基于UPLC/Q-TOF-MSE分析小續(xù)命湯有效成分組的化學(xué)成分△

陳茜睿，楊志宏

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

·基礎(chǔ)研究·

基于UPLC/Q-TOF-MSE分析小續(xù)命湯有效成分組的化學(xué)成分△

陳茜睿，楊志宏*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：快速闡明中藥復(fù)方小續(xù)命湯的化學(xué)組成。方法：利用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC/Q-TOF-MSE)對(duì)小續(xù)命湯有效成分組進(jìn)行了快速分析和成分鑒定。液相條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，以0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫40 ℃，流速0.35 mL·min-1；質(zhì)譜條件：采用ESI源，正、負(fù)離子模式下分別進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。結(jié)果：通過與對(duì)照品信息的提取辨識(shí)、與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的匹配指認(rèn)以及對(duì)文獻(xiàn)資料的比照分析，從小續(xù)命湯有效成分組中鑒定了42個(gè)化合物，主要包括黃酮、生物堿、三萜皂苷等類成分，并歸屬了各化合物的單味中藥來源。結(jié)論：本研究比較全面地闡明了小續(xù)命湯有效成分組的化學(xué)組成，為此中藥復(fù)方的質(zhì)量控制提供參考，也為其深入的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用研究奠定了基礎(chǔ)。

小續(xù)命湯有效成分組；UPLC/Q-TOF-MSE；化學(xué)成分

小續(xù)命湯是由防風(fēng)、麻黃、防己、人參、黃芩、桂枝、芍藥、川芎、杏仁、附子、甘草、生姜12味中藥組成的中藥復(fù)方，是中醫(yī)治療中風(fēng)及中風(fēng)后遺癥的經(jīng)典方劑。近年來研究顯示，小續(xù)命湯不僅對(duì)中風(fēng)及中風(fēng)后遺癥具有明顯的治療作用，對(duì)阿爾茨海默病、糖尿病周圍神經(jīng)病變、頑固性高血壓等其他疾病也具有一定療效[1-5]。小續(xù)命湯有效成分組是小續(xù)命湯復(fù)方中與臨床治療腦卒中密切相關(guān)的藥理活性成分[6]，近年來雖有文獻(xiàn)[7-8]對(duì)小續(xù)命湯有效成分組中幾味成分進(jìn)行報(bào)道，但其中大部分化學(xué)成分仍未知。為了闡述該復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，進(jìn)行其化學(xué)成分研究尤為迫切。

飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Q-TOF-MSE)是高分辨質(zhì)譜，其顯著特征是既能準(zhǔn)確測定化合物的精確分子量，又兼顧高靈敏度和高檢測速度。超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(UPLC/Q-TOF-MSE)，即通過UPLC的高分離效率與Q-TOF-MSE的極高分辨率相結(jié)合，成為當(dāng)前天然藥物復(fù)雜體系中活性成分快速分離和鑒定的有力手段。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用UPLC/Q-TOF-MSE技術(shù)對(duì)小續(xù)命湯有效成分組進(jìn)行分析，結(jié)合色譜保留時(shí)間、精確分子質(zhì)量、碎片離子信息，參考對(duì)照品的色譜、質(zhì)譜行為和相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)主要色譜峰進(jìn)行歸屬和鑒定，對(duì)未知化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測。本研究較全面地闡明了小續(xù)命湯有效成分組的化學(xué)組成，為該復(fù)方開展后續(xù)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

ACQUITYTMUPLC/Q-TOF SYNAPT G2 HDMS 聯(lián)用系統(tǒng)，MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站(美國Waters公司)，ChemSpider數(shù)據(jù)庫。

