44批次不同來(lái)源國(guó)產(chǎn)沉香藥材松香酸類物質(zhì)的檢測(cè)△

馮劍，劉洋洋*，魏建和，2*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室)，海南 ?？?570311；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所(中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，瀕危藥材繁育國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室)，北京 100193)

·專題·

44批次不同來(lái)源國(guó)產(chǎn)沉香藥材松香酸類物質(zhì)的檢測(cè)△

馮劍1，劉洋洋1*，魏建和1，2*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所海南分所(海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室)，海南 ?？?570311；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所(中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，瀕危藥材繁育國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室)，北京 100193)

目的：考察不同來(lái)源的44批次沉香藥材含松香酸類物質(zhì)情況，為沉香藥材正確使用提供依據(jù)。方法：建立超高效液相色譜法，并結(jié)合乙酸銅化學(xué)顯色反應(yīng)和薄層色譜法對(duì)沉香藥材中松香酸類物質(zhì)進(jìn)行鑒別分析。結(jié)果：44批次不同來(lái)源的沉香樣品中，藥材市場(chǎng)所售10批次沉香藥材中松香酸類物質(zhì)檢出率達(dá)40%；其余34批次沉香藥材(包括19批次通體結(jié)香技術(shù)產(chǎn)沉香，5批次火烙法產(chǎn)沉香和10批次野生沉香)均未檢出松香酸類物質(zhì)。結(jié)論：采用通體結(jié)香技術(shù)等方法產(chǎn)的沉香藥材和野生沉香不含松香酸類物質(zhì)，但藥材市場(chǎng)所售沉香藥材有摻入松香酸類物質(zhì)的現(xiàn)象。

沉香；松香酸；薄層色譜；超高效液相色譜

沉香為名貴藥材，臨床應(yīng)用廣泛，在我國(guó)160余種中成藥、藏藥、蒙藥組方中使用，始載于梁代陶弘景的《名醫(yī)別錄》，被列為上品[1]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》收錄的沉香來(lái)源于瑞香科Thymelaeaceae沉香屬AquilariaLam.植物Aquilariasinensis(Lour) Gilg 含有樹(shù)脂的木材，沉香具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效，主治胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急[2-3]。由于野生沉香資源短缺，沉香價(jià)格高，此外，中藥材和中成藥成分復(fù)雜，藥品標(biāo)準(zhǔn)不能按照化學(xué)藥品同樣進(jìn)行全成分檢測(cè)，添加化學(xué)物質(zhì)不易被識(shí)別，隱蔽性較強(qiáng)[4]。松香酸是松香的主要萜類化合物成分，具有特殊的香氣，添加松香酸類物質(zhì)可使沉香藥材浸出物增大，不易被發(fā)現(xiàn)，大量服用對(duì)中樞神經(jīng)有極大的損害[5]。吳萌等(2010)發(fā)現(xiàn)有用松香液浸泡的市售摻假沉香，張妤琳等(2011)和許偉帥等(2016)建立了沉香添加松香酸的鑒別方法[5-7]，其他中藥材，如沒(méi)藥[8]、乳香[9]及中成藥，如西黃丸[10]、冠脈寧片(膠囊)[11]、麝香接骨膠囊[12]、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎片[13]也發(fā)現(xiàn)有添加松香酸類物質(zhì)。文獻(xiàn)報(bào)道中發(fā)現(xiàn)沉香藥材中存在添加松香酸類物質(zhì)，研究材料選擇不具代表性，并未考慮不同來(lái)源(野生沉香和火烙香、通體香沉香等人工結(jié)香技術(shù)產(chǎn)沉香)的沉香藥材是否存在添加松香酸類物質(zhì)。目前，人工栽培的沉香主要以通體結(jié)香技術(shù)法、火烙法、半斷桿法為主要的結(jié)香方法。而基于傷害誘導(dǎo)沉香形成機(jī)理的通體結(jié)香技術(shù)“Agar-Wit”在世界范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣泛，該方法具有三高一穩(wěn)定的特點(diǎn)[14-16]，采用通體結(jié)香技術(shù)極大的提高了沉香產(chǎn)量，且結(jié)香6個(gè)月的通體結(jié)香沉香藥材可滿足《中華人民共和國(guó)藥典》的要求，結(jié)香20個(gè)月的沉香品質(zhì)不低于野生沉香[17]；此外，火烙法也是國(guó)內(nèi)種植生產(chǎn)沉香的主要方法。

