左旋龍腦對UVB輻射后小鼠皮膚光損傷的影響△

李小婷，王丹，龐玉新,4*，楊全，范佐旺，馬青松，許羅鳳

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737； 2.海南省艾納香工程技術(shù)研究中心，海南 儋州 5717373； 3.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006;4.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

·基礎(chǔ)研究·

左旋龍腦對UVB輻射后小鼠皮膚光損傷的影響△

李小婷1，2，3，王丹1，2，龐玉新1，2,4*，楊全3，范佐旺1，2，3，馬青松1，2，3，許羅鳳1，2，3

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737； 2.海南省艾納香工程技術(shù)研究中心，海南 儋州 5717373； 3.廣東藥學(xué)院 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006;4.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

目的：研究左旋龍腦對中波紫外線(UVB)照射后小鼠皮膚光損傷的影響。方法：通過UVB照射Balb/c小鼠建立光損傷模型，創(chuàng)面外用左旋龍腦，每天1次，連續(xù)給藥11 d；在傷后不同時相點取材，HE染色觀察皮膚組織的病理變化，對皮膚紅斑、水腫反應(yīng)進(jìn)行評分；測定左旋龍腦對創(chuàng)面愈合時間、組織含水量、8-OHdG、IL-6和NF-κB的影響。結(jié)果：與正常組相比，光損傷小鼠紅斑、水腫指數(shù)明顯增加；與模型組相比，左旋龍腦組紅斑、水腫指數(shù)明顯減輕，結(jié)痂脫落時間減少，皮膚組織中8-OHdG、IL-6和NF-κB的水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)；HE染色顯示模型小鼠皮膚表皮增厚明顯，伴炎性細(xì)胞浸潤，經(jīng)左旋龍腦處理后，上述病理改變減輕。結(jié)論：左旋龍腦可能通過清除光產(chǎn)物8-OHdG、抑制NF-κB對IL-6的釋放的調(diào)節(jié)作用，使光損傷組織中IL-6下降而起抗炎作用，促進(jìn)光損傷傷口愈合。

左旋龍腦；紫外線；光損傷；IL-6；NF-κB

皮膚受到290～320 nm的中波紫外線照射可誘發(fā)諸多光源性皮膚損傷，例如光老化、皮膚癌、光敏反應(yīng)和光毒反應(yīng)、光線性角化等[1]。因此，開發(fā)減緩和改善皮膚光損傷的藥物就顯得尤為重要。艾納香來源于菊科艾納香屬植物艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.，是我國著名的黎藥和苗藥，其主要成分左旋龍腦(L-borneol)有著廣泛的生物活性，如抑菌[2]、抗炎、抗血栓、抗腫瘤、修復(fù)DNA等[3]，對保護(hù)腦組織[4]、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)[5]極為有效，然而對其光損傷治療方面的研究卻很少。由于8-羥基脫氧鳥嘌呤核苷(8-OHdG)是UV輻射導(dǎo)致的主要光產(chǎn)物之一，而白細(xì)胞介素-6(IL-6)和核轉(zhuǎn)錄因子-Kappa B(NF-κB)是紫外損傷的兩個重要細(xì)胞因子[6]，為了觀察左旋龍腦的抗光損傷效果，本實驗應(yīng)用Balb/c小鼠制備光損傷模型，觀察左旋龍腦對皮膚組織中8-OHdG、IL-6和NF-κB的影響，為左旋龍腦抗光損傷的研究及其藥用價值的開發(fā)提供參考。

1 材料與儀器

1.1 動物

Balb/c小鼠(4～6周)，80只，雌性，體重18～22 g，購自湖北省實驗動物研究中心，生產(chǎn)許可證：SCXK(鄂)2015-0018。

1.2 藥物與試劑

左旋龍腦(Alfa Aesar A Johnson Matthey Company，純度：98%，批號：10147015)。

小鼠8-OHdG(批號：201505)、IL-6(批號：201505)、NF-κB(批號：201505)ELISA試劑盒，購自北京鑫方程生物技術(shù)有限公司；其他相關(guān)溶劑均為分析純，購自西隴化工股份有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

