白木香AsMAPK3基因的克隆及表達(dá)分析△

徐艷紅，田美慧，，孫佩文，高志暉，金鉞，魏建和， *

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所(中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，瀕危藥材繁育國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室)，北京 100193；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室)，海南 ?？?5703113.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

·專題·

白木香AsMAPK3基因的克隆及表達(dá)分析△

徐艷紅1，田美慧1，3，孫佩文1，高志暉1，金鉞1，魏建和1，2 *

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所(中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，瀕危藥材繁育國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室)，北京100193；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室)，海南 海口5703113.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040)

目的：克隆白木香中分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK) 基因，檢測(cè)其組織表達(dá)及誘導(dǎo)表達(dá)特性。方法：在454高通量測(cè)序獲得部分cDNA序列基礎(chǔ)上，利用RACE方法獲得全長(zhǎng)cDNA。采用NCBI在線Blastp、DNAman和MEGA4軟件，對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。隨后，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因的組織表達(dá)及誘導(dǎo)表達(dá)特性。結(jié)果：擴(kuò)增到了白木香中分裂原活化蛋白激酶基因AsMAPK3，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)特性分析。結(jié)論：通過(guò)AsMAPK3的克隆及分析，為后續(xù)驗(yàn)證其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

白木香；倍半萜；MAPK基因；表達(dá)分析

沉香是沉香屬物種受傷害后誘導(dǎo)產(chǎn)生的含樹(shù)脂木材，是珍稀瀕危南藥和高價(jià)值的世界性資源。但由于長(zhǎng)期以來(lái)的過(guò)度開(kāi)發(fā)使用，全世界產(chǎn)沉香的沉香屬和擬沉香屬物種均列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)附錄II[1]。瑞香科沉香屬植物白木香Aquilariasinensis(Lour.) Gilg是我國(guó)生產(chǎn)沉香的唯一正品植物來(lái)源。健康白木香樹(shù)體不能產(chǎn)生沉香，只有受到外界傷害后才啟動(dòng)響應(yīng)的代謝途徑在其傷口及周圍木質(zhì)部形成倍半萜等沉香類物質(zhì)[2-4]。課題組前期應(yīng)用解剖學(xué)、組織化學(xué)、生理學(xué)等多種手段揭示了“傷害誘導(dǎo)白木香防御反應(yīng)形成沉香”的結(jié)香機(jī)制[5-6]。然而，從“傷害信號(hào)到倍半萜合酶基因受誘導(dǎo)表達(dá)從而合成沉香倍半萜”的分子機(jī)制一直未得到清晰揭示，其中信號(hào)傳遞的過(guò)程還是一個(gè)暗箱。

MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng) (MAPK cascade) 被認(rèn)為是植物細(xì)胞將胞外刺激轉(zhuǎn)換成胞內(nèi)反應(yīng)的主要途徑之一[7]，負(fù)責(zé)外來(lái)信號(hào)的接收、傳遞和放大，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫反應(yīng)以及激素響應(yīng)等多種信號(hào)傳遞途徑中起著十分重要的作用[8-10]。它通過(guò)對(duì)效應(yīng)蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子等進(jìn)行磷酸化修飾，調(diào)控下游多途徑相關(guān)基因的表達(dá)[11-12]。MAPK在很多植物中已經(jīng)被功能鑒定，但藥用植物僅有西府海棠 (Malusmicromalus)[13]、湖北海棠[14]、姜黃 (Curcumalonga)[15]及鐵皮石斛 (Dendrobiumofficinale)[16]中進(jìn)行了MAPKs基因的克隆和表達(dá)分析，白木香中還沒(méi)有MAPK的相關(guān)報(bào)道。

