蛋白胨20 g/L,瓊脂15 g/L,121 ℃滅菌20 min。用于酵母菌發(fā)酵的單因素影響實驗及菌落計數(shù)。

土豆(黃豆芽)培養(yǎng)基:稱取200 g土豆(黃豆芽),蒸餾水適量加熱煮沸,維持30 min,用雙層紗布趁熱過濾在量杯中,棄去濾渣,用蒸餾水補齊1 L,加20 g葡萄糖,混勻備用,121 ℃滅菌20 min。

麥芽汁培養(yǎng)基:麥芽浸粉20 g/L,蛋白胨10 g/L,葡萄糖20 g/L,酵母浸膏1 g/L,121 ℃滅菌20 min。

乳源培養(yǎng)基:12%脫脂乳粉,白砂糖7%,115 ℃滅菌15 min。用于正常條件下馬克斯克魯維酵母增殖培養(yǎng)。

乳飲品發(fā)酵培養(yǎng)基:酸乳30%,復合穩(wěn)定劑0.5%,白砂糖7%,95 ℃滅菌5 min。用于乳飲品的發(fā)酵制備。

SW-CJ系列潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;QYC 200全溫空氣搖床 上海?，攲嶒炘O備有限公司;pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;BPMJ 250F型霉菌培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀HP6890/5973、頂空固相微萃取SPMC-5732 美國Agilent公司。

1.2實驗方法

1.2.1 馬克斯克魯維酵母菌菌株的活化 從4 ℃保藏的YGC試管斜面培養(yǎng)基上,挑取一環(huán)馬克斯克魯維酵母菌于YPD斜面培養(yǎng)基上,于28 ℃、培養(yǎng)48 h,同樣條件下連續(xù)活化2次。

1.2.2 種子液的制備 挑取一環(huán)活化后的馬克斯克魯維酵母菌,接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基中,28 ℃、160 r/min培養(yǎng)16 h,然后用稀釋涂布法進行菌落計數(shù)。液體培養(yǎng)的酵母菌作為種子液用于培養(yǎng)條件優(yōu)化研究。

1.2.3 影響馬克斯克魯維酵母增殖的培養(yǎng)基成分分析

1.2.3.1 基礎培養(yǎng)基對馬克斯克魯維酵母增殖的影響 酵母菌種子液用無菌水調(diào)至1.0×106cfu/mL,按3%(v/v)分別接種于YPD、PDA、黃豆芽、麥芽汁四種備選液體培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶中裝液量為100 mL),于28 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h,每隔4 h,取0.5 mL樣品,600 nm測定其OD600值,繪制菌體生長曲線,實驗以未接種的培養(yǎng)基調(diào)零。

1.2.3.2 不同濃度碳源對馬克斯克魯維酵母增殖的影響 以不含碳源YPD培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,添加不同碳源,并測試每種碳源在不同濃度條件下對馬克斯克魯維酵母增殖的影響。實驗分別添加蔗糖、葡萄糖、乳糖和麥芽糖四種碳源,每種碳源設置5個濃度梯度,分別為35、45、55、65、75 g/L。以不含有碳源的YPD培養(yǎng)基為對照組。培養(yǎng)液中按3%(v/v)接種馬克斯克魯維酵母種子液,于160 r/min、28 ℃,培養(yǎng)18 h后測定培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母生物量。

1.2.3.3 不同濃度氮源對馬克斯克魯維酵母增殖的影響 以不含氮源YPD培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,添加不同氮源,并測試每種氮源在不同濃度條件下對馬克斯克魯維酵母增殖的影響。實驗分別添加蛋白胨、酵母浸粉、玉米漿、硝酸鉀和硫酸銨五種氮源,對于蛋白胨、酵母浸粉、玉米漿,每種氮源設置5個實驗濃度梯度,分別為10、15、20、25、30 g/L。對于硝酸鉀和硫酸銨,每種無機氮源設置5個實驗濃度梯度,分別為1、3、5、10、15 g/L。培養(yǎng)液中按3%(v/v)接種馬克斯克魯維酵母種子液,于160 r/min、28 ℃,培養(yǎng)18 h后測定培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母生物量。