本實(shí)驗(yàn)在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，利用乙酸銅化學(xué)顯色、薄層色譜(TLC)及超高液相色譜法(UPLC)技術(shù)，研究不同來(lái)源(通體結(jié)香技術(shù)法、火烙法、野生和市售)沉香中摻入松香酸的情況，旨在較全面的考察不同來(lái)源的沉香藥材是否含有松香酸類物質(zhì)，及評(píng)估通體結(jié)香技術(shù)法生產(chǎn)的沉香的質(zhì)量，為沉香藥材使用提供技術(shù)參考。

1 試藥與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)材料

沉香藥材樣品分別為通體結(jié)香技術(shù)、火烙法、打釘法等方法生產(chǎn)的沉香藥材及野生沉香藥材，共計(jì)44批次，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。所用沉香藥材樣品均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所沉香鑒定中心標(biāo)本館提供，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所魏建和研究員鑒定44批次沉香藥材均為沉香屬含有樹(shù)脂的木材。沉香對(duì)照藥材(121222-201102)和松香酸對(duì)照品(111938-201201)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

表1 實(shí)驗(yàn)用國(guó)產(chǎn)沉香藥材基本信息

1.2儀器與試劑

超高效液相色譜儀(Waters ACQUITY UPLC-H Class)；色譜柱(ACQUITY UPLC BEH C18，50mm×2.1mm，1.7μm)。XS105DualRange 十萬(wàn)分之一電子天平，PL203千分之一電子天平(METTLER TOLEDO)；PS-40超聲波清洗機(jī)、JY025型紫外分析儀、WH-S微型渦旋混合儀。

無(wú)水乙酸銅(AR，GOLD WHEAT公司)，石油醚60～90℃(AR，西隴化工股份有限公司)，乙酸乙酯(AR，西隴化工股份有限公司)，冰醋酸(AR，廣州化學(xué)試劑廠)，乙腈(色譜純，默克化工技術(shù)(上海)有限公司)、甲酸(AR，西隴化工股份有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

2 方法

2.1化學(xué)顯色鑒別

取樣品粉末1g，置具塞三角瓶中，加10mL石油醚(60～90℃)，渦旋振蕩2min，0.45μm濾膜濾過(guò)，取濾液4mL，置試管中，加新配制的0.5%乙酸銅溶液4mL，渦旋10s，靜置分層。

2.2薄層色譜鑒別

取樣品粉末1.0 g，加石油醚(60～90 ℃)10 mL，渦旋振蕩2 min，濾過(guò)，濾液濃縮至1 mL作為供試品溶液。取松香酸對(duì)照品5 mg，加石油醚(60～90 ℃)5 mL溶解，作為對(duì)照品溶液。按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部 0502薄層色譜試驗(yàn)，吸取上述供試品和對(duì)照品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(9∶1∶0.1)展開(kāi)，取出，晾干。置紫外燈光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與松香酸對(duì)照品色譜位置，不得顯示相應(yīng)的淬滅斑點(diǎn)，再噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外燈(365 nm)下檢視。

2.3超高效液相色譜鑒別

2.3.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸(75∶25)，檢測(cè)波長(zhǎng)：241 nm，柱溫：30 ℃，流速：0.5 mL/min。

2.3.2 溶液制備 對(duì)照品溶液：精密稱取松香酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.1 mg對(duì)照品的溶液。供試品溶液：精密稱取樣品粗粉1.0 g，精密加入甲醇20 mL，超聲處理20 min，放冷，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1化學(xué)顯色鑒別

