抗結(jié)核海洋放線菌的篩選及菌株HY286生物活性研究

瞿佳 趙玲俠 陳銳 路鵬鵬 孫曉宇 沈衛(wèi)榮

（陜西省微生物研究所微生物資源中心，西安 710043）

抗結(jié)核海洋放線菌的篩選及菌株HY286生物活性研究

瞿佳 趙玲俠 陳銳 路鵬鵬 孫曉宇 沈衛(wèi)榮

（陜西省微生物研究所微生物資源中心，西安 710043）

海洋放線菌是研究抗結(jié)核藥物及其先導(dǎo)化合物的重要來源。以恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，Msm）作為指示菌，采用平板對(duì)峙法，從漳州淺灘泥土分離的77株放線菌中篩選出9株對(duì)Msm具有抑制作用的抗性放線菌，其中1株對(duì)Msm具有高效抑制作用的拮抗放線菌HY286。通過對(duì)菌株HY286的菌落形態(tài)觀察、生理生化鑒定及16S rDNA序列分析，初步鑒定其為一株馬杜拉屬放線菌。通過測(cè)定菌株HY286發(fā)酵產(chǎn)物的抗恥垢分枝桿菌MIC值、抗菌活性和細(xì)胞毒活性。結(jié)果表明，該菌株產(chǎn)生化合物的抗恥垢分枝桿菌MIC值為200 μg/mL，具有較好的抗結(jié)核分枝桿菌的潛力，且對(duì)枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌也具有較好的抑制作用，對(duì)HeLa和HepG2的抑制率分別為89.3%和94.2%。

抗結(jié)核；馬杜拉屬；海洋放線菌；篩選；生物活性

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引發(fā)的傳染性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康［1］。近年來，由于人口流動(dòng)性增大，以及多藥耐藥結(jié)核病及廣泛耐藥結(jié)核病檢出率不斷增加，使得目前抗結(jié)核藥物的藥效急劇下降，結(jié)核病的流行趨勢(shì)逐年回升［2］。面對(duì)結(jié)核病現(xiàn)狀，篩選新型結(jié)核藥物靶標(biāo)，研發(fā)新型抗結(jié)核藥物已成為當(dāng)務(wù)之急［3］。

海洋放線菌是研究潛力新藥先導(dǎo)化合物的重要研究資源［4］，由于海洋放線菌生存環(huán)境具高鹽、高壓、低溫、寡營(yíng)養(yǎng)、無光照等特點(diǎn)，使其具有獨(dú)特的代謝途徑，這為開發(fā)新型微生物資源及發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化合物提供了重要來源［5］。近十幾年來，已從海洋放線菌中分離獲得了多種新型抗性菌株，如砂嗜鹽產(chǎn)孢菌（Salinispora arenicola）［6］、海洋疣孢菌（Verrucosipora maris）［7］、海孢菌（Marinispora sp.）［8］等，可用于生產(chǎn)如抗腫瘤制劑［9］、抗感染制劑［10］和免疫抑制劑［11］等。

由于結(jié)核分枝桿菌MTB具有高度的傳染性和較長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期，直接應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌篩選發(fā)現(xiàn)抗結(jié)核新藥存在極大限制［12］。而恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，Msm）具有生長(zhǎng)迅速、安全性高等特點(diǎn)，可作為模式菌替代MTB篩選具有抗結(jié)核活性的菌株及化合物［13-14］。

本研究從福建省漳州市東山縣海洋淺灘泥土樣中分離篩選出一株對(duì)恥垢分枝桿菌具有較好抑制作用的拮抗放線菌，對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行MIC及生物活性測(cè)定，并進(jìn)行多樣性分析，旨為下一步從該菌株中分離出具抗結(jié)核活性代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)，以及為結(jié)核病防治的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與培養(yǎng)基 土壤樣品采集自福建省漳州市東山縣海洋淺灘，取15 cm 處土樣，裝入無菌樣品袋內(nèi)，于 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