TL20W/12RS UVB紫外線燈管(荷蘭PHILIPS公司)；UV-340A紫外線照度計(臺灣Lutron Electronics公司)；ELX 800酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；Sartorius CPA225D電子分析天平；DU-800紫外分光光度計(美國Beckman Coulter公司)；TGF-16G型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；FSH-Ⅱ型高速電動勻漿器(江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠)；RM 2235型手動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(Leica公司)；Axio Imager M2型正置顯微鏡(Zeiss公司)。

2方法

2.1 模型的建立與分組給藥

將小鼠隨機(jī)分為4組，即空白對照組、模型組、溶劑組(85%乙醇)與左旋龍腦組(以85%乙醇為溶劑稀釋左旋龍腦至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%)，每組20只動物。參考Chiang-Wen Lee[7]與Lucas Almeida Rigo[8]的研究方法，實驗前2 d剪去背部脊柱兩側(cè)體表長毛，面積約為3.0 cm×3.0 cm，用8%硫化鈉進(jìn)行脫毛。每次照射前，用改裝過的小鼠固定器先固定好小鼠，然后暴露剃毛區(qū)，其余非照射部位用防輻射布遮蓋。

除空白對照組外，對其余各組小鼠進(jìn)行以下處理：開啟UVB紫外線燈，預(yù)熱15 min，固定光源距小鼠背部距離約為20 cm，照射時間為40 min，照射強(qiáng)度為0.25 mW·cm-2，輻照量為600 mJ·cm-2；照射期間停止給水給食，照射后0.5 h恢復(fù)；照射后30 min起，開始于照射部位均勻涂抹藥物125 μL·(10 g)-1[9]。模型組除照射UVB外不作其他處理，溶劑組給予等體積85%乙醇溶液。溶劑組和左旋龍腦組每天給藥1次，連續(xù)給藥11 d。分別于照射后第1、4、7、11 d 4個時相點，每組每次處死4只小鼠，取小鼠背部曬傷處皮膚全層，無菌刀片去除皮下組織。將皮膚組織平均分為3份，分別用于皮膚形態(tài)學(xué)、組織含水量及炎癥因子的檢測。

2.2 小鼠皮膚組織病理學(xué)觀察

切取小鼠照射部位處皮膚組織標(biāo)本制成石蠟切片，經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察皮膚表皮層厚度及炎癥細(xì)胞情況；采用AxioVision Rel.4.8軟件測量皮膚組織表皮層厚度，在表皮層厚度無明顯變化處測量4個連續(xù)而不重疊的高倍鏡視野(×400)下的表皮層厚度，再于同一個高倍鏡視野下等間隔測量10處表皮層厚度，取平均值以此作為表皮層厚度的量化指標(biāo)。

2.3 小鼠皮膚紅斑、水腫評分

每天給藥1 h后以及再次給藥0.5 h前，肉眼觀察小鼠背部皮膚照射處的傷口變化，主要為紅斑和水腫情況，按表1標(biāo)準(zhǔn)對紅斑及水腫情況進(jìn)行評分。

2.4 小鼠創(chuàng)面結(jié)痂脫落時間觀察

每天給藥1 h后以及再次給藥0.5 h前，肉眼觀察小鼠背部照射處的傷口變化，包括結(jié)痂、皴裂、起皺、脫屑等現(xiàn)象，不斷記錄，并對小鼠背部脫毛區(qū)紫外線照射部位皮膚進(jìn)行圖像采集，直到傷口上的焦痂脫落，將結(jié)痂完全脫落的時間記為小鼠創(chuàng)面結(jié)痂脫落時間。

2.5 小鼠背部皮膚組織含水量測定

每只小鼠取相同部位照射處皮膚，約100 mg，用濾紙吸干血液，以電子天平稱濕質(zhì)量。然后放于80 ℃烤箱烘烤24 h，取出稱干質(zhì)量，干濕法計算皮膚組織含水量。計算公式如下：

2.6 ELISA法檢測小鼠皮膚組織中8-OHdG、IL-6和NF-κB含量

取照射處皮膚約100 mg，濾紙吸去血跡，稱重，放入0.9%氯化鈉溶液中，按100 mg組織加1 mL 0.9%氯化鈉溶液的比例碾磨制成勻漿。4 ℃，10 000 r·min-1條件下離心15 min，將離心好的勻漿留上清液丟棄沉淀，置于-80 ℃保存。采用ELISA法檢測皮膚組織上清液中8-OHdG、IL-6和NF-κB的含量，具體操作步驟按試劑盒說明書要求進(jìn)行。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 左旋龍腦對光損傷小鼠皮膚組織病理學(xué)的影響