利用松香酸能夠充分地溶解在石油醚(60～90 ℃)等有機(jī)溶劑的性質(zhì)，結(jié)合現(xiàn)配的乙酸銅溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)。按照“2.1化學(xué)顯色鑒別”操作步驟，進(jìn)行顯色實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，19批通體結(jié)香技術(shù)生產(chǎn)的沉香藥材、10批野生沉香藥材、5批火烙法生產(chǎn)的沉香藥材均未檢出松香酸，10批藥材市場(chǎng)上購(gòu)買的沉香中有4批檢出松香酸，石油醚層顯藍(lán)綠色，同時(shí)設(shè)置以不添加樣品為空白對(duì)照，以松香和1%松香+沉香混合物為陽(yáng)性對(duì)照，該化學(xué)顯色鑒別反應(yīng)良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 化學(xué)顯色鑒別結(jié)果

注：“+”表示石油醚層顯示藍(lán)綠色；“-”表示石油醚層顯示無(wú)色；“CK”表示石油醚代替樣品組。

3.2薄層色譜鑒別

按照“2.2薄層色譜鑒別”項(xiàng)操作步驟，對(duì)所有沉香樣品開(kāi)展薄層色譜鑒別。在紫外燈光(254nm)條件下檢視，19批通體結(jié)香技術(shù)生產(chǎn)沉香樣品(見(jiàn)圖1)、10野生沉香樣品(見(jiàn)圖2)、5批火烙法生產(chǎn)的沉香樣品(見(jiàn)圖3)與松香酸對(duì)照品溶液相同位置上，沒(méi)有顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)，松香、1%松香+沉香樣品與松香酸對(duì)照品溶液相同位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)。10批市售沉香中有4批沉香與松香酸對(duì)照品溶液相同位置上，顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)(見(jiàn)圖4)。噴以10%硫酸乙醇溶液，烘干加熱至斑點(diǎn)顯色，置紫外燈(365nm)下檢視，在相同的位置顯示藍(lán)色的熒光斑點(diǎn)，其結(jié)果有化學(xué)鑒別一致。

注：左：254 nm熒光檢視；右：噴10%硫酸乙醇后365 nm檢視；1～19為通體結(jié)香技術(shù)生產(chǎn)的沉香藥材樣品；sxs為松香酸，sx為松香，下同。圖1 19批通體結(jié)香技術(shù)生產(chǎn)的沉香藥材樣品薄層色譜鑒別

注：左：254 nm熒光檢視；右：噴10%硫酸乙醇后365 nm檢視；20～29為野生沉香藥材樣品。圖2 10批野生沉香藥材樣品薄層色譜鑒別

注：左：254 nm熒光檢視；右：噴10%硫酸乙醇后365 nm檢視；30～34為火烙法生產(chǎn)的沉香樣品。圖3 5批火烙法生產(chǎn)的沉香藥材樣品薄層色譜鑒別

注：左：254 nm熒光檢視；右：噴10%硫酸乙醇后365 nm檢視；35～44為市售沉香。圖4 10批市售沉香藥材樣品薄層色譜鑒別

3.3超高效液相色譜鑒別

液相色譜鑒別是常見(jiàn)的定性和定量鑒別的方法，與相比普通液相比超高效液具有靈敏性高、樣品用量少和檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。本文首次采用超高效液相色譜法對(duì)上述的44份沉香樣品進(jìn)行驗(yàn)證分析。按照“2.3超高效液相色譜鑒別”項(xiàng)的步驟，分別用0.45μm的濾膜過(guò)濾得沉香樣品、松香酸樣品及1%松香+沉香樣品注入超高效液相色譜儀中1μL，記錄色譜圖。如圖5松香酸對(duì)照品的出峰保留時(shí)間為2.929min，光譜掃描波長(zhǎng)在239nm出有最大吸收峰AU=0.924，圖6中19批通體結(jié)香技術(shù)生產(chǎn)沉香樣品、10批野生沉香樣品和5批火烙沉香未檢測(cè)出與松香酸對(duì)照品出峰位置相同的松香酸吸收峰，10批市售沉香中有4批檢測(cè)到了與松香酸對(duì)照品出峰位置相同的吸收峰，表明4批樣品中有人為非法添加松香酸類物質(zhì)。