1.2.3.4 不同濃度無機鹽對馬克斯克魯維酵母增殖的影響 以YPD培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,分別添加KH2PO4、CaCl2、MgSO4、NaCl、MnSO4五種無機鹽,KH2PO4添加濃度分別為2、4、6、8 g/L;MnSO4的添加濃度分別為0.05、0.1、0.5、1.0 g/L;其余三種無機鹽的添加濃度為0.5、1、2、4 g/L。培養(yǎng)液中按3%(v/v)接種馬克斯克魯維酵母種子液,于160 r/min、28 ℃,培養(yǎng)18 h后測定培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母生物量。

1.2.3.5 培養(yǎng)基響應面法優(yōu)化 根據(jù)單因素實驗結果,選取碳源、氮源和無機鹽離子為考察因素,設計5因素3水平的實驗,每個處理設3個重復。應用design expert 8.06進行數(shù)據(jù)分析和響應面分析,優(yōu)化培養(yǎng)基配方。

1.2.4 培養(yǎng)條件對馬克斯克魯維酵母增殖的影響

1.2.4.1 培養(yǎng)條件的單因素實驗 5個250 mL的三角培養(yǎng)瓶中分別加入100 mL優(yōu)化后的培養(yǎng)基,按3%(v/v)接種馬克斯克魯維酵母種子液,分別設定培養(yǎng)溫度為26、28、30、32、34 ℃,于160 r/min,培養(yǎng)18 h后測定培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母生物量。

5個250 mL的三角培養(yǎng)瓶中分別加入100 mL優(yōu)化后的培養(yǎng)基,按3%(v/v)接種馬克斯克魯維酵母種子液,搖床轉(zhuǎn)速分別設定為120、140、160、180、200 r/min,于28 ℃培養(yǎng)18 h后測定培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母生物量。

5個250 mL的三角培養(yǎng)瓶中分別加入100 mL優(yōu)化后的培養(yǎng)基,按3%(v/v)接種馬克斯克魯維酵母種子液,培養(yǎng)基pH分別設定為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5,于28 ℃、160 r/min培養(yǎng)18 h后測定培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母生物量。

1.2.4.2 培養(yǎng)條件的正交實驗 在單因素實驗結果的基礎上,選取溫度、搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)基初始pH為主要因素,設計3因素3水平正交實驗。

1.2.5 高密度優(yōu)化培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母乳飲品發(fā)酵鑒定 將高密度優(yōu)化培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母(A)與乳源培養(yǎng)基正常培養(yǎng)(B)的同一種馬克斯克魯維酵母進行乳飲品發(fā)酵平行對比實驗[2],發(fā)酵培養(yǎng)基:酸乳30%,復合穩(wěn)定劑0.5%,白砂糖7%,95 ℃滅菌5 min。3%(v/v)接種兩種不同培養(yǎng)方式的馬克斯克魯維酵母種子液,于28 ℃培養(yǎng)24 h,即得到馬克斯克魯維酵母發(fā)酵乳飲品。

1.3馬克斯克魯維酵母生物量測定、發(fā)酵乳飲品感官評定和揮發(fā)性成分檢測方法

生物量的測定:將培養(yǎng)后的馬克斯克魯維酵母菌搖勻后,取50 mL懸液,于4000 r/min、離心10 min,棄上清,用無菌水離心洗滌沉淀2次,95 ℃烘至恒重。光密度法:將馬克斯克魯維酵母菌懸液,稀釋6倍,于600 nm測定其OD600值。感官評定:10名受過培訓的成員對發(fā)酵乳飲品進行感官評定,主要評定指標參照黃翠姬等人的文獻[9];揮發(fā)性成分檢測:按照SPME-GC/MS分析方法進行檢測[10]。

