百藥煎傳統(tǒng)炮制過(guò)程中微生物的分離與初步鑒定及其鞣質(zhì)水解能力測(cè)定△

胡夢(mèng)，王瑞生，文雯，劉英，胡海峰*

(1.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 201203；2.國(guó)藥集團(tuán)健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，上海 201203；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008)

·基礎(chǔ)研究·

百藥煎傳統(tǒng)炮制過(guò)程中微生物的分離與初步鑒定及其鞣質(zhì)水解能力測(cè)定△

胡夢(mèng)1，2，王瑞生3，文雯1，2，劉英1，2，胡海峰1，2*

(1.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 201203；2.國(guó)藥集團(tuán)健康產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，上海 201203；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008)

目的：揭示百藥煎傳統(tǒng)炮制過(guò)程中的微生物菌群，同時(shí)初步考察所分離菌株鞣質(zhì)水解能力。方法：應(yīng)用經(jīng)典微生物分離純化方法，結(jié)合形態(tài)學(xué)考察和16S rDNA 或18S rDNA基因序列分析，對(duì)百藥煎炮制過(guò)程中樣品進(jìn)行微生物的分離及菌種初步分類(lèi)鑒定。采用含單寧酸的固體培養(yǎng)基初步篩選具有鞣質(zhì)降解能力的菌株。結(jié)果：共分離獲得細(xì)菌7株、酵母菌7株、絲狀真菌3株。7種細(xì)菌分別為枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌 、黃海芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌菌株、同溫層芽孢桿菌、其他芽孢桿菌；7種酵母菌分別為伯頓絲孢畢赤酵母、2株克魯維酵母菌株、弗比恩酵母菌、奧默柯達(dá)菌、異常威克漢姆酵母菌、異常畢赤酵母菌；3株絲狀真菌分別為青霉菌、卷枝毛霉菌、黑曲霉菌。除枯草芽孢桿菌、黃海芽孢桿菌、芽孢桿菌、克魯維酵母菌HMY3、弗比恩酵母菌外，其余菌株均具有鞣質(zhì)降解能力。結(jié)論：百藥煎傳統(tǒng)發(fā)酵炮制工藝涉及多種微生物共同參與混合發(fā)酵過(guò)程，初步篩選證明5株細(xì)菌、5株酵母菌和3株絲狀真菌具有鞣質(zhì)降解能力，這一發(fā)現(xiàn)為研究百藥煎現(xiàn)代炮制工藝奠定了微生物菌種基礎(chǔ)。

百藥煎；炮制；微生物；分離；鑒定

百藥煎是由五倍子、茶葉和酒糟等經(jīng)自然發(fā)酵而制成的傳統(tǒng)中藥飲片，始載于《丹溪心法》[1]。百藥煎成品為布滿(mǎn)白霜的塊狀物，味酸甘，性平，具有潤(rùn)肺化痰、止血止瀉、解熱生津等功效，主治肺虛久咳、久瀉久痢、便血痔血、癰腫瘡毒、皮膚濕爛等癥[2]。百藥煎的主要原料為五倍子，五倍子中含有大量鞣質(zhì)類(lèi)成分及少量沒(méi)食子酸，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定五倍子鞣質(zhì)含量不少于 50%，五倍子中鞣質(zhì)含量甚至高達(dá)70%以上[3]。有報(bào)道認(rèn)為鞣質(zhì)具有肝毒性，而發(fā)酵轉(zhuǎn)化生成的沒(méi)食子酸具有抗腫瘤、殺錐蟲(chóng)、抗炎、抑菌、抗病毒、降糖降酯等作用，五倍子發(fā)酵成為百藥煎過(guò)程中鞣質(zhì)在單寧酶作用下水解生成沒(méi)食子酸，是其功效發(fā)生改變的物質(zhì)基礎(chǔ)。百藥煎傳統(tǒng)炮制法是利用自然界多菌種混合固體發(fā)酵而成，多為霉菌和細(xì)菌。由于自然發(fā)酵菌種不純，針對(duì)性不強(qiáng)，參與發(fā)酵的菌種和數(shù)目都存在一定的波動(dòng)，且百藥煎固體發(fā)酵過(guò)程中鞣質(zhì)和沒(méi)食子酸基質(zhì)濃度不易調(diào)控，添加物質(zhì)難以混合均勻，整個(gè)炮制過(guò)程憑主觀經(jīng)驗(yàn)來(lái)控制[4]，使得百藥煎的量化生產(chǎn)受到限制。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典微生物學(xué)分離方法分離并初步鑒定百藥煎炮制品中微生物，考察所分離菌株原料耐受性及鞣質(zhì)水解特性，為實(shí)現(xiàn)百藥煎現(xiàn)代炮制工藝化生產(chǎn)奠定菌種基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1材料