小續(xù)命湯有效成分組粉末由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所杜冠華教授惠贈(zèng)。對(duì)照品：升麻苷(Prim-O-Glucosylcimifugin)，批號(hào)：PS08050601；黃芩苷(Baicalin)，批號(hào)：PS01260020；苦杏仁苷(Amygdalin)，批號(hào)：PS08082904；芍藥苷(Paeoniflorin)，批號(hào)：PS13022801；甘草酸(Glycyrrhizic Acid)，批號(hào)：PS0126-0020；甘草素(Liquritigenin)，批號(hào)：PS15010601；黃芩素(Baicalein)，批號(hào)：PS0711-0025；漢黃芩素(Wogonin)，批號(hào)：PS14051603；千層紙素A(Oroxylin A)，批號(hào)：PS14052203，以上對(duì)照品購自成都普思生物科技有限公司。防己諾林堿(Fangchinoline)，批號(hào)：141215；苯甲酰新烏頭原堿(Benzoylmesaconine)，批號(hào)：141124；人參皂苷Rc(Ginsenoside Rc)，批號(hào)：151021；甘草苷(Liquiritin)，批號(hào)：160127；異甘草苷(Isoliquiritoside)，批號(hào)：160129；千層紙素A葡萄糖醛酸苷(Oroxylin A-7-O-glucuronide)，批號(hào)：141220；漢黃芩苷(Wogonoside)，批號(hào)：141207，以上對(duì)照品購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。白楊素(Chrysin，CHR)購自上海同田生物技術(shù)有限公司。鹽酸甲基麻黃堿(Methylephedrine Hydrochloride)，批號(hào)：171247-200301，購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、甲酸為色譜級(jí)，水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

2 方法

2.1對(duì)照品溶液制備

精密稱取各對(duì)照品1mg，以甲醇溶解至1mL，作為對(duì)照品貯備液，于4℃下避光保存。

2.2供試品溶液制備

小續(xù)命湯有效成分組供試溶液：精密稱取有效成分組粉末20mg，于甲醇-水(80∶20，V/V)中超聲溶解，配制成20mg·mL-1混懸液，以甲醇-水(50∶50，V/V)稀釋為10mg·mL-1溶液后，于4℃下12000r·min-1離心10min，取上清液過0.22μm微孔濾膜。

2.3色譜條件

色譜柱：WatersACQUITYUPLCHSST3(100mm×2.1mm，1.8μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。洗脫程序?yàn)椋?～10min，10%B；10～30min，10%→20%B；30～33min，20%B；33～41min，20%→35%B；41～46min，35%B；46～50min，35%→70%B；50～52min，70%→95%B。進(jìn)樣量為5μL；柱溫為40℃；檢測波長范圍為190～320nm，流速為0.35mL·min-1。

2.4質(zhì)譜條件

氮?dú)鉃殪F化、錐孔氣；電噴霧電離：正、負(fù)離子模式；飛行管檢測模式：W型；毛細(xì)管電壓：正離子模式3.0kV，負(fù)離子模式2.5kV；錐孔電壓：40V；萃取錐孔：4V；源溫：100℃；脫溶劑氣溫度：350℃；反向錐孔氣流：100L·h-1；脫溶劑氣流：800L·h-1；掃描時(shí)間：1s；掃描時(shí)間間隔：0.15s；質(zhì)荷比范圍：m/z100～1200Da；鎖定質(zhì)量數(shù)：正離子模式m/z556.2771，負(fù)離子模式m/z554.2615。

3 結(jié)果

3.1小續(xù)命湯有效成分組主要色譜峰歸屬分析

應(yīng)用UPLC/Q-TOF-MSE技術(shù)分析了小續(xù)命湯有效成分組供試品溶液，獲得了其中多個(gè)成分的高分辨質(zhì)譜及多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。圖1為正、負(fù)離子模式下小續(xù)命湯有效成分組供試品溶液總離子流圖。通過分析樣品的總離子流圖，提取離子色譜圖，獲得特征碎片離子，再綜合保留時(shí)間，比較對(duì)照品和供試品在時(shí)間點(diǎn)下的質(zhì)譜圖，進(jìn)一步確認(rèn)色譜峰的歸屬。結(jié)果顯示，在42個(gè)色譜峰中，峰17、24、26、29、35、36、39來源于黃芩，峰8、12、14來源于防風(fēng)，峰13、16來源于防己，峰1、2、3來源于麻黃，峰5、15、20、22、27、30、31來源于附子，峰23、25、32、33、34、38來源于人參，峰41來源于川芎，峰4來源于杏仁，峰6、7、28來源于芍藥，峰10、18、19、37、42來源于甘草。