為揭示傷害誘導(dǎo)沉香形成的分子機(jī)制，課題組前期進(jìn)行了健康和傷害白木香莖的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)傷害誘導(dǎo)一系列轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶的表達(dá)顯著上調(diào)，其中包括MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)[4]。那么，MAPK是否參與傷害信號(hào)誘導(dǎo)白木香結(jié)香的過(guò)程呢？本文在已有研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)RACE方法克隆了AsMAPK3基因的全長(zhǎng)，并對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行了分析，為后續(xù)深入研究其功能及清晰揭示“傷害信號(hào)→沉香倍半萜合成”這一分子網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料及處理 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所溫室栽培的三年生白木香的根、莖、葉、花用于提取總RNA，檢測(cè)AsMAPK3基因的組織表達(dá)特異性。三年生白木香莖誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷分別進(jìn)行茉莉酸甲酯(MeJA)和水楊酸(SA)處理，于處理后0h，3h，6h，12h，24h，48h 取樣，用于提取總RNA，檢測(cè)AsMAPK3基因在健康和傷害愈傷組織中的表達(dá)差異。

1.2方法

1.2.1RNA提取 利用RNA提取純化試劑盒 (Aidlab，China) 提取總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，分光光度計(jì)NanoDrop2000C (Thermo Scientific，USA) 測(cè)定RNA濃度。

1.2.2cDNA第一鏈的合成 RACE cDNA的合成：取約2μg RNA利用Super SMARTTMPCR cDNA合成試劑盒(Clontech，CA，USA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用Advantage?2PCR試劑盒(Clontech，CA，USA)擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程為RNA3μL，5′/3′-RACE CDS primer A1μL，SMART IITMA Oligonucleotide1μL，70℃，2min，冰上放置2min，短暫離心后，依次加入：5×First-Strand Buffer2μL，DTT(20mM)1μL，dNTP Mix(10mM)1μL，M-MLV1μL，42℃，1.5hr，再加入20μL Tricine-EDTA Buffer，72℃，7min，-20℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR 分析樣品的cDNA的合成：取約1μg RNA，以MMLV (Takara)為逆轉(zhuǎn)錄酶，以O(shè)ligod(T)18(Takara)為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.35′-RACE和3′-RACE454測(cè)序得到的unigene 預(yù)測(cè)為含部分ORF序列的MAPK基因。根據(jù)已知的ORF序列片段，利用 primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物 (見(jiàn)表1)，分別進(jìn)行5′ race和3′ race。PCR擴(kuò)增體系為25μL：5′/3′-RACE cDNA1.5μL，UPM(10×，通用引物見(jiàn)表1)2.5μL，Gene-specific primer (10μM)0.5μL，10×Advantage2PCR Buffer2.5μL，50×Advantage2Polymerase Mix0.5μL PCR-Grade Water17.5μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；然后94℃30s，72℃3min，5個(gè)循環(huán)；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5個(gè)循環(huán)；94℃30s，68℃30s，72℃3min，25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。巢式PCR為將以上第一輪RACE PCR產(chǎn)物1μL作為模板，用巢式引物和基因特異引物f2進(jìn)行第二輪PCR。程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；然后94℃30s，68℃30s，72℃3min，20個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收，連接到pMD-19T載體上(Takara)，由金唯智生物科技(北京)有限公司完成測(cè)序。將RACE測(cè)序結(jié)果與454測(cè)序結(jié)果拼接，得到能夠完整翻譯的基因全長(zhǎng)。

1.2.4LD-PCR擴(kuò)增 根據(jù)拼接的結(jié)果設(shè)計(jì)LD-PCR引物(見(jiàn)表1)，以反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板，PCR驗(yàn)證拼接序列的正確性。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；然后94℃30s，60℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)、回收、克隆和測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.5AsMAPK3的生物信息學(xué)分析 基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)采用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam (http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html)；采用TMHMM2.0進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；采用SWISS-MODEL (http：//swissmodel.expasy.org/) 進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和結(jié)構(gòu)域的三維建模；在線InterProScan對(duì)蛋白功能域進(jìn)行分析。

