傣百解體外細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)及其化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)△

李曉花，李海濤，金玲鈺，牛迎鳳，張麗霞

(西雙版納州傣藥南藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100)

·基礎(chǔ)研究·

傣百解體外細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)及其化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)△

李曉花，李海濤，金玲鈺，牛迎鳳，張麗霞*

(西雙版納州傣藥南藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100)

目的：研究傣百解不同溶劑提取物和不同萃取部位的體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性，探索活性部位的化學(xué)成分。方法：分別以水、50%乙醇水溶液、95%乙醇水溶液3種溶劑對(duì)傣百解進(jìn)行回流提取，采用系統(tǒng)溶劑法對(duì)傣百解95%乙醇水溶液提取物進(jìn)行萃取，采用SRB法測(cè)定不同濃度提取物和萃取部位對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901、人肝癌細(xì)胞HepG2、人宮頸癌細(xì)胞Hela、人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和人胰腺癌細(xì)胞SW1990 5種腫瘤細(xì)胞增殖的影響；采用試管法、紙反應(yīng)法等，對(duì)傣百解活性部位的化學(xué)成分進(jìn)行初步研究。結(jié)果：傣百解抗腫瘤活性部位為乙酸乙酯萃取部位，對(duì)SGC7901、HepG2、Hela和SKOV3腫瘤細(xì)胞增殖的IC50分別為8.5、20、18.2、12.2 μg·mL-1。乙酸乙酯部位可能含有甾體皂苷、揮發(fā)油和有機(jī)酸等化學(xué)成分。結(jié)論：傣百解95%乙醇水溶液提取物的乙酸乙酯萃取部位具有廣譜細(xì)胞毒活性，化學(xué)成分以甾體皂苷為主。

傣百解；細(xì)胞毒；預(yù)實(shí)驗(yàn)

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，癌癥是全世界一個(gè)主要死亡原因[1]。國(guó)家癌癥中心發(fā)布的《2015中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)每年新增癌癥病例約350萬(wàn)，約有250萬(wàn)人因此死亡[2]。中藥和民族藥是我國(guó)傳統(tǒng)藥的兩個(gè)重要組成部分，在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的作用特點(diǎn)。從傳統(tǒng)藥物中開(kāi)發(fā)應(yīng)用于腫瘤等疾病的藥物，與化學(xué)藥物相比，具有不良反應(yīng)少、不易產(chǎn)生抗藥性、有效緩解患者的痛苦、干預(yù)性好等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。

傣百解的原植物是蘿藦科牛奶菜屬植物通光散Marsdeniatenacissima(Roxh.)Moon，但《中國(guó)植物志》和《Flora of China》中收載的通光散的描述和插圖有誤，與傣百解的基原植物是不同種[5]。傣百解傣語(yǔ)稱“雅解先打”，意為解百毒的藥，在我國(guó)西雙版納、德宏等地，以及老撾、緬甸等國(guó)家的傣族居住區(qū)使用極其廣泛[6]。傣百解以根入藥，性涼、味苦，入火、土、風(fēng)塔，具有清火解毒、消腫止痛之功效，常用于咽喉腫痛、口舌生瘡、療瘍斑疹、肺熱咳嗽、胃脘痛、尿痛、解藥食毒；還可用于清除因飲食不潔、用藥不當(dāng)而致的各種不良反應(yīng)。傣百解為國(guó)藥準(zhǔn)字品種“雅解片”的主要組方中藥，同時(shí)也是西雙版納傣醫(yī)院多個(gè)院內(nèi)制劑如百解膠囊、版納涼劑、雅解嘎罕等的組方中藥[7]。傣百解臨床用于多種腫瘤的治療，因此，本文對(duì)傣百解不同溶劑提取物及不同萃取部位進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選，明確傣百解的活性部位，并對(duì)其化學(xué)成分類型進(jìn)行鑒別，以期明確傣百解體外細(xì)胞毒活性部位、對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的選擇抑制活性和可能的活性成分。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株

人胃癌細(xì)胞SGC7901、人肝癌細(xì)胞HepG2、人宮頸癌細(xì)胞Hela、人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和人胰腺癌細(xì)胞SW1990(中科院上海細(xì)胞庫(kù))。

1.2 儀器

CA-1390-1型超凈工作臺(tái)(上海凈化設(shè)備有限公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma Scientific(Marietta，OH，United States)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)；BT 124S型十萬(wàn)分之一天平(Sartorius公司)；SPECTRA MAX 190酶標(biāo)儀(Molecular Devices(Sunnyvale CA，USA)。