空白對照組的小鼠皮膚表皮層較薄，細(xì)胞分層清晰，細(xì)胞成分及數(shù)量適中。與空白組比較，模型組小鼠表皮層厚度顯著增加(P<0.01)，細(xì)胞分層不清；胞質(zhì)嗜伊紅色，核固縮、變形；真皮層偶見中性粒細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象。與模型組、溶劑組比較，左旋龍腦組在給藥7 d后顯著抑制紫外線損傷所致小鼠表皮角質(zhì)化與浸潤，表皮層厚度顯著降低(P<0.01)，見圖1、表2。

注：黑色箭頭代表表皮層厚度。圖1 左旋龍腦對光損傷小鼠皮膚組織病理學(xué)的影響(×400)

組別表皮層厚度/μm1d4d7d11d空白對照組21.32±3.4422.65±2.2020.43±3.4521.61±2.56模型組121.21±7.28##109.58±11.61##103.05±9.00##90.69±7.10##溶劑組116.45±4.82103.67±6.9996.48±3.43*74.20±5.92**左旋龍腦組98.96±6.89**DD88.97±7.07**DD49.39±7.73**DD34.08±3.68**DD

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與溶劑組比較，P<0.05，P<0.01；下同。

3.2 左旋龍腦對光損傷小鼠皮膚紅斑、水腫評分的影響

與空白對照組比較，模型組紅斑與水腫評分均顯著增加(P<0.01)，提示造模成功；在整個觀察過程中，皮膚紅斑及水腫評分呈現(xiàn)先升后降趨勢，至4 d時達(dá)到峰值，之后評分逐漸下降，提示此時皮膚的損傷程度在逐漸恢復(fù)，左旋龍腦可在一定程度上改善皮膚的紅斑與水腫情況。在11 d時尤為明顯，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見圖2。

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與溶劑組比較，P<0.05，P<0.01；下同。圖2 各處理組不同時相點紅斑、水腫評分

3.3 左旋龍腦對光損傷小鼠創(chuàng)面結(jié)痂脫落時間的影響

空白對照組小鼠皮膚光滑細(xì)膩，未見明顯病理性變化；與空白對照組比較，模型組和溶劑組小鼠背部脫毛處皮膚出現(xiàn)結(jié)痂、皴裂、起皺等現(xiàn)象，去表皮后創(chuàng)面呈淺紅或紅白相間；左旋龍腦組結(jié)痂面積逐漸縮小，結(jié)痂脫落平均時間為8 d，明顯快于模型組、溶劑組。提示左旋龍腦可加速傷口結(jié)痂脫落，促進(jìn)新皮形成，從而促進(jìn)光損傷創(chuàng)面的修復(fù)，見圖3、4。

圖3 左旋龍腦對光損傷小鼠創(chuàng)面結(jié)痂脫落時間的影響

3.4 左旋龍腦對光損傷小鼠皮膚創(chuàng)面組織含水量的影響

紫外線照射后，模型組創(chuàng)面組織含水量均低于空白對照組，至第11 d，模型組創(chuàng)面組織含水量與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組、溶劑組比較，左旋龍腦組皮膚創(chuàng)面組織含水量顯著增加(P<0.05，P<0.01)，提示左旋龍腦抵抗紫外損傷的作用與減少皮膚水分流失有關(guān)，見表3。

3.5 左旋龍腦對光損傷小鼠皮膚組織中8-OHdG的影響

在整個觀察周期中，除空白對照組處于穩(wěn)定值外，其他3組8-OHdG含量總體呈上升趨勢。與空白對照組比較，模型組8-OHdG含量顯著升高(P<0.01)，而在第1、2、4、7、11天 5個時相點，左旋龍腦組8-OHdG含量均顯著低于模型組和溶劑組(P<0.05，P<0.01)，表明左旋龍腦在光損傷后能夠有效減少皮膚中光產(chǎn)物8-OHdG的堆積，見表4。

