大葉蛇葡萄提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制作用的研究△

黃靜，桂春，答國(guó)政，尚祥偉，明小芳，張秀橋

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065)

·基礎(chǔ)研究·

大葉蛇葡萄提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制作用的研究△

黃靜，桂春，答國(guó)政，尚祥偉，明小芳，張秀橋*

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065)

目的：研究大葉蛇葡萄葉及嫩莖提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響，篩選其有效抗腫瘤活性物質(zhì)。方法：采用MTT法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度的大葉蛇葡萄石油醚萃取物部位、乙酸乙酯萃取物部位及水溶性物部位，以及該植物中含有的蛇葡萄素、楊梅素、楊梅苷、大黃素及槲皮素分別作用24、48、72 h后對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果：乙酸乙酯萃取物部位和大黃素均能不同程度地抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖，乙酸乙酯萃取物部位對(duì)細(xì)胞的抑制作用在100 μg·mL-1時(shí)具有一定的時(shí)效關(guān)系，大黃素對(duì)細(xì)胞的抑制作用在40、80、160 μmol·L-1時(shí)也具有一定的時(shí)效關(guān)系，乙酸乙酯萃取物部位和大黃素作用SMMC-7721細(xì)胞72 h的IC50分別為110.81 μg·mL-1和53.20 μmol·L-1。結(jié)論：大葉蛇葡萄提取物具有較好的體外抗腫瘤活性。

大葉蛇葡萄；SMMC-7721細(xì)胞；增殖抑制

大葉蛇葡萄AmpelopsismegalophyllaDiels et.Gilg為葡萄科蛇葡萄屬植物，是湖北西部地區(qū)民間常用中草藥，又稱為“霉茶”，可用作茶的替代品[1]。課題組前期研究及文獻(xiàn)報(bào)道表明大葉蛇葡萄提取物具有降血壓[2]、降血糖[3]及抗病毒[4]等作用。近年來(lái)抗腫瘤藥物研究愈來(lái)愈受到人們的關(guān)注，而現(xiàn)代研究提示大葉蛇葡萄中含有的黃酮類成分具有良好的抗腫瘤作用[5]。本文采用MTT法研究了大葉蛇葡萄3種提取物和5種單體化合物對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的抑制作用，為其資源的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

大葉蛇葡萄采集于湖北省恩施州來(lái)鳳縣，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)張秀橋教授鑒定為葡萄科蛇葡萄屬植物大葉蛇葡萄AmpelopsismegalophyllaDiels et.Gilg，取其葉及嫩莖為實(shí)驗(yàn)研究材料；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素(美國(guó)Thermo公司)；小牛血清(NBS,杭州四季青生物工程材料有限公司)；二甲基亞砜(DMSO,美國(guó)Sigma公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，分析純,美國(guó) Amresco公司)。

1.2 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心),采用DMEM培養(yǎng)基(含10%小牛血清、100 μg·mL-1青霉素-鏈霉素)于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2～3 d傳代1次，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3 儀器

Galaxy s+CO2培養(yǎng)箱(英國(guó)RS Biotech公司)；IX51Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ClassⅡtype A2超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；CP114電子天平(美國(guó)Ohaus儀器有限公司)；iMark酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-RAD公司)。

2 方法

2.1 大葉蛇葡萄提取物及單體化合物的制備

將8.5 kg大葉蛇葡萄藥材粉碎，過(guò)篩后用8倍量70%乙醇水加熱回流提取2次，分別為1、0.5 h，合并提取液，減壓濃縮，得乙醇浸膏；浸膏用水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取至無(wú)色，分別合并萃取液，減壓濃縮得石油醚萃取物部位、乙酸乙酯萃取物部位和水溶性物部位。稱取乙酸乙酯部位浸膏200 g，采用硅膠柱、Sephadex LH-20柱色譜及重結(jié)晶等技術(shù)分離純化，分別得到蛇葡萄素、楊梅素、楊梅苷、大黃素及槲皮素等單體化合物。分別精密稱定上述適量提取物，DMSO配制成適當(dāng)濃度的儲(chǔ)備液，保存于4 ℃冰箱中，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋成所需的藥物濃度；部位提取物的質(zhì)量濃度分別設(shè)為6.25、12.5、25、50、100、200 μg·mL-1，單體化合物的濃度設(shè)為10、20、40、80、160、320 μmol·L-1。