1.3 試劑與藥材

RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；SRB(Sigma-Aldrich，St Louis，Mo，USA)；二甲基亞砜[生工生物工程(上海)股份有限公司]；胎牛血清(FBS；Gaithersburg，USA)；胰蛋白酶(美國(guó)Amresco公司)；甲醇、乙醇等分析純?cè)噭?天津大茂化學(xué)試劑廠)；顯色劑均為實(shí)驗(yàn)室自配；陽(yáng)性對(duì)照藥：消癌平片(陜西科學(xué)院制藥廠，批號(hào)：140225)，紫杉醇(大連美倫生物，批號(hào)：A0818A)。

植物材料于2014年3月采自云南西雙版納州，經(jīng)本所張麗霞副研究員鑒定為通光散Marsdeniatenacissima(Roxh.)Moon，材料經(jīng)過(guò)粉碎成粗粉后備用。原標(biāo)本保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所標(biāo)本館(D20100720008)。

2 方法

2.1 傣百解的提取和萃取

2.1.1 不同溶劑提取物的制備 稱取傣百解根粉3份，每份50 g，分別加入10倍量的95%乙醇、50%乙醇水溶液和水回流提取3 h，提取液冷卻后過(guò)濾，減壓濃縮，得到95%乙醇水溶液提取物(DBJ-1)、50%乙醇水溶液提取物(DBJ-2)和水提取物(DBJ-3)。以上提取物用于體外抗腫瘤活性試驗(yàn)，明確傣百解的最佳提取溶劑。

2.1.2 95%乙醇水溶液提取物的制備及萃取 傣百解粉末適量，加入10倍量95%乙醇水溶液浸潤(rùn)，回流提取2 h，減壓濃縮，得到提取物。提取物用適量蒸餾水混懸后，依次用等量乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到乙酸乙酯部位(DBJ-4)、正丁醇部位(DBJ-5)和水部位(DBJ-6)。各極性部位進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性試驗(yàn)，明確傣百解具有細(xì)胞毒活性的部位。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組

正常對(duì)照組：培養(yǎng)細(xì)胞不加藥物處理，只加培養(yǎng)液。給藥組：分9個(gè)劑量組，在培養(yǎng)液中加入傣百解提取物，藥液終質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1、3、10、33、100、333、1000 μg·mL-1。陽(yáng)性對(duì)照組：培養(yǎng)液中加入含 0.1、0.3、1、3、10、33、100、333、1000 μg·mL-1的陽(yáng)性對(duì)照藥。

2.4 SRB法檢測(cè)不同提取物及極性部位對(duì)5種腫瘤細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞以含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，使細(xì)胞一直處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，密度1～5×104個(gè)·mL-1。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h，藥物設(shè)10個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，連續(xù)作用72 h。藥物作用結(jié)束后，用三氯乙酸(TCA)固定細(xì)胞，清洗后加入SRB工作液，洗滌，用Tris base溶解與蛋白結(jié)合的SRB，SPECTRAmax 190細(xì)胞標(biāo)儀565nm波長(zhǎng)下測(cè)定每個(gè)小孔的吸光度(A)值，空白對(duì)照孔加20 μL培養(yǎng)液。根據(jù)A值，按公式(1)計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率[8]。

抑制率(%)=(A對(duì)照—A用藥)/A對(duì)照×100%

用 Graphpad Prism5 軟件處理，計(jì)算出化合物的 IC50值。

2.5 活性部位化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)

活性部位用適量乙醇或甲醇溶解，過(guò)濾，得到的濾液采用試管法和紙反應(yīng)法檢查黃酮、蒽醌、香豆素、萜、甾體、強(qiáng)心苷、有機(jī)酸、酚等類成分[9]。

3 結(jié)果

3.1 傣百解不同提取物和萃取部位體外細(xì)胞毒活性

各提取物和95%乙醇水溶液提取物的各極性萃取部位的體外細(xì)胞毒IC50計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1，作用48 h后抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果見(jiàn)圖1。

表1 傣百解不同提取物和萃取部位體外細(xì)胞毒活性

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，傣百解最佳提取溶劑為95%乙醇水溶液，活性部位為95%乙醇水溶液提取物的乙酸乙酯萃取部位。體外細(xì)胞毒活性顯示，DBJ-4對(duì)5種腫瘤細(xì)胞株中的4種具有顯著抑制作用，作用于HepG2、SGC7901、Hela和SKOV3腫瘤細(xì)胞株的IC50分別為20、8.5、18.2、12.2 μg·mL-1。