圖4 左旋龍腦對光損傷小鼠創(chuàng)面愈合的影響

組別創(chuàng)面組織含水量(%)1d2d4d7d11d空白對照組63.32±5.8762.10±7.0461.16±0.6460.65±3.6161.38±3.09模型組62.04±6.6558.36±5.9257.85±6.7357.48±3.0456.17±3.32#溶劑組65.85±2.6363.95±5.7961.83±4.7160.44±6.2758.41±0.69左旋龍腦組68.40±3.14*67.39±4.59*73.13±3.34**DD68.71±2.74**DD69.29±5.10**DD

表4 傷后不同時相點各組皮膚組織中8-OHdG水平的比較

3.6左旋龍腦對光損傷小鼠皮膚組織中IL-6的影響

照射后前2 d，與空白對照組相比，模型組IL-6表達(dá)顯著增加(P<0.01)；隨著時間延續(xù)，各組IL-6含量逐漸降低，第4 d起，模型組與空白組間IL-6含量已無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；以左旋龍腦處理后，IL-6含量顯著降低，與模型組、溶劑組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)(見表5)，提示左旋龍腦可增強(qiáng)光損傷機(jī)體抑制炎癥因子釋放的能力。

表5 傷后不同時相點各組皮膚組織中IL-6水平的比較

3.7 左旋龍腦對光損傷小鼠皮膚組織中NF-κB的影響

在光損傷初期，各組組織中NF-κB水平差異較大，隨著時間延續(xù)，各組小鼠皮膚NF-κB水平呈下降趨勢，且差異變小；與空白對照組比較，模型組NF-κB水平顯著升高(P<0.01)；前4 d左旋龍腦組NF-κB水平下降，與模型組和溶劑組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，提示左旋龍腦在光損傷早期對NF-κB抑制作用明顯，見表6。

表6 傷后不同時相點各組皮膚組織中NF-κB水平的比較

4 討論

紫外線誘導(dǎo)的光損傷是造成皮膚疾病的重要因素[10]。本實驗采用Balb/c小鼠光損傷模型，研究左旋龍腦抵抗光損傷的效果，實驗結(jié)果顯示，左旋龍腦能顯著抑制UVB誘導(dǎo)表皮增厚與炎性細(xì)胞浸潤，加速光損傷創(chuàng)面結(jié)痂脫落，促進(jìn)傷口愈合，減少發(fā)紅、干燥、脫屑、含水量減少等現(xiàn)象。研究結(jié)果表明，左旋龍腦能夠促進(jìn)光損傷修復(fù)。另外，UVB輻射有一定的促細(xì)胞腫脹作用[11]，這是UVB輻射引起皮膚炎癥產(chǎn)生的可能機(jī)制之一，左旋龍腦處理后表皮層厚度顯著減少從而降低炎癥發(fā)生。

8-OHdG是UVB損傷皮膚細(xì)胞DNA而產(chǎn)生的主要光產(chǎn)物之一，反映了整個機(jī)體平均的氧化損傷率及體內(nèi)DNA氧化損傷與機(jī)體正常的修復(fù)作用[12]。IL-6是一種炎性細(xì)胞因子，具有廣泛的生物學(xué)活性，作為角質(zhì)形成細(xì)胞-成纖維細(xì)胞相互作用環(huán)路中的重要中介物質(zhì)[13]，參與UVB誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的機(jī)制，與UV輻射引起的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。當(dāng)受到UV等外來因素刺激時，可誘導(dǎo)包括自身在內(nèi)的多種細(xì)胞因子(IL-1，TNF-α)以及一些炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，形成惡性循環(huán)，損傷組織，繼而加重炎癥反應(yīng)[14]。NF-κB是一種與炎癥有關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞中通常以非活性的狀態(tài)存在，當(dāng)接受UV和炎癥因子刺激后，活化的NF-κB轉(zhuǎn)入巨噬細(xì)胞核中，調(diào)高炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，使炎癥因子的合成和釋放增加，加重炎癥反應(yīng)[15]。UVB輻射對角質(zhì)形成細(xì)胞NF-κB的激活主要是通過胞漿IКB-α蛋白(Kappa B抑制蛋白)降解來實現(xiàn)的[16]。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與其抑制劑IКB-α蛋白以無活性的復(fù)合物形式存在，當(dāng)受到UV刺激時，通過激活一系列激酶使IКB-α磷酸化從而使NF-κB與IКB-α發(fā)生解離，UV輻射活化NF-κB刺激前炎癥因子，誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子通過細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體活化，從而放大UV效應(yīng)，進(jìn)一步加劇細(xì)胞受損[17-18]。