2.2 大葉蛇葡萄對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

隨著科技和社會(huì)的不斷發(fā)展，材料驗(yàn)收方式也不斷得到創(chuàng)新，例如鋼材的驗(yàn)收方式，由之前的理計(jì)轉(zhuǎn)變?yōu)闄z尺和過(guò)磅相結(jié)合的方法，同時(shí)根據(jù)材料的不同，使用不同的檢查儀器對(duì)材料的質(zhì)量進(jìn)行更深層的驗(yàn)收。但不可否認(rèn)的是，現(xiàn)行的材料驗(yàn)收方式也存在著一些弊端。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，以5×103個(gè)·mL-1接種于96孔板，每孔100 μL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的樣品溶液100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組加培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后于每孔加MTT(5 mg·mL-1)20 μL，孵育4 h，吸去上清液，每孔加入100 μL的DMSO，放置于搖床上至每孔結(jié)晶物完全溶解。酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)量各孔的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，按公式(1)計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組]×100%

(1)

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 大葉蛇葡萄提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用

石油醚萃取物部位、乙酸乙酯萃取物部位和水溶性物部位分別對(duì)SMMC-7721細(xì)胞作用24、48、72 h 的增殖抑制作用結(jié)果見(jiàn)表1。當(dāng)藥物作用24 h后，在100～200 μg·mL-1時(shí)，乙酸乙酯萃取物部位對(duì)SMMC-7721的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，下同)，經(jīng)計(jì)算其抑制率分別為22.46%和74.62%；當(dāng)藥物作用48 h后，在50～200 μg·mL-1范圍內(nèi)，乙酸乙酯萃取物部位對(duì)SMMC-7721的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，經(jīng)計(jì)算其抑制率分別為9.68%、34.45%和72.52%；當(dāng)藥物作用72 h后，在50～200 μg·mL-1范圍內(nèi)，乙酸乙酯萃取物部位對(duì)SMMC-7721的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，經(jīng)計(jì)算其抑制率分別為11.89%、50.69%和83.37%。由以上可知，當(dāng)藥物質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1時(shí)，乙酸乙酯萃取物部位對(duì)SMMC-7721的抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，表現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性；經(jīng)計(jì)算得乙酸乙酯萃取物部位作用SMMC-7721細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為152.67、143.25、110.81 μg·mL-1，該部位為抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖的活性物質(zhì)部位。石油醚萃取物部位對(duì)SMMC-7721細(xì)胞有一定的抑制作用，SMMC-7721對(duì)水溶性物部位不敏感。