2 結果與討論

2.1培養(yǎng)基成分對馬克斯克魯維酵母增殖的影響

2.1.1 基礎培養(yǎng)基對馬克斯克魯維酵母增殖的影響 由圖1生長曲線可知,培養(yǎng)實驗中,以YPD、麥芽汁和黃豆芽為發(fā)酵基礎培養(yǎng)基,馬克斯克魯維酵母菌生長的對數(shù)期和穩(wěn)定期基本相同,分別為4～16 h,16～24 h。以PDA為發(fā)酵培養(yǎng)基,馬克斯克魯維酵母菌生長的對數(shù)期為4～20 h,穩(wěn)定期為20～24 h。4種培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)一段時間后,酵母菌細胞生長密度分別達到最高值,OD600值測試結果為:YPD(0.89)>PDA(0.729)>麥芽汁培養(yǎng)基(0.702)>黃豆芽培養(yǎng)基(0.605),其中以YPD為發(fā)酵基礎培養(yǎng)基,酵母菌細胞生長密度最大,培養(yǎng)16 h時后,OD600達到了0.89。因此,選擇YPD培養(yǎng)基為最佳基礎培養(yǎng)基。

圖1 不同基礎培養(yǎng)基對馬克斯克魯維酵母的生長影響Fig.1 Effect of culture medium on the growth of Kluyveromyces marxianus yeast

2.1.2 碳源及其不同濃度對馬克斯克魯維酵母增殖的影響 碳源是酵母菌所需的主要營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源[11],發(fā)酵過程中必須提供充分的碳源以保障酵母菌的生長和增殖。但是碳源濃度過高,細胞滲透壓過大[12],同樣也會抑制酵母菌的生長。因此篩選恰當碳源種類及添加濃度,對于馬克斯克魯維酵母的增殖非常關鍵。

由圖2可以看出,將不含碳源的YPD液體培養(yǎng)基作為空白組(不含碳源,改變碳源的添加濃度時空白組數(shù)值無變化),添加4種碳源時的馬克斯克魯維酵母菌增殖效果明顯。5個濃度梯度中(35、45、55、65、75 g/L),不含碳源的基礎YPD培養(yǎng)基分別添加葡萄糖、蔗糖或乳糖作為碳源,當添加濃度為65 g/L時,培養(yǎng)18 h后,三種碳源分別培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母生物量都達到最高值,生物量分別為6.06、6.98、2.4 g/L,其中蔗糖最高為6.98 g/L。當碳源添加濃度超過65 g/L后,隨著糖濃度的升高,馬克斯克魯維酵母的生長可能受葡萄糖效應(Crabtree effect)的影響[14],生物量逐漸降低。在以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中,酵母菌的生物量在5個濃度梯度中(35、45、55、65、75 g/L)呈現(xiàn)遞增趨勢,當添加濃度為75 g/L時,生物量達到最高值3.48 g/L。因此從四種添加碳源實驗結果比較分析來看,蔗糖可作為培養(yǎng)基優(yōu)選添加碳源。

圖2 碳源及其不同濃度對馬克斯克魯維酵母的生長影響Fig.2 Effect of carbon sources and concentration on the growth of Kluyveromyces marxianus yeast

2.1.3 氮源及其不同濃度對馬克斯克魯維酵母增殖的影響 由圖3可以看出,以不含氮源的YPD為基礎培養(yǎng)基,當培養(yǎng)基中有機氮源更換為無機氮源硫酸銨和硝酸鉀時,馬克斯克魯維酵母的生物量均低于2 g/L,說明這兩種無機氮源不利于馬克思克魯維酵母的增殖。當培養(yǎng)基分別添加蛋白胨和酵母浸粉作為氮源時,添加濃度為25 g/L時,培養(yǎng)18 h后,馬克斯克魯維酵母生物量都達到最高值,分別為2.13 g/L和2.63 g/L。添加玉米漿作為氮源時,當玉米漿的添加濃度為20 g/L時,馬克斯克魯維酵母生物量達到最高值為2.54 g/L。三種氮源全部達到最高值時的生物量進行比較,酵母浸粉(2.63 g/L)>玉米漿(2.54 g/L)>蛋白胨(2.13 g/L)。酵母浸粉含有的維生素及生長因子能促進酵母細胞的生長。玉米漿是玉米淀粉加工中的主要副產(chǎn)物,富含蛋白質(zhì),氨基酸,維生素和微量元素,可作為蛋白胨替代物,常被用于培養(yǎng)基添加物[11]。因此,為了進一步使發(fā)酵培養(yǎng)基氮源物質(zhì)成分更全面,選擇酵母浸粉和玉米漿作為氮源物質(zhì)進行響應面分析。