1.1.1樣品 百藥煎傳統(tǒng)炮制品 (四川輔正藥業(yè)股份有限公司)；經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)張振凌教授鑒定為正品；五倍子(安徽亳州滬譙中藥飲片公司，批 號(hào)：20160824)；綠茶(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉專(zhuān)業(yè)市場(chǎng))；酒糟(鎮(zhèn)江酒廠)。

1.1.2樣品制備 取綠茶加20倍體積蒸餾水溶解，煎煮，過(guò)濾，棄去殘?jiān)?，得茶汁。五倍子?xì)粉-酒糟細(xì)粉(1∶4)混合均勻，加入適量茶汁攪拌，以握之成團(tuán)，捏之即碎為度。將混合物放置于托盤(pán)，透明塑料膜遮蓋，置于陰涼通風(fēng)處，自然狀態(tài)發(fā)酵，待表面長(zhǎng)滿(mǎn)一層白色菌毛，即停止發(fā)酵，將百藥煎切塊烘干，即得。分別在發(fā)酵時(shí)間為0、6、18、24、30、42、48、66h取樣，樣品編號(hào)分別為C1～C8。

1.1.3其他試劑 LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基 (國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；單寧酸(國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)；Fx KOD Buffer、 TES(Tris-HCl pH7.510mmol·L-1、EDTA1mmol·L-1、NaCl50mmol·L-1)、脫氧核糖核苷三磷酸 、dNTP、Fx KOD 酶、Easy Taq Buffer、Easy Taq 酶(TaKaRa公司)；引物NS1、NS2(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)。

1.2儀器

電子天平(上海精科天平)；精密數(shù)顯示酸度計(jì)(Sartorius)；壓力蒸氣滅菌鍋(上海華線(xiàn)醫(yī)用核子儀器有限公司)；超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司)。

2 方法

2.1分離及純化培養(yǎng)基

2.1.1LB培養(yǎng)基 添加過(guò)濾除菌甲醇溶制霉菌素，終質(zhì)量濃度為50μg·mL-1，乳酸菌外細(xì)菌分離培養(yǎng)用。

2.1.2MRS培養(yǎng)基 添加終質(zhì)量濃度為100μg·mL-1溴甲酚綠指示劑，高壓蒸氣滅菌乳酸菌產(chǎn)酸使顯色劑變黃，乳酸菌分離培養(yǎng)用。

2.1.3PDA培養(yǎng)基 添加過(guò)濾除菌、終質(zhì)量濃度為50μg·mL-1硫酸鏈霉素，真菌分離培養(yǎng)用。

2.1.4高氏一號(hào)培養(yǎng)基 添加過(guò)濾除菌、終質(zhì)量濃度為100μg·mL-1重鉻酸鉀，放線(xiàn)菌分離用。

2.2微生物的分離與純化

2.2.1樣品處理

2.2.1.1樣品稀釋 取樣品5g，在無(wú)菌條件下加至裝有45mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液、含玻璃小珠的250mL錐形瓶中，振搖約30min，使菌分散，得稀釋10倍菌懸液，采用10倍梯度稀釋?zhuān)?.9%氯化鈉溶液稀釋后菌懸液。

2.2.1.2樣品增菌培養(yǎng) 取樣品約1g，無(wú)菌條件下分別加入2.1分離培養(yǎng)基中，LB液體培養(yǎng)基于37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)1.5 d，MRS液體培養(yǎng)基于37 ℃靜置培養(yǎng)1.5 d，PDA液體培養(yǎng)基于28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)2.5 d。增菌后培養(yǎng)液采用10倍梯度稀釋?zhuān)酶患囵B(yǎng)后稀釋菌液。