1.2.6進(jìn)化樹(shù)分析 將AsMAPK3翻譯的氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的MAPK氨基酸序列在線BLASTP比對(duì)，通過(guò)MEGA4軟件構(gòu)建 Neighbor-joining 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。進(jìn)化距離的計(jì)算采用泊松校正法，Bootstrap 重復(fù)次數(shù)為1000次。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR) 為了明確AsMAPK3基因在不同組織及不同傷害處理下的表達(dá)特性，利用熒光定量PCR進(jìn)行表達(dá)量的檢測(cè)。儀器采用伯樂(lè)的CFX96TM C1000實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)。反應(yīng)體系為：2×SYBR Premix Ex TaqTM5μL；正反向引物濃度均為0.25 μL；cDNA模板0.3 μL；加水補(bǔ)足至10 μL，每個(gè)反應(yīng)體系至少重復(fù)3次。實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)均以三磷酸甘油醛脫氫酶基因 (GAPDH) 為內(nèi)參[17]

表1 文中用到的引物

2 結(jié)果與分析

2.1AsMAPK3基因的5′/3′-RACE及全長(zhǎng)cDNA的克隆

為揭示傷害誘導(dǎo)沉香形成的分子機(jī)制，利用454測(cè)序技術(shù)對(duì)白木香轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析[4]，從差異表達(dá)基因中檢測(cè)到MAPK基因的表達(dá)顯著受傷害誘導(dǎo)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的部分ORF序列，設(shè)計(jì)基因特異引物5′/3′-f1和巢式引物5′/3′-f2，進(jìn)行5′/3′-RACE。擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1，第一輪PCR得到了彌散條帶 (見(jiàn)圖1A)，隨后以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪巢式PCR，各得到一條清晰的條帶 (見(jiàn)圖1B，C)，3′擴(kuò)增得到783 bp片段，5′擴(kuò)增得到402 bp片段。將第二次的條帶回收，連接到pMD19-T載體，并克隆測(cè)序。將三個(gè)測(cè)序片段拼接后得到含有完整ORF的全長(zhǎng)cDNA序列，其5′非翻譯區(qū)(UTR)為338 bp，3′ UTR為376 bp (包含28個(gè)polyA尾)，開(kāi)放閱讀框(ORF)1110 bp，推測(cè)編碼369個(gè)氨基酸。為進(jìn)一步驗(yàn)證拼接序列的可靠性，根據(jù)拼接的ORF序列，設(shè)計(jì)LD-PCR引物，結(jié)果擴(kuò)增出了1110 bp的特異條帶 (見(jiàn)圖1C)，測(cè)序結(jié)果與拼接序列完全一致。將該基因命名為AsMAPK3，GenBank 登錄號(hào)為KR 092345。

注：A：第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B，C：第二輪巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；D：LD-PCR產(chǎn)物 M1：DNA Marker2000；M2：DNA Marker5000；1和2：3′/5′-RACE 第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3：3′-RACE 第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4：5′-RACE第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5：全長(zhǎng)基因LD-PCR產(chǎn)物圖1 AsMAPK3基因的3′/5′-RACE擴(kuò)增結(jié)果

2.2AsMAPK3的生物信息學(xué)分析

2.2.1 AsMAPK3蛋白的理化特性分析 利用ExPASy Proteomics Server的在線軟件Protparam (http：//www.expasy.org/tools/protparam.html) 對(duì)As MAPK3蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。推測(cè)其分子式為C1902H2956N520O555S19，分子量為42.597 kD，帶正電殘基 (Arg+Lys) 為37，負(fù)電殘基 (Asp+Glu) 為51，脂肪系數(shù)為90.38，等電點(diǎn)pI 5.42，該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為41.15，為不穩(wěn)定性蛋白，平均親水性系數(shù)為-0.292，預(yù)測(cè)該蛋白為親水蛋白。

2.2.2 跨膜區(qū)、信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) TRMHMM server v2.0跨膜預(yù)測(cè)AsMAPK3編碼的蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域，為胞外蛋白。SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果顯示AsMAPK3蛋白為非分泌蛋白，不具有信號(hào)肽。亞細(xì)胞預(yù)測(cè)定位結(jié)果表明該蛋白定位在細(xì)胞核中。

2.2.3 功能域及位點(diǎn)分析 利用在線InterProScan軟件對(duì)AsMAPK3蛋白的結(jié)構(gòu)功能特點(diǎn)進(jìn)行分析顯示，37-331為蛋白激酶結(jié)構(gòu)域；43-67位氨基酸為ATP結(jié)合位點(diǎn)；72-175位為MAPK保守結(jié)構(gòu)域；159-171位為絲氨酸/蘇氨酸活性位點(diǎn)。