注：A.正離子模式；B.負(fù)離子模式。圖1 小續(xù)命湯有效成分組樣品總離子流圖

3.2色譜峰的鑒定

通過與對(duì)照品比對(duì)鑒定，峰3為甲基麻黃堿，峰7為芍藥苷，峰8為升麻苷，峰13為防己諾林堿，峰15為苯甲酰新烏頭堿，峰17為黃芩苷，峰33為人參皂苷Rc，根據(jù)以上對(duì)照品總結(jié)的色譜和質(zhì)譜規(guī)律，結(jié)合供試品中各色譜峰的精確的MS數(shù)據(jù)(分子式、精確分子量、特征二級(jí)和/或三級(jí)碎片離子峰)，再考慮到小續(xù)命湯有效成分組中已報(bào)道過的化學(xué)成分[9-16]，推測了各色譜峰的可能結(jié)構(gòu)，見表1。從化合物的類別來看，黃酮類和生物堿類含量較高，對(duì)復(fù)方的貢獻(xiàn)較大，并初步識(shí)別了色譜峰來源鑒定出的38個(gè)成分。包括10個(gè)黃酮類成分：黃芩苷(峰17)、甘草素(峰19)、千層紙素A葡萄糖醛酸苷(峰24)、漢黃芩苷(峰26)、黃芩素(峰29)、漢黃芩素(峰35)、白楊素(峰36)、千層紙素A(峰39)、甘草苷(峰10)和異甘草苷(峰18)。3個(gè)色原酮類成分：升麻素(峰12)、升麻苷(峰8)和5-O-甲基維斯阿米醇苷(峰14)。2個(gè)三萜類成分：甘草酸(峰37)和甘草次酸(峰42)。3個(gè)單萜類成分：芍藥苷(峰7)、芍藥內(nèi)酯苷(峰6)和苯甲酰芍藥苷(峰28)。12個(gè)生物堿類成分：麻黃堿(峰1)、偽麻黃堿(峰2)、甲基麻黃堿(峰3)、烏頭堿(峰31)、次烏頭堿(峰30)、新烏頭堿(峰27)、苯甲酰新烏頭堿(峰15)、苯甲酰次烏頭堿(峰22)、苯甲酰烏頭原堿(峰20)、附子靈(峰5)、粉防己堿(峰16)和防己諾林堿(峰13)。6個(gè)三萜皂苷類：人參皂苷Rg1(峰23)、人參皂苷Rb1(峰32)、人參皂苷Rb2(峰34)、人參皂苷Re(峰25)、人參皂苷Rc(峰33)、人參皂苷Rd(峰38)。1個(gè)氰苷類成分：苦杏仁苷(峰4)。1種揮發(fā)油類成分：藁本內(nèi)酯(峰41)。

對(duì)于部分未知化合物，將其中4個(gè)未知化合物進(jìn)行了初步推測。它們分別可能是：正離子模式下檢測到的9、21、40號(hào)峰，以及負(fù)離子模式下檢測到的11號(hào)峰。并推測它們分別為輪環(huán)藤酚堿、燈盞花甲素、黃芩新素Ⅱ以及芹糖基甘草苷。此外，通過比較對(duì)照品、小續(xù)命湯樣品色譜峰出峰時(shí)間，發(fā)現(xiàn)峰4、10、18、19樣品保留時(shí)間與對(duì)照品相同，但因其質(zhì)譜碎片離子信號(hào)在樣品與對(duì)照品中存在偏差，這可能是由于樣品中組分相對(duì)復(fù)雜，影響了碎片離子信號(hào)的穩(wěn)定程度，因而僅推測其可能為苦杏仁苷、甘草苷、黃芩苷、異甘草苷。