圖3 氮源及其不同濃度對馬克斯克魯維酵母的生長影響Fig.3 Effect of nitrogen sources and concentration on the growth of Kluyveromyces marxianus yeast

2.1.4 無機鹽及其不同濃度對馬克斯克魯維酵母增殖的影響 金屬離子對酵母細胞生長和發(fā)酵十分重要。例如Mg2+能改變糖轉(zhuǎn)化率和輔酶因子的代謝途徑[14-16],降低細胞質(zhì)膜的通透性[17-18],抵抗酵母菌細胞對乙醇代謝壓力[19]。

圖4 無機鹽及其不同濃度對馬克斯克魯維酵母菌的生長影響Fig.4 Effect of inorganic ions and concentration on the growth of Kluyveromyces marxianus yeast

由圖4可知,以YPD為基礎培養(yǎng)基,分別添加一定濃度的KH2PO4、MgSO4,能夠在一定范圍內(nèi)提高馬克斯克魯維酵母菌的生物量。其中,當KH2PO4添加濃度在4 g/L時,培養(yǎng)18 h后,馬克斯克魯維酵母生物量達到最高值3.46 g/L;KH2PO4濃度在4 g/L以上時,馬克斯克魯維酵母的生物量降低,可能是KH2PO4濃度超越馬克斯克魯維酵母代謝所需,對馬克斯克魯維酵母增殖起到了抑制作用[8]。MgSO4的添加濃度在0.5 g/L時,生物量最高達到3.48 g/L。不同于Nahit Aktas等人的研究[20]。MnSO4的添加不利于馬克思克魯維酵母的生長。因此,選擇KH2PO4、MgSO4這兩種無機鹽進行響應面分析。

2.1.5 培養(yǎng)基響應面法優(yōu)化 響應面分析法是用來尋找最佳反應因素的一種統(tǒng)計方法[21],已逐漸應用于培養(yǎng)基的優(yōu)化[22]。根據(jù)單因素實驗結果,選取蔗糖、酵母浸粉、玉米漿、KH2PO4、MgSO4為考察因素,設計5因素3水平的實驗,具體的因素水平及其編碼見表1,按照Box-Behnken安排實驗。用design expert 8.06進行數(shù)據(jù)分析和響應面分析。

圖5 部分因素相互作用對馬克斯克魯維酵母菌生物量的影響Fig.5 Response surface plot of the effects of amount of sucrose,yeast extract and corn steep liquor on biomass

利用design expert軟件對表中的實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析,可得回歸方程為Y=7.46+0.51A+0.17B+0.048C+0.019D-0.016E+0.070AB+0.12AC-0.065AD-0.085AE+0.022BC-0.040BD-0.14BE+0.0075CD+0.000CE-0.005DE+0.14A2+0.097B2+0.20C2+0.13D2+0.13E2式中Y為響應值,即酵母菌生物量;A、B、C、D、E分別表示蔗糖、酵母浸粉、玉米漿、KH2PO4、MgSO4。

表1 響應面設計方案和實驗結果Table 1 Scheme and results of response surface design

表2 響應面實驗的方差分析Table 2 Variance analysis of the established regression equation

由表2的方差分析可以看出,模型Prob>F值小于0.0001表明該模型是極度顯著的。模型中的參數(shù)A、B、C、AC、BE、A2、B2、C2、D2、E2對馬克思克魯維酵母的增殖影響都顯著(Prob>F值小于0.05)。模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率,模型失擬項Prob>F值0.6334>0.05,因此,模型失擬項不顯著,不需要引入更高次數(shù)的項,模型選擇合適。同時模型的校正系數(shù)R2=98.74%,說明該模型能解釋大約98.74%的響應;相關系數(shù)R2=99.3%,說明該實驗誤差小,模型與實際預測擬合性好?？梢允褂迷撃Ｐ蛠矸治鲰憫档淖兓?。