2.2.4 AsMAPK3氨基酸序列的分子系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用NCBI在線BlastP工具，將AsMAPK3與GenBank 中其他植物的MAPK3蛋白進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)MEGA 4軟件采用相鄰連接法構(gòu)建MAPK3進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行聚類關(guān)系分析。結(jié)果如圖2所示，MAPK3蛋白具有高度保守性，都含有MAPK家族保守的功能域GAYGIVC和MTEYVV，與棉花(Gossypiumarboreum)、可可(Theobromacacao)、巨桉(Eucalyptusgrandis)和甜橙(Citrussinensis)的同源性達(dá)92%。圖3所示為13個(gè)植物物種及來(lái)自人腦和小鼠肌肉的MAPK3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，AsMAPK3與甜瓜(Citrusmelo)，巨桉(Eucalyptusgrandis)在一個(gè)分支，說(shuō)明在所選蛋白中二者的親緣關(guān)系最近，在功能上也可能類似。另外，聚類圖明顯將植物來(lái)源和動(dòng)物來(lái)源的MAPK3家族分為兩個(gè)大的分支，說(shuō)明二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。植物的13個(gè)MAPK3蛋白家族聚為一個(gè)大的分支，親緣關(guān)系較近；而小鼠和人的MAPK3蛋白聚為另外一個(gè)分支，二者親緣關(guān)系較近。

圖2 AsMAPK3與其他植物來(lái)源的4個(gè)MAPK3的氨基酸序列比對(duì)

圖3 AsMAPK3與來(lái)源其他植物的12個(gè)MAPK3及來(lái)自人腦和小鼠肌肉組織的MAPK3的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3AsMAPK3基因的組織表達(dá)特異性分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AsMAPK3基因的組織表達(dá)特異性，結(jié)果表明該基因在葉中的表達(dá)量最高，其次是莖、根，花中的表達(dá)量最低 (見(jiàn)圖4)，說(shuō)明AsMAPK3可能主要在葉中發(fā)揮生物學(xué)功能，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育。另外，白木香莖桿和根是沉香合成的主要部位，推測(cè)AsMAPK3除了對(duì)調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用外，還可能參與調(diào)控沉香倍半萜的生物合成。

圖4 AsMAPK3基因在組織中的表達(dá)情況

2.4AsMAPK3基因響應(yīng)不同傷害處理的表達(dá)特性分析

健康的白木香只有受到外界傷害后才能產(chǎn)生沉香類物質(zhì)。茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)是植物對(duì)外界傷害(機(jī)械傷害、蟲(chóng)咬等)和病原菌侵染做出反應(yīng)而誘導(dǎo)抗性基因表達(dá)的信號(hào)分子[18-19]。為了研究AsMAPK3基因的表達(dá)是否受這兩個(gè)激素的調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR的方法對(duì)AsMAPK3在二種激素處理下不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量進(jìn)行了分析 (見(jiàn)圖5)。結(jié)果表明，AsMAPK3主要受MeJA處理的誘導(dǎo)，6 h 時(shí)達(dá)到最高表達(dá)水平，36 h下降到正常狀態(tài)表達(dá)水平；AsMAPK3的表達(dá)受SA對(duì)影響較小，處理12 h后升高2倍，24 h后逐漸下降，至36 h表達(dá)量反而受到抑制，只有正常表達(dá)水平的一半。

圖5 AsMAPK3響應(yīng)MeJA和SA處理的表達(dá)特性

3 討論

蛋白激酶是植物體內(nèi)一類重要的調(diào)節(jié)酶，而促分裂原活化蛋白激酶MAPK廣泛存在于各種真核生物體內(nèi)，是一類絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶。它與上下游一些信號(hào)分子組成MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)各種生物和非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8-10]。研究表明，MAPK的活化是植物感知外界傷害的最早期信號(hào)反應(yīng)之一[20-23]。

