UPLC-MS同時(shí)測(cè)定蒙藥材藍(lán)刺頭中6個(gè)成分的含量△

麻劍南，馬超美，田志杰，劉衛(wèi)東*

(1.內(nèi)蒙古盛唐國際蒙醫(yī)藥研究院有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；3.內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

·基礎(chǔ)研究·

UPLC-MS同時(shí)測(cè)定蒙藥材藍(lán)刺頭中6個(gè)成分的含量△

麻劍南1，馬超美2，田志杰3，劉衛(wèi)東1*

(1.內(nèi)蒙古盛唐國際蒙醫(yī)藥研究院有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；3.內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

目的：建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS)同時(shí)測(cè)定蒙藥材藍(lán)刺頭中綠原酸、1，5-二咖啡?？鼘幩?、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡?？鼘幩帷⑶鄄怂睾颓鄄怂?7-O-葡萄糖苷含量的方法。方法：樣品分析采用Agilent 6430液質(zhì)聯(lián)用儀；色譜柱為Agilent ZORBAX RRHD Ecilipse Plus-C18；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-甲醇，梯度洗脫；離子源為電噴霧電離源(ESI)；采用負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。結(jié)果：綠原酸、3,5-二咖啡?？鼘幩?、1,5-二咖啡?？鼘幩?、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、4,5-二咖啡?？鼘幩岷颓鄄怂胤謩e在1.25～40.00(r=0.999 0)、0.94～30.00(r=0.999 8)、0.94～30.00(r=0.999 8)、0.16～5.00(r=0.999 7)、0.16～5.00(r=0.999 9)、0.02～2.50(r=0.999 5)μg·mL-1線性關(guān)系良好；加樣回收率為99.80%～102.97%，RSD為1.23%～2.98%。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)、精密度高、重復(fù)性好，為蒙藥材藍(lán)刺頭的成分研究提供科學(xué)參考。

藍(lán)刺頭；綠原酸類；黃酮類；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；含量測(cè)定

藍(lán)刺頭EchinopslatifoliusTausch.為菊科藍(lán)刺頭屬植物，為中藥禹州漏蘆的基原植物之一，其干燥根具有清熱解毒、消癰、下乳、舒筋通脈的功能[1]。而其干燥頭狀花序則為常用蒙藥，名為“藍(lán)刺頭”，蒙藥名“烏日格斯圖-呼和”，具有固骨質(zhì)、接骨愈傷、清熱解痛的功效[2-4]。中藥材禹州漏蘆化學(xué)成分和藥理作用較明確[5-7]，并已被2015版《中華人民共和國藥典》收錄。入藥部位不同的蒙藥材藍(lán)刺頭，被《內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)》、《中華本草·蒙藥卷》、《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)》收錄，尚未被《中華人民共和國藥典》收錄，且還未見相關(guān)成分含量測(cè)定的研究報(bào)道。

本研究首次利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS)技術(shù)，對(duì)藍(lán)刺頭的6個(gè)化學(xué)成分綠原酸、1，5-二咖啡?？鼘幩?1，5-DCQA)、3，5-二咖啡?？鼘幩?3，5-DCQA)、4，5-二咖啡酰奎寧酸(4，5-DCQA)、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷進(jìn)行了含量測(cè)定，其中3個(gè)二咖啡?？鼘幩犷惓煞譃槭状卧谒{(lán)刺頭中報(bào)道。本研究旨在借助現(xiàn)代技術(shù)，為明確藍(lán)刺頭的成分和提升民族藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 試藥

蒙藥材藍(lán)刺頭分別購自安國市義通中藥材有限公司(批號(hào)：20150906，產(chǎn)地：河北)和濟(jì)南人和中藥飲片有限公司(批號(hào)：20140205，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古)，經(jīng)內(nèi)蒙古盛唐國際蒙醫(yī)藥研究院有限公司張樹森教授鑒定為菊科藍(lán)刺頭EchinopslatifoliusTausch.的干燥花序。

對(duì)照品綠原酸(批號(hào)：NO.15082721)、3，5-二咖啡酰奎寧酸(批號(hào)：NO.15111925)，4，5-二咖啡酰奎寧酸(批號(hào)：NO.15081422)、芹菜素-7-O-葡萄糖苷(批號(hào)：NO.15062321)購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司，1，5-二咖啡酰奎寧酸(北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：15080115)，芹菜素(中國食品藥品鑒定研究院，批號(hào)：111901-201102)，6個(gè)對(duì)照品純度均大于98%；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純化水。