2.2.2 微生物分離 分別吸取0.2 mL樣品不同稀釋度的菌懸液，均勻涂布于LB固體平板、MRS固體平板以及PDA固體平板表面，其中將LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；將PDA培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.3 菌株純化 將各培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行平板劃線(xiàn)，直至菌株菌落形態(tài)一致。

2.3菌株初步鑒定

2.3.1形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1.1菌落形態(tài) 用接種針取單菌落，細(xì)菌接種于LB培養(yǎng)基，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；真菌接種于PDA培養(yǎng)基，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌體在培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)與生長(zhǎng)情況。

2.3.1.2顯微形態(tài) 細(xì)菌用結(jié)晶紫染色，置于顯微鏡下觀察細(xì)菌結(jié)構(gòu)，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色；酵母菌用美藍(lán)染色，置于顯微鏡下觀察；絲狀真菌用插片法進(jìn)行培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)過(guò)插片的位置后，取出玻片進(jìn)行顯微鏡觀察。

2.3.216S rDNA/18S rDNA分子生物學(xué)鑒定

2.3.2.116SrDNA分子生物學(xué)鑒定 細(xì)菌菌落PCR：以菌落為模板，上游引物27F：5′ GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，下游引物1495R：5′CTACGGCTACCTTGTTACGA3′，完成PCR擴(kuò)增。PCR體系為 Fx KOD Buffer10μL dNTP0.4μL引物各0.4μL、Fx KOD酶0.4μL、DMSO1μL、ddH2O10μL。PCR程序?yàn)?5℃預(yù)熱5min，94℃變性30s，56℃退火35s，72℃延伸90s，循環(huán)30次，72℃保持10min，16℃保溫。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并對(duì)結(jié)果進(jìn)行序列分析。

2.3.2.218S rDNA分子生物學(xué)鑒定 真菌以提取的基因組DNA為模板，上游引物NS1：5′GTAGTCATATGCTTGTCTC3′，下游引物NS2：5′GGCTGCTGGCACCAGACTTGC3′，完成 PCR擴(kuò)增?；蚪M提?。喝∨囵B(yǎng)的真菌一管，裝入細(xì)砂，用FastPrep 儀器進(jìn)行操作(5m·s-1，10s，2次)。然后加入500μL DES 溶液和5μLβ-巰基乙醇，混勻，65℃水浴30min。加入500μL水飽和苯酚-三氯甲烷-異戊醇(25∶24∶1)，12000r·min-1離心5min。將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，再加500μL水飽和苯酚-三氯甲烷-異戊醇(25∶24∶1)，沉淀1次。12000r·min-1離心5min后，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入冷的70%乙醇混勻，-20℃沉淀2h。12000r·min-1離心5min，揮干殘余的乙醇，加入TER溶液溶解。PCR體系為Easy Taq Buffer10μL、dNTP0.4μL、引物各0.4μL、Easy Taq酶0.4μL、DMSO1μL、模板0.2μL、ddH2O8μL。PCR程序：98℃預(yù)熱5min，96℃變性20s，52℃退火90s，72℃延伸90s循環(huán)30次，72℃保持10min，16℃保溫。用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì) PCR結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并對(duì)結(jié)果進(jìn)行序列分析。

2.3.2.3測(cè)序 選取擴(kuò)增結(jié)果陽(yáng)性的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將PCR測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)，與Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知基因序列進(jìn)行Blast對(duì)比分析待測(cè)菌株與模式菌株的同源性。

2.4菌株鞣質(zhì)降解能力分析

鞣質(zhì)能與蛋白質(zhì)形成白色不溶性沉淀，鞣質(zhì)水解后生成的沒(méi)食子酸呈酸性，能使含溴甲酚綠指示劑的培養(yǎng)基由綠色變?yōu)辄S色，通過(guò)觀察篩選固體培養(yǎng)基上是否形成透明圈或者培養(yǎng)基顏色的變化，初步判斷所分離菌株的鞣質(zhì)水解能力。