對所得方程進行求解,可得到酵母菌生物量最大時的培養(yǎng)基最優(yōu)組合為:A蔗糖67.37 g/L,B酵母浸粉29.7 g/L,C玉米漿15.61 g/L,D KH2PO44.13 g/L,E MgSO40.3 g/L,該條件下的酵母干重最大值為9.00 g/L。在該點進行三次重復實驗,平均酵母干重8.88±0.08 g/L,是優(yōu)化前的馬克斯克魯維酵母生物量3.02 g/L的2.94倍。由此可知,響應面法優(yōu)化得到的培養(yǎng)基成分參數(shù)準確可靠。

2.2培養(yǎng)條件對馬克斯克魯維酵母增殖的影響

2.2.1 不同培養(yǎng)溫度對馬克斯克魯維酵母增殖的影響 溫度是微生物生長的重要因素之一。在一定程度上,升高溫度能提高酵母菌胞內(nèi)酶的活性,提高膜的流動性,增加酵母細胞對酒精毒性作用的敏感性[23]。

由圖6可以看出,實驗選擇優(yōu)化后的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度設定為26、28、30、32、34 ℃,于160 r/min,培養(yǎng)18 h后測定培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母生物量。馬克斯克魯維酵母的生物量隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,在30 ℃處達到最大值,與Miskiewicz和Borowiak等人[24]的研究一致。

圖6 不同溫度對馬克斯克魯維酵母生長的影響Fig.6 Effect of temperature on the growth of Kluyveromyces marxianus yeast

2.2.2 不同轉(zhuǎn)速對馬克斯克魯維酵母增殖的影響 轉(zhuǎn)速的大小直接決定了培養(yǎng)基中的供氧水平。由圖7可以看出,實驗選擇優(yōu)化后的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基,馬克斯克魯維酵母的生物量在轉(zhuǎn)速為180 r/min時最大,轉(zhuǎn)速高于或低于這一水平時,其生物量都會有所下降?？赡苡捎谵D(zhuǎn)速過高時,培養(yǎng)基流動形成的剪切力過大或者高轉(zhuǎn)速條件下空氣氧壓過大,導致菌體的破裂和死亡。

圖7 轉(zhuǎn)速對馬克斯克魯維酵母生長的影響Fig.7 Effect of agitation speed on the growth of Kluyveromyces marxianus yeast

圖8 pH對馬克斯克魯維酵母生長的影響Fig.8 Effect of pH on the growth of Kluyveromyces marxianus yeast

2.2.3 不同初始pH對馬克斯克魯維酵母增殖的影響 微生物都有生長最適pH范圍,許多酵母菌在pH4.5～6.5范圍內(nèi)長得很好。pH過高或過低都會對酵母菌細胞增殖造成影響[23]。

實驗選擇優(yōu)化后的培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基,為了確定酵母菌最佳pH,分別測定了培養(yǎng)基不同的初始pH時酵母菌的生物量,結果圖8所示,酵母菌最佳初始pH為6.0。

2.2.4 培養(yǎng)條件的正交實驗 培養(yǎng)條件正交實驗結果如表3所示。

表3 培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交實驗結果Table 3 The experimental results of orthogonal test for culture conditions

從表3的極差分析結果看,各因素對于菌體生物量的影響程度由大到小分別是RC>RA>RB,最佳生長組合為A2B2C1。因此,最優(yōu)組合為溫度30 ℃,初始pH6.0,轉(zhuǎn)速160 r/min,此條件下的菌體生物量(9.34±0.12) g/L。