1.2 儀器

超高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS)：分析用Agilent 1290 infinity UPLC系統(tǒng)，連接有6430三級(jí)串聯(lián)四極質(zhì)譜檢測(cè)器[Agilent Technologies Sin-78，Singapore(International)Pte.Ltd.，新加坡]；FDU-1200型冷凍干燥機(jī)(-45 ℃)(上海愛郎儀器有限公司)；QE-100 g中藥粉碎機(jī)(浙江屹立工貿(mào)有限公司)；JP-100/S型超聲波清洗機(jī)(深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司)；SC-04型低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；TB-25型分析天平(美國Denver公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜和質(zhì)譜條件

Agilent ZORBAX RRHD Ecilipse Plus-C18色譜柱(50 mm ×2.1mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)。梯度洗脫(0～3 min，18%～22% B；3～3.5 min，22%～25% B；3.5～15 min，25% B；15～17 min，25%～45% B；17～18 min，45%～80% B；18～20 min，80%～100%B);柱溫：30℃；流速：0.4 mL·min-1；進(jìn)樣量：2μL；負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；電噴霧(ESI)離子源；干燥氣溫度：350 ℃，氮?dú)饬魉伲?1L·min-1，噴霧器壓力45 Psi(1 Psi=6.895 kPa)，毛細(xì)管電壓：3.5 kV。UPLC-MS優(yōu)化結(jié)果見表1，混合對(duì)照品及供試品色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱定綠原酸、1，5-DCQA、3，5-DCQA、4，5-DCQA、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷對(duì)照品適量，加無水乙醇，分別制成1.0 mg·mL-1的貯備溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取冷凍干燥后的藍(lán)刺頭藥材，粉碎處理過4號(hào)篩，稱取20 mg藥粉，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇水溶液10 mL。超聲提取30 min(10 min/次)(500 W，40 kHz)，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，離心取上清液(4000 r·min-1，2433×g，3 min)，0.22 μm微孔濾膜濾過，取濾液，備用。

表1 MRM模式下6個(gè)對(duì)照品的UPLC-MS優(yōu)化結(jié)果

注：A.6個(gè)對(duì)照品；B.河北產(chǎn)藍(lán)刺頭；C.內(nèi)蒙古產(chǎn)藍(lán)刺頭；1.綠原酸；2.3，5-二咖啡?？鼘幩?；3.1，5-二咖啡?？鼘幩?；4.芹菜素-7-O-葡萄糖苷；5.4，5-二咖啡?？鼘幩?；6.芹菜素。圖1 MRM模式下藍(lán)刺頭中6個(gè)成分的UPLC-MS色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密配制6個(gè)對(duì)照品的混合對(duì)照品溶液，過程如下：精密量取6個(gè)對(duì)照品貯備溶液適量，加60%乙醇水溶液稀釋，即得最高質(zhì)量濃度混合對(duì)照品溶液(L10)。然后，用60%乙醇水溶液將混合對(duì)照品溶液L10以1∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶2的比例稀釋10個(gè)梯度，即得10個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液(L10～L1)。最后，擇優(yōu)選取6個(gè)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)作線性回歸，結(jié)果見表2。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一混合對(duì)照品對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)條件連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得綠原酸、1，5-DCQA、3，5-DCQA、4，5-DCQA、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷的峰面積RSD(n=6)分別為0.4%、0.4%、0.3%、0.4%、0.6%、0.5%，表明儀器精密度良好。

表2 藍(lán)刺頭中6個(gè)成分的線性回歸分析結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按2.1項(xiàng)條件分別在0、2、4、6、8、10、14、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算綠原酸、1，5-DCQA、3，5-DCQA、4，5-DCQA、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷的峰面積RSD(n=9)分別為0.6%、1.1%、0.4%、1.2%、1.7%、1.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)(20140205)藍(lán)刺頭藥材，按2.3項(xiàng)平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)條件測(cè)定。計(jì)算綠原酸、1，5-DCQA、3，5-DCQA、4，5-DCQA、芹菜素和芹菜素-7-O-葡萄糖苷的峰面積RSD(n=6)分別為2.1%、2.5%、1.9%、2.2%、2.3%、1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率

精密稱取同一批號(hào)(20140205)已知含量的藍(lán)刺頭樣品6份，分別準(zhǔn)確加入一定量的2.2項(xiàng)中對(duì)照品貯備溶液(1.0 mg·mL-1)，按2.3項(xiàng)制備供試品溶液，測(cè)定6個(gè)化合物的峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測(cè)定

分別取兩批次的不同產(chǎn)地藍(lán)刺頭藥材各6份，同法測(cè)定樣品中6個(gè)成分的含量，結(jié)果見表4。

表3 藍(lán)刺頭中6個(gè)成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3(續(xù))