2.4.1真菌降解鞣質(zhì)能力 在馬丁固體培養(yǎng)基表面，滴加含1%鞣質(zhì)、0.004%溴甲酚綠溶液1mL，于固體平板表面形成淡黃色不透明層，吸去多余液體，接種針點(diǎn)接酵母菌及絲狀真菌，于30℃倒置培養(yǎng)4d，觀察菌株周?chē)欠裼兴馔该魅Τ霈F(xiàn)及培養(yǎng)基表面顏色變化[5]。

2.4.2細(xì)菌降解鞣質(zhì)能力 在無(wú)菌條件下于LB固體培養(yǎng)基表面滴加1mL0.2%鞣質(zhì)，表面形成白色不溶沉淀，點(diǎn)接細(xì)菌后，于37℃培養(yǎng)4d，觀察菌落周?chē)袩o(wú)變色圈或水解透明圈。

3 結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)百藥煎炮制過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行分離，總共得到細(xì)菌7種，酵母菌7種，絲狀真菌3種，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對(duì)所分菌株進(jìn)行綜合鑒定。

3.1細(xì)菌

3.1.1細(xì)菌形態(tài)觀察 所分離的細(xì)菌采用HMB結(jié)合阿拉伯?dāng)?shù)字大小依次編號(hào)，各株細(xì)菌在LB平板上的菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)及革蘭染色結(jié)果見(jiàn)表1。

3.1.2細(xì)菌種屬初步鑒定 將 PCR 測(cè)序結(jié)果提交至NCBI，與Gene Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知基因序列進(jìn)行Blast 對(duì)比，分析待測(cè)菌株與模式菌株的同源性。根據(jù)細(xì)菌菌株的16S rDNA序列比對(duì)分析結(jié)果及其形態(tài)學(xué)特征，并結(jié)合《細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《微生物分類(lèi)學(xué)》等有關(guān)資料，對(duì)所分細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定，見(jiàn)表2。

表1 百藥煎炮制品中所分離細(xì)菌的形態(tài)特征

表2 百藥煎炮制品中所分離細(xì)菌種屬初步鑒定結(jié)果

3.2真菌

3.2.1酵母菌形態(tài)學(xué)特征 所分離的酵母菌采用HMY結(jié)合阿拉伯?dāng)?shù)字按大小依次編號(hào)，各酵母菌在PDA平板上的菌落形態(tài)及顯微觀察情況見(jiàn)表3。

表3 百藥煎炮制品中所分離酵母菌的形態(tài)特征

3.2.2 酵母菌的初步鑒定 根據(jù)真菌菌株的18S rDNA序列同源性比對(duì)分析結(jié)果及其形態(tài)學(xué)特征，并結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》和《微生物分類(lèi)學(xué)》等有關(guān)資料，對(duì)所分離酵母菌進(jìn)行初步鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 百藥煎炮制品中所分離酵母菌菌屬初步鑒定

3.2.3 絲狀真菌形態(tài)學(xué)特征 所分離的絲狀真菌采用HMF結(jié)合阿拉伯?dāng)?shù)字按大小依次編號(hào)，各絲狀真菌在PDA平板上的菌落形態(tài)及插片鏡檢結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 百藥煎炮制品中所分離絲狀真菌的形態(tài)特征

注：A.HMF-1；B.HMF-2；C.HMF-3。圖1 絲狀真菌顯微形態(tài)圖

根據(jù)真菌菌株的18S rDNA序列同源性比對(duì)分析結(jié)果及其形態(tài)學(xué)特征，并結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》和《微生物分類(lèi)學(xué)》等有關(guān)資料，對(duì)所分絲狀真菌進(jìn)行初步鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 百藥煎炮制品中所分離絲狀真菌的初步鑒定

3.3炮制過(guò)程中微生物菌群變化

3.3.1細(xì)菌菌數(shù)變化 以稀釋涂布分離平板上菌落數(shù)在30～300個(gè)為宜，對(duì)百藥煎樣品C1～C8中的細(xì)菌計(jì)數(shù)，其變化規(guī)律見(jiàn)圖2。