圖5 松香酸對(duì)照品色譜圖及光譜掃描圖

圖6 沉香樣品中松香酸檢測(cè)色譜圖

4 討論與結(jié)論

沉香在醫(yī)藥、香精香料、宗教祭祀和工藝品收藏等方面應(yīng)用廣泛，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求量巨大，價(jià)格日益俱增。市場(chǎng)上各類假冒偽劣沉香品泛濫，本研究發(fā)現(xiàn)44批次不同來(lái)源的沉香樣品中，藥材市場(chǎng)所售10批次沉香藥材中松香酸類物質(zhì)檢出率達(dá)40%；其余34批次沉香藥材(包括19批次通體結(jié)香技術(shù)產(chǎn)沉香，5批次火烙法產(chǎn)沉香和10批次野生沉香)均未檢出松香酸類物質(zhì)。與前人研究相比，本研究選擇不同來(lái)源的沉香藥材(野生沉香藥材、通體結(jié)香技術(shù)生產(chǎn)的沉香藥材、火烙法生產(chǎn)的沉香藥材、打釘法生產(chǎn)的沉香藥材)，較全面的考察了不同來(lái)源的是否添加松香酸類物質(zhì)。明確了19批次采用通體結(jié)香技術(shù)生產(chǎn)的沉香藥材沒(méi)有添加松香酸類物質(zhì)。通體結(jié)香技術(shù)可以免受象傳統(tǒng)結(jié)方式對(duì)樹(shù)體傷害大且所產(chǎn)沉香品質(zhì)不穩(wěn)定情況，能夠生產(chǎn)出高質(zhì)、高量和穩(wěn)定的沉香，也是我國(guó)中藥材沉香的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照藥材的來(lái)源，采用通體結(jié)香技術(shù)等方法產(chǎn)的沉香藥材和野生沉香不含松香酸類物質(zhì)，但藥材市場(chǎng)所售沉香藥材有摻入松香酸類物質(zhì)的現(xiàn)象。

此外，筆者已利用 UPLC-MS/MS和UPLC-Qtof進(jìn)一步精準(zhǔn)定性和定量考察，同時(shí)結(jié)合GC-MS分析沉香藥材是否非法添加松香酸類物質(zhì)。

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IdentificationofAbieticAcidfrom44DifferentKindsofChineseAgarwood

FENG Jian1，LIU Yangyang1*，WEI Jianhe1，2*

(1.Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine & Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization，Hainan Branch of the Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Haikou 570311，China;2.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine，Ministry of Education & National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193，China)

Objective：To identify abietic acid from 44 different kinds of Chinese agarwood，so as to provide the basis for the proper use.Methods：An UPLC method for determination of abietic acid was established，combining chemical color reaction of cupric acetate and TLC，the abietic acid in agarwood were identified and determined.Results：Abietic acid in 4 batches of commercially available agarwood samples，and the relevance ratios was 40%，the other 34 batches of agarwood were not detected.Conclusion：There is no abietic acid in the medicinal materials of agarwood induced by whole-tree agarwood-inducing technique，but the phenomenon of illegal incorporation of agarwood containing acids into the market is rather serious.

Agarwood；abietc acid；TLC；UPLC

國(guó)家自然科學(xué)基金(81403055)；海南省重大科技計(jì)劃項(xiàng)目(ZDKJ2016004);海南省自然科學(xué)基金(20168369)

] 劉洋洋，副研究員，研究方向：中藥質(zhì)量控制、中藥材標(biāo)準(zhǔn)研制研究，Tel：(0898)31589007，E-mail：eadchris@163.com;魏建和，研究員，研究方向：藥用植物基因資源、分子育種與次生代謝產(chǎn)物調(diào)控研究，Tel：(010)57833016，E-mail：wjianh@263.net

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.004

2017-06-02)

*[