3.2 大葉蛇葡萄單體化合物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用

蛇葡萄素、楊梅素、楊梅苷、大黃素和槲皮素5種單體化合物分別作用于SMMC-7721細(xì)胞24、48、72 h后，對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用的結(jié)果見(jiàn)表2～4。由表2可知，當(dāng)受試化合物作用24 h后，在160～320 μmol·L-1時(shí)，蛇葡萄素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，經(jīng)計(jì)算其抑制率分別為13.14%和24.84%；在40～320 μmol·L-1范圍內(nèi)，大黃素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，經(jīng)計(jì)算其抑制率分別為24.23%、58.69%、48.29%和73.58%。由表3可知，當(dāng)受試化合物作用48 h后，在160～320 μmol·L-1時(shí)，蛇葡萄素、楊梅素和槲皮素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，經(jīng)計(jì)算蛇葡萄素的抑制率分別為21.99%和60.46%；在40～320 μmol·L-1范圍內(nèi)，大黃素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，經(jīng)計(jì)算其抑制率分別為43.27%、63.05%、58.93%和72.89%。由表4可知，當(dāng)受試化合物作用72 h后，在160～320 μmol·L-1時(shí)，蛇葡萄素、楊梅素和槲皮素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，經(jīng)計(jì)算蛇葡萄素的抑制率分別為28.18%和74.78%；在10～320 μmol·L-1范圍內(nèi)，大黃素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，經(jīng)計(jì)算其抑制率分別為8.30%、8.10%、59.50%、75.84%、74.68%和82.49%。以上結(jié)果提示，當(dāng)受試化合物濃度分別為160和320 μmol·L-1時(shí)，蛇葡萄素對(duì)SMMC-7721的增殖抑制作用隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，表現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性；經(jīng)計(jì)算得蛇葡萄素作用SMMC-7721細(xì)胞48、72 h的IC50分別為277.76和248.86 μmol·mL-1；當(dāng)受試化合物濃度分別為40、80、160 μmol·L-1時(shí)，大黃素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，分別表現(xiàn)出時(shí)間依賴性，即當(dāng)受試化合物作用時(shí)間為72 h時(shí)，大黃素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)；經(jīng)計(jì)算得大黃素作用SMMC-7721細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為118.63、88.41、53.20 μmol·L-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大黃素、蛇葡萄素、楊梅素及槲皮素均對(duì)SMMC-7721細(xì)胞有一定的增殖抑制作用，其中大黃素的作用最強(qiáng)。楊梅苷對(duì)SMMC-7721細(xì)胞無(wú)抑制作用。

質(zhì)量濃度/μg·mL-1A藥物作用24h藥物作用48h藥物作用72h石油醚萃取物部位乙酸乙酯萃取物部位水溶性物部位石油醚萃取物部位乙酸乙酯萃取物部位水溶性物部位石油醚萃取物部位乙酸乙酯萃取物部位水溶性物部位6.250.984±0.0251.011±0.0120.630±0.0551.123±0.0321.230±0.0351.195±0.0091.442±0.0361.619±0.0331.559±0.00812.50.977±0.0461.082±0.0450.923±0.0631.068±0.0821.216±0.0221.177±0.0491.475±0.0241.657±0.0311.446±0.111251.020±0.0130.994±0.0190.961±0.0331.173±0.0771.128±0.0201.240±0.0951.468±0.0151.625±0.0431.544±0.015501.045±0.0360.835±0.0060.961±0.0281.113±0.0141.054±0.021*1.219±0.0351.345±0.0081.344±0.010**1.462±0.0031000.890±0.0320.575±0.033**0.933±0.0531.293±0.1200.765±0.017**1.316±0.0381.216±0.010**0.752±0.020**1.529±0.0242000.950±0.0250.188±0.003**0.926±0.0390.748±0.011*0.321±0.019**1.315±0.0770.773±0.031**0.254±0.010**1.490±0.016細(xì)胞對(duì)照0.769±0.0400.742±0.0620.765±0.0291.157±0.0221.167±0.0131.147±0.0351.549±0.0221.525±0.0151.564±0.021

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。

樣品A10μmol·L-120μmol·L-140μmol·L-180μmol·L-1160μmol·L-1320μmol·L-1細(xì)胞對(duì)照蛇葡萄素1.090±0.0121.063±0.0381.134±0.0151.148±0.0070.928±0.026*0.803±0.054**1.068±0.018楊梅素1.168±0.0281.091±0.0371.062±0.0461.187±0.0271.132±0.0280.887±0.055**1.067±0.011楊梅苷1.035±0.0181.059±0.0651.094±0.0161.212±0.0221.030±0.0131.026±0.0161.066±0.093大黃素1.200±0.0261.202±0.0050.833±0.034**0.454±0.006**0.568±0.012**0.290±0.018**1.099±0.004槲皮素1.095±0.0160.964±0.0211.002±0.0381.066±0.0170.940±0.0080.976±0.0191.045±0.047