圖2 百藥煎炮制過(guò)程中細(xì)菌菌數(shù)變化規(guī)律

由圖2可見(jiàn)，在百藥煎炮制過(guò)程中菌株HMB1、HMB3、HMB7菌數(shù)變化規(guī)律相同，在樣品C1～C5中菌數(shù)變化不大，在樣品C6中菌數(shù)開(kāi)始增加，并在樣品C7、C8中菌數(shù)急劇增多。

3.3.2酵母菌菌數(shù)變化 以稀釋涂布分離平板上菌落數(shù)在30～300個(gè)為宜，對(duì)百藥煎樣品C1～C8中的酵母菌計(jì)數(shù)，其變化規(guī)律見(jiàn)圖3。

圖3 百藥煎炮制過(guò)程中酵母菌菌數(shù)變化規(guī)律

由圖3可知，菌株HMY1在百藥煎炮制過(guò)程中其菌數(shù)表現(xiàn)為先不變后增加再減少，在樣品C5中其菌數(shù)達(dá)到最大；菌株HMY2在百藥煎炮制過(guò)程中其菌數(shù)表現(xiàn)為先不變后逐漸增多的趨勢(shì)，在樣品C5中其菌數(shù)開(kāi)始大幅度增多。

3.3.3絲狀真菌菌數(shù)變化 以稀釋涂布分離平板上菌落數(shù)在30～300個(gè)為宜，對(duì)百藥煎樣品C1～C8中的絲狀真菌計(jì)數(shù)，其變化規(guī)律見(jiàn)圖4。

圖4 百藥煎炮制過(guò)程中絲狀真菌菌數(shù)變化規(guī)律

由圖4可知，菌株HMF1在百藥煎炮制過(guò)程中其菌數(shù)表現(xiàn)為先不變后增加的趨勢(shì)，在樣品C5中菌數(shù)開(kāi)始增加；菌株HMF2在百藥煎炮制過(guò)程中其菌數(shù)表現(xiàn)為先不變后減少為零的趨勢(shì)；菌株HMF3在百藥煎炮制過(guò)程中其菌數(shù)表現(xiàn)為增加后減少再維持不變的趨勢(shì)，在樣品C4中菌數(shù)達(dá)到最大。

3.4鞣質(zhì)降解菌的篩選

篩選平板培養(yǎng)基中添加有單寧酸和溴酚藍(lán)指示劑，如果菌株產(chǎn)單寧酶就會(huì)水解培養(yǎng)基中的單寧酸產(chǎn)生沒(méi)食子酸，使菌落周?chē)匿宸铀{(lán)指示劑由藍(lán)紫色變?yōu)辄S色，從而在菌落周?chē)纬擅黠@的變色圈。根據(jù)產(chǎn)生變色圈的顏色深淺或菌落周?chē)该魅Φ拇笮」埠Y選出5株細(xì)菌(枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌 、巨大芽孢桿菌、同溫層芽孢桿菌)，5株酵母菌(伯頓絲孢畢赤酵母、克魯維酵母菌株、奧默柯達(dá)酵母菌、異常威克漢姆酵母菌、異常畢赤酵母菌)；3株絲狀真菌(青霉菌、黑曲霉、卷枝毛霉菌)均具有降解鞣質(zhì)能力。

4 結(jié)論與討論

以傳統(tǒng)百藥煎炮制品為研究對(duì)象，從不同炮制階段樣品中共分離得到7種細(xì)菌、7種酵母菌、3種絲狀真菌，并結(jié)合微生物菌落形態(tài)特征、顯微形態(tài)及16S rDNA/18S rDNA分子序列比對(duì)對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。剔除同種菌株后，樣品中所分離到微生物中，細(xì)菌包括枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌、芽孢桿菌屬菌、巨大芽孢桿菌菌株、同溫層芽孢桿菌、芽孢桿菌屬菌；酵母菌包括伯頓絲孢畢赤酵母、克魯維酵母菌株、克魯維酵母菌株、弗比恩酵母菌、奧默柯達(dá)菌、異常威克漢姆酵母菌、異常畢赤酵母菌；絲狀真菌包括青霉菌屬真菌、卷枝毛霉菌、黑曲霉菌屬真菌。樣品中所分離到的細(xì)菌均具有產(chǎn)蛋白酶活性。