2.3高密度優(yōu)化培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母乳飲品發(fā)酵鑒定

馬克斯克魯維酵母主要用于新型乳飲料的研制及風味物質(zhì)的制備,利用優(yōu)化培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)馬克斯克魯維酵母是否適應于乳飲品的發(fā)酵生產(chǎn),必須經(jīng)過實驗驗證。將高密度優(yōu)化培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母(A)與乳源培養(yǎng)基正常培養(yǎng)(B)的同一種馬克斯克魯維酵母,進行乳飲品發(fā)酵平行對比實驗[2]。于28 ℃培養(yǎng)24 h后,發(fā)酵期間的生長曲線,發(fā)酵結束后酒精含量、最終乳飲品的感官評定和揮發(fā)性風味物質(zhì)分析見圖9、表4、表5和表6。

圖9 馬克斯克魯維酵母在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長曲線Fig.9 Growth curves of Kluyveromyces marxianus in fermentation culture medium

酵母菌AB發(fā)酵24h后酒精含量(g/L)4.624.38

由圖9和表4可知,在發(fā)酵24 h 時間內(nèi),乳源培養(yǎng)基培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母B調(diào)整期為0～6 h,對數(shù)期在6～20 h,20 h活菌數(shù)達到最大值(7.39),發(fā)酵結束后酒精含量為4.38 g/L;高密度培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母A的調(diào)整期為0～4 h,對數(shù)期提前為4～16 h,16 h活菌數(shù)達到最大值(7.51),發(fā)酵結束后酒精含量為4.62 g/L,表明經(jīng)過高密度培養(yǎng)發(fā)酵的馬克斯克魯維酵母發(fā)酵活性略高于乳源培養(yǎng)基培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母。

由表5可知,在發(fā)酵乳飲品的顏色、味道、組織形態(tài)、氣味和總體評價方面,A的發(fā)酵乳感官分值略高于B的分值,但是差異不顯著,表明A與B發(fā)酵形成的發(fā)酵乳感官評定結果接近,優(yōu)化培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)馬克斯克魯維酵母A適宜于乳飲品發(fā)酵生產(chǎn)。

表5 發(fā)酵樣品感官評定結果Table 5 Evaluating result of sensory analysis of fermented samples

注:同一列中相同字母代表差異不顯著(p>0.05)。

乳飲品中的風味化合物主要是由微生物產(chǎn)生的酶類,通過分解乳品中蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等物質(zhì)而產(chǎn)生的[25]。從表6中可以得知,發(fā)酵風味成分主要是醇類、酯類、酸類和醛類等物質(zhì)。醇類主要有乙醇、丁醇和苯乙醇等;酯類物質(zhì)有乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等;酸類物質(zhì)有乙酸、辛酸等;醛類物質(zhì)有乙醛、苯甲醛等。

表6 2種發(fā)酵樣品中揮發(fā)性成分的氣-質(zhì)聯(lián)用分析結果Table 6 GC-MS analysis of volatile components in two fermented samples

注:表中* 為不含有該種物質(zhì)。

由表6可知,在A和B酵母菌發(fā)酵產(chǎn)物中醇類物質(zhì)種類相同,A產(chǎn)生的醇類物質(zhì)相對百分含量為51.67%,B產(chǎn)生的醇類物質(zhì)相對百分含量為47.53%;A酵母菌產(chǎn)生的酯類風味物質(zhì)比B酵母菌多了己酸乙酯這種中短碳鏈的脂肪酸乙酯,己酸乙酯具有水果的清香味,是我國食品添加劑使用衛(wèi)生標準允許使用的食用香料。因此,A酵母菌產(chǎn)生的酯類物質(zhì)呈現(xiàn)的風味比B產(chǎn)生的風味較豐富。在酸類和醛類揮發(fā)性物質(zhì)方面,A和B產(chǎn)生的這兩類風味物質(zhì)種類相同,各類物質(zhì)相對百分含量接近。

綜上所述,高密度優(yōu)化培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母與乳源培養(yǎng)基培養(yǎng)的同一馬克斯克魯維酵母發(fā)酵乳飲品在感官評定結果方面,兩種發(fā)酵乳感官分值差異不顯著,表明高密度馬克斯克魯維酵母菌適宜于乳飲品發(fā)酵。