本實驗中，與空白對照組比較，模型組中8-OHdG顯著增加，而左旋龍腦組與模型組比較8-OHdG明顯降低，這說明左旋龍腦能明顯降低光損傷小鼠皮膚的8-OHdG水平。有文獻(xiàn)報道[19]，UVB輻射誘導(dǎo)的DNA損傷可造成額外的炎癥壓力，進(jìn)一步加重皮膚損傷。由此可見，左旋龍腦減少DNA損傷光產(chǎn)物產(chǎn)量的特性在一定程度上加強(qiáng)了其抗炎作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，左旋龍腦組IL-6、NF-κB均顯著降低，這說明隨著8-OHdG的減少，IL-6生成和釋放減少，IL-6的減少使對NF-κB的激活度減弱，抑制了NF-κB的核轉(zhuǎn)位，使NF-κB活化水平下調(diào)，NF-κB的表達(dá)亦隨之下降，這在一定程度上抑制了IL-6對自身的正向調(diào)控作用，使IL-6的生成量降低，從而減輕炎癥反應(yīng)。因此認(rèn)為左旋龍腦可能通過修復(fù)DNA損傷、減少光產(chǎn)物8-OHdG積累、抑制NF-κB對IL-6釋放的調(diào)節(jié)作用，使光損傷組織中IL-6下降從而減少光損傷發(fā)生，促進(jìn)傷口愈合。

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EeffectsofL-borneolonUVB-inducedPhoto-damagesinSkinofBalb/cMice

LIXiaoting1，2，3，WANGDan1，2，PANGYuxin1，2,4*，YANGQuan3，F(xiàn)ANZuowang1，2，3，MAQingsong1，2，3，XULuofeng1，2，3

(1.TropicalcropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences，Danzhou571737，China； 2.HainanProvincialEngineeringResearchCenterforBlumeaBalsamifera，Danzhou571737，China； 3.SchoolofTraditionalChineseMedicine，GuangDongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China; 4.NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

Objective：To study effects ofL-borneol on interleukin-6(IL-6)and nuclear factor kappa-B(NF-κB)in UVB irradiation-induced mice.Methods：Eighty of Balb/c mice were randomly divided into four groups.Photo-damaged mouse model was established by UVB irradiation.L-borneol was adopted for wounds once every day for 11 days.The pathological changes of the photo-damaged skin tissue were observed by HE staining.Samples were collected at different time points after UVB irradiation to assess healing time，tissues water content，erythema and edema.The levels of 8-hydroxy-desoxyguanosine(8-OHdG)，IL-6 and NF-κB in the epidermis were detected by ELISA.Results：Compared with the normal group，the erythema and edema indexes increased significantly in the UVB model group.The erythema and edema indexes，IL-6 and NF-κB levels in mice with acute UVB exposure significantly reduced after treatment withL-borneol.Further more，HE staining showed that UVB irradiation induced keratinocyte hyperplasia，sunburn cell formation and inflammatory cell infiltration.After treatment withL-borneol，these histological abnormalities were alleviated.In addition，the topical application ofL-borneol resulted in a significant decrease in UVB-induced increases of epidermis thickness，especially depressing in UVB mediated generation of 8-OHdG(P<0.05，P<0.01).Conclusion：It is considered thatL-borneol could alleviate the symptoms of photo-damages by UVB irradiation.One principle of the effects could be thatL-borneol removed of light products 8-OHdG，than controlled NF-κB regulation on release of IL-6 and lead to fall of IL-6 level in photo-damaged tissue causing role of anti-photo-damage.

L-borneol；ultraviolet B；photo-damage；IL-6；NF-κB

科技部科研院所技術(shù)開發(fā)研究專項(2013EG134239)；貴州省重大科技專項計劃項目(6011-2013)

] 龐玉新，研究員，博士，研究方向：南藥資源研究與開發(fā)；Tel：(0898)23300268，E-mail：blumeachina@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.010

2016-06-05)

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