3.3黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)峰17、24、26、29、35、36、39的精確質(zhì)量數(shù)得到的化合物不飽和度均在10以上，推測均為黃酮類化合物。黃酮類成分的準(zhǔn)分子離子峰大多為[M+H]+，其質(zhì)譜碎裂特征主要是丟失中性分子CO和H2O。結(jié)構(gòu)中有甲基取代基的化合物還可以丟失一分子甲基。同時(shí)，一些黃酮類成分還存在著逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)(RetroDiels-Alderreaction，RDA)裂解。

化合物17正離子給出m/z447.0933[M+H]+，分子式為C21H18O11。推測為一連有葡萄糖醛酸結(jié)構(gòu)的黃酮化合物，且屬于單糖苷類，苷元可能含有鄰二酚羥基。經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與黃芩苷的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致，17可能為黃芩苷。

化合物26正離子給出m/z461.1084[M+H]+，分子式為C22H20O11?；衔?4正離子給出m/z483.0903[M+Na]+，分子式為C22H20O11，二者應(yīng)是一對(duì)同分異構(gòu)體。在黃酮母核的A環(huán)上均有葡萄糖醛酸基團(tuán)，由于26與17分子結(jié)構(gòu)相差一個(gè)CH2基團(tuán)，兩者可能為漢黃芩苷和千層紙素A葡萄糖醛酸苷，而只靠質(zhì)譜數(shù)據(jù)很難將二者區(qū)分開，通過與已知的對(duì)照品進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及保留時(shí)間的對(duì)比，最終確定了化合物24為千層紙素A葡萄糖醛酸苷，化合物26鑒定為漢黃芩苷。

化合物29正離子給出m/z271.061[M+H]+，分子式為C15H10O5，表明為一黃酮類化合物，而非黃酮苷類。根據(jù)其化合物的分子質(zhì)量和不飽和度推測3個(gè)氧原子的取代基為酚羥基取代，而非甲氧基取代，經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)，化合物29鑒定為黃芩素。

化合物35正離子給出m/z285.076 3[M+H]+，分子式為C16H12O5。與此相同的化合物39正離子給出m/z285.076 3[M+H]+，判斷二者為一對(duì)同分異構(gòu)體。根據(jù)其分子式和不飽和度推測此類化合物應(yīng)為O-甲基化的黃酮類物質(zhì)，而漢黃芩素和千層紙素A這兩個(gè)黃酮類成分可能從黃芩中提取得到，與對(duì)照品對(duì)比，其保留時(shí)間及分子離子峰一致，判斷化合物35為漢黃芩素，39為千層紙素A。

化合物36正離子給出m/z255.065 7[M+H]+，分子式為C15H10O5。通過與已知的對(duì)照品進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及保留時(shí)間的對(duì)比，最終確定了化合物36為白楊素。

表1 小續(xù)命湯有效成分組化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)

表1(續(xù))

4 討論

小續(xù)命湯復(fù)方由12味中藥組成，其中含有生物堿、黃酮、三萜皂苷等類復(fù)雜成分。要將這些不同類型的化合物用同一色譜條件進(jìn)行分離，是相當(dāng)困難的。基于對(duì)實(shí)驗(yàn)室原有的液相分離條件進(jìn)行完善，并根據(jù)超高效液相色譜對(duì)流動(dòng)相及色譜柱、柱溫和流速的要求，考察了添加甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨等試劑對(duì)分離的影響，并比較了甲酸的不同酸度對(duì)分離的影響，最終確定了以0.1%甲酸-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫效果最佳。同時(shí)，分別進(jìn)行了柱溫30、35、40 ℃對(duì)于分離的影響，確定了柱溫為40 ℃時(shí)分離效果最佳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不添加銨鹽，僅調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，能夠使有效成分組中各成分得到較好分離，并得到良好的響應(yīng)信號(hào)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)主要色譜峰的來源進(jìn)行了歸屬和鑒定，共歸屬了42個(gè)主要色譜峰。盡管小續(xù)命湯組方各單味藥量相差不多，但對(duì)于全方的化學(xué)貢獻(xiàn)卻明顯不同，其中防己、防風(fēng)、黃芩、芍藥、甘草貢獻(xiàn)較大。而復(fù)方BPI圖中仍有一些色譜峰并未找到與其相對(duì)應(yīng)的物質(zhì)歸屬，這可能是由于該方組方成分復(fù)雜及提取過程中產(chǎn)生多種物質(zhì)間反應(yīng)，導(dǎo)致尚存在一定量的未鑒定成分。同時(shí)，本文首次報(bào)道了由小續(xù)命湯有效成分組中檢定出如下成分：烏頭堿，新烏頭堿，次烏頭堿，苯甲酰烏頭原堿，苯甲酰新烏頭堿，苯甲酰次烏頭堿，附子靈，人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1，甲基麻黃堿，芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷。