本實(shí)驗(yàn)采用含有單寧酸的固體平板初步篩選具產(chǎn)單寧酶特性的菌株。分離得到的5株細(xì)菌(枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌 、巨大芽孢桿菌、同溫層芽孢桿菌)，5株酵母菌(伯頓絲孢畢赤酵母、克魯維酵母菌株、奧默柯達(dá)酵母菌、異常威克漢姆酵母菌、異常畢赤酵母菌)；3株絲狀真菌(青霉菌、黑曲霉、卷枝毛霉菌)均有鞣質(zhì)降解特性。目前關(guān)于真菌類(lèi)的曲霉屬、青霉屬菌株產(chǎn)單寧酶的研究報(bào)道較多，而細(xì)菌和酵母菌的相關(guān)報(bào)道較少[6-7]。與霉菌相比，細(xì)菌和酵母菌具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于改造、生長(zhǎng)繁殖快、適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用細(xì)菌及酵母菌的鞣質(zhì)水解工藝研究更加方便，可進(jìn)一步考察初篩得到的菌株降解鞣質(zhì)能力的強(qiáng)弱。利用微生物發(fā)酵五倍子能有效避免鞣質(zhì)在胃腸道內(nèi)的競(jìng)爭(zhēng)性消耗，有效地減少了大分子沉淀物的形成對(duì)胃黏膜的刺激。本研究不僅為實(shí)現(xiàn)百藥煎的現(xiàn)代炮制工藝提供了菌種基礎(chǔ)，通過(guò)初篩得到的具單寧降解特性的4株細(xì)菌和5株酵母菌株，也為細(xì)菌和酵母菌產(chǎn)單寧酶的研究提供了一定的參考。

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IdentificationandIsolationofMicroorganismsfromChineseGallLeavenSamplesduringItsProcessing

HU Meng1，2，WANG Ruisheng3，WEN Wen1，2，LIU Ying1，2，HU Haifeng1，2 *

(1.Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry，Shanghai 201203，China；2.Sinopharm Health Industry Institute Co.，Ltd.，Shanghai 201203，China；3.Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China)

Objective：To reveal the beneficial microorganisms in processedChinesegallleavenduring their processing by traditional fermentation methods.Methods：Using classical microbial isolation and purification methods，the strains in processedChinesegallleavensamples were isolated and purified.The preliminary taxonomy of the strains isolated was carried out by investigating the morphological properties，and analyzing and comparing their 16S rDNA or 18S rDNA gene sequences.The ability of degradating tannic acid was determined.Results：Seven species of bacteria，seven species of yeasts and three species of filamentous fungi were isolated and identified in processedChinesegallleavensamples.The bacteria includeBacillussubtilis，Bacilluscereus，Bacilluslcheniformis，Bacillus，marisflavi，Bacillusmegaterium，Bacillusstratosphericus，andPaenibacillussp.，the yeasts wereHyphopichiaburtonii，Kluyveromycesmarxianus，Kluyveromycesmarxianus，Cyberlindnerafabianii，Kodamaeaohmeri，Wickerhamomycesanomalus，andPichiaanomala，and the fungi areAspergillusniger，Mucorcircinelloides，Penicilliumspp.By determining the ability of degradating tannic acid，other strains all showed to be positive except forBacillussubtilis，Bacillusmarisflavi，Paenibacillussp.，KluyveromycesmarxianusHMY3，Cyberlindnerafabianii.Conclusion：Many species of microorganisms exist in processedChinesegallleavensamples during its processing，in which five species of bacteria，five species of yeasts and three species of filamentous fungi are able to degrade tannic acid，which help to reconstruct modern fermentation technology of processedChinesegallleaven.

ProcessedChinesegallleaven；fermentation；microorganism；isolation；identification

國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)專(zhuān)項(xiàng) (201507004)

] 胡海峰，研究員，研究方向：微生物藥物研究與開(kāi)發(fā)；Tel：(021) 62892873，E-mail：haifenghu88@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.014

2016-11-07)

*[