表4 藍(lán)刺頭中6個(gè)成分的含量測(cè)定(n=6) mg·g-1

3 討論

本研究首次利用UPLC-MS技術(shù)對(duì)蒙藥材藍(lán)刺頭的6個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行了含量測(cè)定，并首次在該藥材中發(fā)現(xiàn)含有3個(gè)二咖啡?？鼘幩犷惢衔?，分別是1，5-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡酰奎寧酸和4，5-二咖啡?？鼘幩?。近年來的研究結(jié)果顯示，綠原酸類化合物具有諸多的藥理活性[8]，特別是在抗病毒[9]、抗氧化[10]、抑制胰腺脂酶[11]等方面效果顯著，故預(yù)測(cè)蒙藥材藍(lán)刺頭具有潛在的多重藥理活性，該研究結(jié)果為蒙藥材藍(lán)刺頭的應(yīng)用提供了理論參考。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部 [S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：260-261.

[2] 內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳.內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn) [S].1986：501-502.

[3] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草·蒙藥卷 [S].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2004：382-385.

[4] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè) [S].1998：51.

[5] 張冬艷，楊雷，薛培鳳，等.藥用植物藍(lán)刺頭的研究進(jìn)展 [J].中國藥師，2015，18(11)：1966-1971.

[6] 胡伊力格其.HPLC法測(cè)定民族藥材禹州漏蘆不同部位中綠原酸的含量 [J].中國民族醫(yī)藥雜志，2015，3(3)：55-56.

[7] 楊斌，薩茹麗，劉敏，等.藍(lán)刺頭花絮水提物的降血糖作用研究 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2015，43(5)：1-5.

[8] 劉穎，郭明曄，白根本.綠原酸的研究進(jìn)展 [J].中藥材，2012，35(7)：1180-1185.

[9] Wang G F，Shi L P，Ren Y D，et al.Anti-hepatitis B virus activity of chlorogenic acid，quinic acid and caffeic acidinvivoandinvitro[J].Antiviral Res，2009，83(2)：186-190.

[10]Xu J G，Hu Q P，Liu Y.Antioxidant and DNA-protective activities of chlorogenic acid isomers [J].J Agric Food Chem，2012，60(46)：11625-11630.

[11]Cha K H，Song D G，Kim S M，et al.Inhibition of gastrointestinal lipolysis by green tea，coffee，and gomchui(Ligulariafischeri)tea polyphenols during simulated digestion [J].J Agric Food Chem，2012，60(29)：7152-7157.

SimultaneousDeterminationofSixCompoundsinEchinopslatifoliusTausch.FlowersbyUPLC-MS

MAJiannan1，MAChaomei2，TIANZhijie3，LIUWeidong1*

(1.InnerMongoliaShengTangMongolianMedicineResearchInstituteCo.，Ltd.,Hohhot010010，China；2.CollegeofLifeSciences，InnerMongoliaUniversity，Hohhot010021，China；3.InnerMongoliaGrandPharmaceuticalCo.，Ltd.,Hohhot010010，China)

Objective：To develop a specific UPLC-MS method for the determination of chlorogenic acid，1，5-dicaffeoylquinic acid，3，5-dicaffeoylquinic acid，4，5-dicaffeoylquinic acid，apigenin，and apigenin-7-O-glucoside in the flowers ofEchinopslatifoliusTausch..Methods：By using the UPLC-MS method，the six compounds were separated on an Agilent ZORBAX RRHD Ecilipse Plus-C18column with a mobile phase consisted of water containing 0.1% formic acid and methanol with gradient elution.Electrospray ionization source was applied and operated in negative ionization multiple reaction monitoring model(MRM).Results：The linear ranges of chlorogenic acid，3，5-dicaffeoylquinic acid，1，5-dicaffeoylquinic acid，apigenin-7-O-glucoside，4，5-dicaffeoylquinic acid，and apigenin were 1.25-40.00(r=0.999 0)，0.94-30.00(r=0.999 8)，0.94-30.00(r=0.999 8)，0.16-5.00(r=0.999 7)，0.16-5.00(r=0.999 9)，0.02-2.50(r=0.999 5) μg·mL-1，respectively.The recoveries of six analytes ranged from 99.80% to 102.97%，and the relative standard deviations were in the range of 1.23% to 2.68%.Conclusion：The method is sensitive，accuracy and suitable for the determination of main compounds in the flowers ofE.latifolius.

Echinopslatifolius；chlorogenic acids；flavonoids；UPLC-MS；quantification

呼和浩特市重大科技專項(xiàng)(2014150103000169)

] 劉衛(wèi)東，制藥高級(jí)工程師，研究方向：新藥研發(fā)；Tel：(0471)4611140，E-mail：weidliu@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.008

2016-07-11)

*[