結(jié)合文獻(xiàn)分析，已鑒定的化合物中黃芩素抑制黑質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生成，并能增加多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量，同時(shí)其對(duì)谷氨酸引起的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，芍藥苷有抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活、保護(hù)神經(jīng)元免受損傷的作用，千層紙素A具有促神經(jīng)發(fā)生作用。這些化合物可能通過協(xié)同或互補(bǔ)在小續(xù)命湯中發(fā)揮治療腦缺血、阿爾茨海默病、高血脂等疾病的作用。

UPLC/Q-TOF-MSE技術(shù)可以快速、方便、有效地對(duì)中藥復(fù)方組分進(jìn)行特征圖譜表征和結(jié)構(gòu)分析，利用這一方法不僅對(duì)小續(xù)命湯復(fù)方的研究有著重要的貢獻(xiàn)，對(duì)其他中藥復(fù)方現(xiàn)代化的研究也有著異曲同工之處，且具有巨大的應(yīng)用潛力。然而此方法仍存在一些不足之處，如無法區(qū)分一些同分異構(gòu)體、手性化合物，無法提供化合物的立體構(gòu)型。為了得到化合物的具體結(jié)構(gòu)，仍需使用其他方法加以支持。

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UPLC/Q-TOF-MSEBasedAnalysisofChemicalCompositionofAF-Xiao-Xu-MingDecoction

CHEN Xirui，YANG Zhihong*

(Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193，China)

Objective：In order to clarify the chemical composition and the source of active component Xiao-Xu-Ming decoction (AF-XXMD) quickly and comprehensively，whole and individual herbs of AF-Xiao-Xu-Ming decoction were analyzed by Ultra-Performance Liquid Chromatography with Quadrupole-Time-of-Flight Mass Spectrometry(UPLC/Q-TOF-MSE).Methods：Under identical experiment conditions，chromatography results were compared between experiment groups.A Waters ACQUITY UPLC HSS T3 column (100 mm×2.1 mm，1.8 μm) was used with 0.1% formic acid solution (A) -acetonitrile (B) as the mobile phase for gradient elution.The flow rate was set to 0.35 mL·min-1and the column temperature was maintained at 40 ℃.Electrospray ion (ESI) source was applied for the qualitative analysis under the positive and negative ion mode.Results：Finally，based on comparison with standard samples，database matching analysis and reviewing relevant literature，42 compounds were identified from AF-Xiao-Xu-Ming decoction.The results implied that flavonoids，alkaloids and triterpenoid saponins were the main components in the effective part of AF-Xiao-Xu-Ming decoction.The herbal sources of these peaks were assigned.Conclusion：This established method is simple and rapid for elucidation the constituents of AF-Xiao-Xu-Ming decoction and the results could be used for the quality control and the further material basis research for AF-Xiao-Xu-Ming decoction.

AF-Xiao-Xu-Ming decoction；UPLC/Q-TOF-MSE；chemical composition

國家自然科學(xué)基金(81273654，81473579，81102879)；國家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)(2013ZX09103002-022)

] 楊志宏，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物代謝動(dòng)力學(xué)及中藥復(fù)方配伍機(jī)制；Tel：(010)57833219，E-mail：zhyang@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.012

2016-04-13)

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