3.2 DBJ-4化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用試管法、濾紙片法等檢測(cè)方法，觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，推測(cè)傣百解活性部位中可能存在的化學(xué)成分類型，結(jié)果顯示，DBJ-4中可能含有甾體皂苷、有機(jī)酸和強(qiáng)心苷類化合物。

4 討論

傣百解為傣族傳統(tǒng)用藥，臨床應(yīng)用廣泛，但缺少對(duì)傣百解藥效物質(zhì)和藥理學(xué)等的相關(guān)研究。

體外細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各提取物和萃取部位對(duì)人胰腺癌細(xì)胞SW1990均不顯示抑制活性。3種不同溶劑提取物中，傣百解95%乙醇水溶液提取物的體外抗腫瘤活性優(yōu)于50%乙醇水溶液提取物和水提取物，抑制作用強(qiáng)弱順序依次為胃癌SGC7901>宮頸癌Hela>肝癌HepG2>卵巢癌SKOV3，IC50分別為55、56、65、122 μg·mL-1；乙酸乙酯萃取部位抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)槲赴㏒GC7901>卵巢癌SKOV3>宮頸癌Hela>肝癌HepG2，IC50分別為8.5、12.2、18.2、20 μg·mL-1。水提取物、正丁醇部位和水部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，傣百解的活性部位具有廣譜細(xì)胞毒活性。

綜上表明，95%乙醇水溶液為傣百解最佳提取溶劑；提取物的乙酸乙酯萃取部位為其活性部位?；瘜W(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，傣百解中可能含有甾體皂苷、揮發(fā)油和有機(jī)酸成分，其中主要成分可能是甾體皂苷。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]，甾體皂苷具有抗腫瘤、抗真菌、防治心血管疾病、降血糖、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的藥理作用和重要的生物活性。蘿藦科植物中的主要化學(xué)成分為C21甾體皂苷，具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲、調(diào)節(jié)免疫功能、抗生育、抗癲癇、抗氧化和抑制乙酰膽堿酯酶等活性。由此推測(cè)，傣藥傣百解臨床用于腫瘤治療的有效物質(zhì)可能為其中含有的甾體皂苷類成分。項(xiàng)目組將繼續(xù)對(duì)傣百解活性部位的化學(xué)成分、抗腫瘤活性和作用機(jī)制進(jìn)行研究，進(jìn)一步闡明傣百解抗腫瘤的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制。

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InvitroCytotoxicityActivityandPreliminaryTestforChemicalComponentsfrom“Dai-Bai-Jie”(Marsdeniatenacissima)

LIXiaohua，LIHaitao，JINLingyu，NIUYingfeng，ZHANGLixia*

(KeyLaboratoryofDaiandSouthernmedicineofXishuangbannaDaiAutonomousPrefecture，YunnanBranchInstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciences，Jinghong，Yunnan666100，China)

Objective：To explore the cytotoxicity activity of different solvent extracts and fractions from “Dai-Bai-Jie”(Marsdeniatenacissima)，and identify the chemical components of activity fractions.Methods：“Dai-Bai-Jie” was extracted by water，50% ethanol-aqueous and 95% ethanol-aqueous by reflux method.95% ethanol-aqueous extract were extracted by ethyl acetate andn-butyl alcohol successively.The proliferation of SGC7901，HepG2，Hela，SKOV3 and SW1990 were detected by SRB method，and components of active fraction were studied by tube reaction and paper reaction methods.Results：Ethyl acetate extract was the active fraction，and the IC50were 8.5，20，18.2 and 12.2 μg·mL-1in SGC7901，HepG2，Hela，SKOV3 tumor cells.Steroidal saponins，volatile oil and organic acid may be existed in “Dai-Bai-Jie”.Conclusion：“Dai-Bai-Jie” has broad-spectrum cytotoxicity activity，and the main chemical components are steroidal saponins.

“Dai-Bai-Jie”；cytotoxicity activity；preliminary test

景洪市科技三項(xiàng)費(fèi)(2303-6140524)；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)基金(YZYN-15-01)

] 張麗霞，碩士，副研究員，研究方向：熱帶藥用植物種質(zhì)資源保護(hù)；E-mail：87050233@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.012

2016-06-29)

*[