樣品A10μmol·L-120μmol·L-140μmol·L-180μmol·L-1160μmol·L-1320μmol·L-1細(xì)胞對(duì)照蛇葡萄素1.445±0.0271.488±0.0071.433±0.0311.380±0.0411.094±0.015**0.554±0.014**1.402±0.014楊梅素1.435±0.0161.453±0.0071.443±0.0171.360±0.0561.159±0.043**0.941±0.010**1.401±0.007楊梅苷1.429±0.0051.510±0.0091.467±0.0141.469±0.0211.491±0.0151.122±0.004**1.400±0.002大黃素1.326±0.0281.359±0.0230.763±0.006**0.497±0.012**0.552±0.004**0.365±0.024**1.345±0.006槲皮素1.431±0.0291.440±0.0191.277±0.0071.204±0.005*1.118±0.014**0.956±0.018**1.324±0.027

樣品A10μmol·L-120μmol·L-140μmol·L-180μmol·L-1160μmol·L-1320μmol·L-1細(xì)胞對(duì)照蛇葡萄素1.686±0.0151.804±0.0021.848±0.0381.743±0.0231.124±0.015**0.395±0.009**1.565±0.029楊梅素1.691±0.0221.756±0.0161.840±0.0081.767±0.0131.421±0.013**0.805±0.013**1.563±0.023楊梅苷1.616±0.0201.692±0.0091.771±0.0071.849±0.0051.946±0.0111.407±0.021**1.563±0.019大黃素1.430±0.013**1.433±0.031**0.631±0.006**0.377±0.018**0.395±0.002**0.273±0.020**1.559±0.010槲皮素1.662±0.0051.631±0.0301.658±0.0141.406±0.0251.199±0.005**0.948±0.018**1.514±0.008

4 討論

腫瘤已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一[6]，而目前治療腫瘤的藥物多為化學(xué)藥，久用會(huì)產(chǎn)生耐藥性且伴隨毒副作用[7]。故從天然植物中尋找抗腫瘤藥物是現(xiàn)代醫(yī)藥的發(fā)展方向[8]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明大葉蛇葡萄中的乙酸乙酯和石油醚萃取物部位、蛇葡萄素、楊梅素、大黃素和槲皮素對(duì)SMMC-7721均有一定的增殖抑制作用，其中乙酸乙酯萃取物部位和大黃素的抑制作用較強(qiáng)。乙酸乙酯萃取物部位對(duì)SMMC-7721的抑制作用最高,可達(dá)83.37%，而大黃素在一定濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的時(shí)效關(guān)系。當(dāng)作用72 h時(shí)，IC50為53.20 μmol·L-1。但其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，大葉蛇葡萄提取物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，這為更深入地研究大葉蛇葡萄的抗腫瘤作用奠定了良好基礎(chǔ)。

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InhibitoryEffectofAmpelopsismegalophyllaExtractsonSMMC-7721CellsProliferation

HUANGJing，GUIChun，DAGuozheng，SHANGXiangwei，MINGXiaofang，ZHANGXiuqiao*

(SchoolofPharmaceuticalSciences，HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China)

Objective：To explore the inhibitory effect of leaves and tender stem extracts ofAmpelopsismegalophyllaon SMMC-7721 cells proliferation and screen the anti-tumor active ingredientsinvitro.Methods：Petroleum ether，ethyl acetate(EtOAc)and aqueous extracts ofA.megalophyllaas well as five compounds，ampelopsin，myricetin，myricetrin，emodin and quercetin were selected to treat SMMC-7712 at different concentration for 24,48,72 h through MTT assay，respectively.Results：Treatment with EtOAc extract or emodine inhibited the cell proliferation in different degrees.EtOAc extract and emodin could inhibit cell proliferation in a time-effect relationship in 100 μg·mL-1and in 40,80 and 160 μmol·L-1，respectively.IC50of EtOAc extract and emodin on SMMC-7721 cells in 72 h were 110.81 μg·mL-1and 53.20 μmol·L-1.Conclusion：Extracts ofA.megalophyllahas good anti-tumor activityinvitro.

Ampelopsismegalophylla；SMMC-7721 cells；inhibitory proliferation

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170335)；湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2014CFA083)

] 張秀橋，教授，研究方向：中藥品種、質(zhì)量及資源開(kāi)發(fā)；E-mail：qiaoxzh2000@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.011

2016-06-22)

*[