3 結論

通過對馬克斯克魯維酵母增殖條件優(yōu)化,結果表明YPD培養(yǎng)基為馬克斯克魯維酵母高密度培養(yǎng)的最佳基礎培養(yǎng)基;優(yōu)化后高密度培養(yǎng)基成分為,蔗糖67.37 g/L,酵母粉29.7 g/L,玉米漿15.61 g/L,KH2PO44.13 g/L,MgSO40.3 g/L;培養(yǎng)條件為30 ℃、160 r/min、初始pH6.0。優(yōu)化后培養(yǎng)的馬克斯克魯維酵母生物量為(9.34±0.12) g/L,增殖效果明顯。利用高密度馬克斯克魯維酵母與乳源培養(yǎng)基培養(yǎng)馬克斯克魯維酵母進行乳飲品發(fā)酵對比實驗,兩者的口感風味無明顯差異,為將來馬克斯克魯維酵母擴培、凍干粉的生產(chǎn)和在乳制品的工業(yè)化應用,提供了可靠的研究基礎。

[1]范維,張咚咚,張彧,等.馬克斯克魯維酵母對發(fā)酵乳中糖代謝的影響[J].食品科學,2015,36(15):128-134.

[2]李新玲,顧瑞霞,閆輝,等.馬克斯克魯維酵母的篩選鑒定與應用[J].乳品加工,2013(15):44-46.

[3]陳成.克魯維酵母發(fā)酵乳清蛋白水解液生產(chǎn)乳清營養(yǎng)酒的研究[J].釀酒,2010,37(2):53-55.

[4]LealGA,GomesLH,Efraim P,et al. Fermentation of cacao seeds with a hybridKluyveromycesmarxianusstrain improved product quality attributes[J]. FEMS Yeast Research,2008,8(5):788-798.

[5]Gustavo Graciano Fonseca,Elmar Hein Zle,Christoph Wittmann,et al. The yeastKluyveromycesmarxianusand its biotechnological potential[J]. Microbiol Biotechnol,2008,79(3):339-354.

[6]Michael Crafack,Morten B. Mikkelsen,et al. Influencing cocoa flavour usingPichiakluyveriandKluyveromycesmarxianusin a defined mixed starter culture for cocoa fermentation[J]. International Journal of Food Microbiology，2013,167(1):103-116.

[7]Christian L?SER,Thanet URIT,Anton STUKERT. Formation of ethyl acetate from whey byKluyveromycesmarxianuson a pilot scale[J]. Journal of Biotechnology,2013,163(1):17-23.

[8]鄭苗,鄧澤元,任志青,等.東方伊薩酵母高密度培養(yǎng)的研究[J].中國食品學報,2016,16(4):96-103.

[9]黃翠姬,劉昭明,張淑智.含醇發(fā)酵乳工藝研究[J].四川食品與發(fā)酵,2007,43(5):47-51.

[10]楊紅敏.奶啤發(fā)酵工藝及其香氣成分研究[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學,2007,18-19.

[11]康遠軍.高耐性魯氏酵母高密度發(fā)酵研究[D].武漢:.湖北工業(yè)大學,2015,14-15.

[12]Francisco B. Pereira,Pedro M.R. Guimar?es,José A. Teixeira,Optimization of low-cost medium for very high gravity ethanol fermentations bySaccharomycescerevisiaeusing statistical experimental designs[J]. Bioresource Technology,2010(101):7856-7863.

[13]房賢坤,叢偉國,劉德林.布拉酵母高密度培養(yǎng)條件的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2012,40(23):11619-11620

[14]Jorgensen,H. Effect of nutrients on fermentation of pretreated wheat straw at very high dry matter content by Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochem. Biotechnol,2009,153(1):44-57.

[15]Xue C,Zhao XQ,Yuan WJ,et al. Improving ethanol tolerance of a self-flocculating yeast by optimization of medium composition. World[J]. Microbial Biotechnology,2008(24):2257-2261.

[16]Zhao XQ,Xue C,Ge XM,et al. Impact of zinc supplementation on the improvement of ethanol tolerance and yield of self-flocculating yeast in continuous ethanol fermentation[J]. Journal of Biotechnol,2009,139(1):55-60.