白木香是典型的誘導(dǎo)型藥用植物，只有受到外界傷害時(shí)才能啟動(dòng)相應(yīng)的代謝途徑合成倍半萜等沉香類物質(zhì)。本研究首次從白木香中克隆了AsMAPK3基因，并對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行了初步分析。AsMAPK3具有MAPK蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域和典型的激酶特性，推測(cè)其可能與其他物種的MAPK3具有相似的生物學(xué)功能。擬南芥基因組中共有20個(gè)MAPK基因，但MPK3、MPK4和MPK6是協(xié)調(diào)各種防御反應(yīng)(包括植保素誘導(dǎo)和防御基因的激活)的最重要的三個(gè)MAPKs[24]。AsMAPK3與擬南芥中MPK3同源性最高，其次是MPK6和MPK4，暗示AsMAPK3可能參與傷害誘導(dǎo)白木香發(fā)生的防御反應(yīng)。JA是植物防御反應(yīng)應(yīng)答和次生代謝物質(zhì)積累的重要信號(hào)分子，在白木香誘導(dǎo)結(jié)香中扮演重要角色[4，25]，本研究中qRT-PCR的結(jié)果表明，AsMAPK3的表達(dá)受JA誘導(dǎo)顯著，6 h達(dá)到峰值，之后逐漸下降至36 h恢復(fù)正常水平，說(shuō)明AsMAPK3屬于傷害早期響應(yīng)基因。但其轉(zhuǎn)錄水平對(duì)SA處理幾乎不響應(yīng)。這與JA和SA對(duì)沉香誘導(dǎo)形成的效果相一致[4，25]。推測(cè)AsMAPK3可能在JA介導(dǎo)的信號(hào)途徑中參與調(diào)控沉香倍半萜的形成。另外，組織表達(dá)的結(jié)果顯示，AsMAPK3主要在葉片中表達(dá)，其次是在根莖中。說(shuō)明AsMAPK3除了在傷害誘導(dǎo)的防御反應(yīng)中參與誘導(dǎo)白木香結(jié)香過(guò)程，還參與調(diào)控植物正常生長(zhǎng)發(fā)育。本研究為進(jìn)一步研究AsMAPK3蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)，對(duì)探明其參與傷害信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及調(diào)控傷害誘導(dǎo)沉香形成的分子機(jī)制具有重要意義。但是，AsMAPK3究竟在沉香形成的過(guò)程發(fā)揮怎樣的作用，與信號(hào)通路中其他蛋白如何相互作用等機(jī)制有待更深入的探討。

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CloningandExpressionAnalysisofAsMAPK3fromAquilariasinensis(Lour.)Gilg

XU Yanhong1，TIAN Meihui1，3，SUN Peiwen1，GAO Zhihui1，JIN Yue1，WEI Jianhe1，2*

(1.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education & National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；2.Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine & Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization，Hainan Branch of the Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Haikou 570311，China；3.Northeast Forestry University，Harbin 150040)

Objective：To clone a mitogen-activated protein kinase (MAPK) gene fromAquilariasinensis(Lour.) Gilg，and to analyze its expression profiles in different tissues and inducers.Methods：Rapid amplification of cDNA ends (RACE) technology was used to clone the full-length cDNA of the MAPK gene on the basis of its partial cDNA sequence obtained from our previous 454-sequenced dataset.Using NCBI online Blastp，DNAman and MEGA4，the sequences were bioinformatically analyzed.After that，its expression profiles in different tissues and inducers were analyzed by real-time PCR.Results：The MAPK gene，AsMAPK3 was cloned fromA.sinensisand its expression profiles were analyzed.Conclusion：Our works on gene cloning and expression analysis provide a substantial foundation for follow-up biofunction analysis of theAsMAPK3.

Aquilariasinensis；sesquiterpene；MAPK；expression analysis

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (81573525，81673549)；海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目(ZDKJ2016004)；中組部“萬(wàn)人計(jì)劃”(99950534)

] 魏建和，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥用植物基因資源、分子育種及次生代謝產(chǎn)物調(diào)控研究；Tel：010-57833016，E-mail：wjianh@263.net

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.006

2017-05-29)

*[