[17]Palukurty MA,Telgana NK,Bora HSR,et al. Screening and optimization of metal ions to enhance ethanol production using statistical experimental designs[J]. Journal of Microbial,2008,2(4):87-94.

[18]Hu CK,Bai FW,An LJ. Enhancing ethanol tolerance of a self-flocculating fusant ofSchizosaccharomycespombeandSaccharomycescerevisiaeby Mg2+via reduction in plasma membrane permeability[J]. Journal of Biotechnology,2003,25(14):1191-1194.

[19]Birch RM,Walker GM. Influence of magnesium ions on heat shock and ethanol stress responses ofSaccharomycescerevisiae[J]. Enzyme Microbial Technol,2000,26(9):678-687.

[20]Nahit AKTAS,HakkBOYACI,Mehmet MUTLU. Optimization of lactose utilization in deproteinated whey by Kluyveromyces marxianus using response surface methodology(RSM)[J]. Bioresource Technology,2006,97(18):2252-2259.

[21]De Coninck J,Bouquelet S,Dumortier V. Industrial media and fermentation processes for improved growth and protease production by Tetrahymena thermophila[J].Microbiol Biotechnol,2000,24(4):285-290.

[22]Anissa HADDAR,Nahed Fakhfakh-Zouari,Noomen HMIDET,et al. Low-cost fermentation medium for alkaline protease production byBacillusmojavensisA21 using hulled grain of wheat and sardinella peptone[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2010,110(3):288-294.

[23]LVA. Reddy,OVS Reddy. Effect of fermentation conditions on yeast growth and volatile composition of wine produced from mango(Mangifera indicaL.)fruit juice[J]. Food and Bioproducts Processing,2011,89(4):487-491.

[24]Miskiewicz T,Borowiak D.A logistic feeding profile for a Fed-Batch baker’s yeast process[J]. Electronic Journal of Polish a gricultural University,2005(8):1-13.

[25]Debebe Alemayehu,John A. Hannon,Olivia Mcauliffe. Characterization of plant-derived lactococci on the basis of their volatile compounds profile when grown in milk[J]. International Journal of Food Microbiology,2014(172):57-61.

OptimizationofhighdensityfermentationconditionsofKluyveromycesmarxianus

WANGLiang1,HUMan1,WANGJiang-yue1,GONGXiao-fen1,LIUPeng-long2,ZHANTao2,LIYang2

(1.Jiangsu University,School of Food and Biological Engineering,Zhenjiang 212013,China;2.Xinjiang Tianrun Biotechnology Co. LTD,Urumqi 830088,China)

The effects of high density fermentationKluyveromycesmarxianuson nutritional component and cultivation condition of culture medium was studied. Single factor experiment revealed that YPD as the basic medium for the proliferation ofKluyveromycesmarxianus. When the medium was 67.37 g/L sucrose,yeast extract 29.7 g/L,corn steep 15.61 g/L,KH2PO44.13 g/L,MgSO40.3 g/L,initial pH6,fermentation temperature was 30 ℃,stirring speed was 160 r/min,the fermentation biomass of 18 hKluyveromycesmarxianuswas (9.34±0.12) g/L by response surface analysis and culture condition orthogonal test. Fermented dairy experiments showed that there was no obvious difference in bacterial biomass,taste and flavor of fermented dairy produced by high density and skimmed milk medium cultureKluyveromycesmarxianus. Therefore,the optimized high density fermentation medium formula and process conditions were suitable for the cultivation of the yeastKluyveromycesmarxianus.

Kluyveromycesmarxianus;high-density fermentation;multiplication rate;solid-phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry

2017-02-21

王亮(1966-)，男，博士，研究員，主要從事食品微生物方面的研究，E-mail:wangliang_2004wl@163.com。

新疆生產(chǎn)建設兵團工業(yè)及高新技術科技攻關與成果轉(zhuǎn)換計劃項目(2015AB032)；江蘇大學高級專業(yè)人才科研啟動基金(12JDG069)。

TS201.3

:A

:1002-0306(2017)17-0111-09

10.13386/j.issn1002-0306.2017.17.022