供試菌株：恥垢分枝桿菌由陜西省西安市疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，簡(jiǎn)稱 BS）、大腸桿菌（Escherichia coli，EC）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus，BP）、金黃色葡萄球菌（Staphlococcus aureus，SA）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus，簡(jiǎn)稱ML）、白色假絲酵母（Candida albicans，CA）和黑曲霉（Aspergillus niger，AN）由陜西省微生物研究所微生物資源中心保藏。人子宮頸癌 HeLa細(xì)胞、人肝癌 HepG2 細(xì)胞，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。

供試培養(yǎng)基：高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，H2O 500 mL，海水500 mL，pH 7.4-7.6。用于放線菌的分離和純化，同時(shí)培養(yǎng)基中添放線菌酮50 ppm，萘啶酮酸25 ppm。

燕麥培養(yǎng)基：燕麥片20 g（加部分水煮20 min，然后經(jīng)離心或過濾得澄清濾液并補(bǔ)水至500 mL），微量鹽1 mL，海水500 mL，pH 7.2-7.4，用于放線菌的培養(yǎng)。改良LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，甘油 10 g，ddH2O 1 000 mL，pH 7.2-7.4。用于恥垢分枝桿菌的培養(yǎng)。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g。用于真菌的培養(yǎng)。若制備固體培養(yǎng)基需加入 20 g/L 瓊脂。

1.1.2 主要儀器 隔水式培養(yǎng)箱 GH500（北京科偉永興儀器有限公司），立式壓力蒸汽滅菌鍋 LDZX-50KBS（上海申安醫(yī)療器械廠），搖瓶培養(yǎng)箱 TS-2102（上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司），高速冷凍離心機(jī) GL-20G-H（上海安亭科學(xué)儀器廠），基因擴(kuò)增儀（TProfessional Standard Gradient 96），CO2培養(yǎng)箱 3110 Series（Forma Scientific，Inc 公司），酶標(biāo)儀MVLTISKAWMK3（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 取 5 g 土樣加入 45 mL生理鹽水中，震蕩5 min 后，分別稀釋102-107倍后，取各稀釋液100 μL 涂布于高氏一號(hào)平板上，每個(gè)濃度重復(fù)3次，28℃倒置培養(yǎng)14 d。待平板內(nèi)長(zhǎng)出單菌落后，挑取不同形態(tài)的單菌落于新的平板上劃線純化。

1.2.2 抗恥垢分枝桿菌菌株的篩選 采用平板對(duì)峙法測(cè)定純化菌株對(duì)恥垢分枝桿菌的抗性作用，即取100 μL生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的恥垢分枝桿菌菌液涂布于改良LB平板上，待菌液晾干后，用打孔器（7 mm）接種1塊待篩選菌株的菌絲塊，37℃、倒置培養(yǎng)2-3 d后，測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)3次。

1.2.3 菌株的初步鑒定 將篩選到的菌株劃線接種于燕麥培養(yǎng)基（ISP3）平板上，28℃培養(yǎng) 7 d，觀察菌落形態(tài)。參照《常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行碳源利用、硝酸鹽利用、淀粉利用、明膠液化等試驗(yàn)［15］。

參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》提取菌株HY286的基因組DNA［16］。16S rDNA基因 PCR 擴(kuò)增引物為：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'） 和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。擴(kuò)增條 件 為 ：首先94℃預(yù)變性5 min；94℃下變性1 min，55℃ 退火45 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化后由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行Blast相似性比對(duì)分析，運(yùn)用ClustalX和 MEGA5.1軟件選取N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［17］。

1.2.4 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)物制備 將菌株HY286劃線接種于100 mL固體燕麥培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)14 d，切碎培養(yǎng)基，用等體積的提取液，即：乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸=80∶15∶5（V∶V∶V）萃取 3 次，合并提取液，將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 45℃減壓濃縮至干，甲醇充分溶解于2 mL玻璃樣品瓶中，得到該菌株發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物抗恥垢分枝桿菌的MIC值測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法［10］測(cè)定菌株發(fā)酵產(chǎn)物抗恥垢分枝桿菌的MIC值。將倍比稀釋后不同濃度的發(fā)酵產(chǎn)物分別加到滅菌的96孔板中，第1至第11孔加藥液，濃度分別為1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100 和 50 μg/mL 每孔 10 μL，第 12孔不加藥。將濃度約0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的恥垢分枝桿菌菌懸液，經(jīng)肉湯1∶100稀釋后，向每孔中加100 μL，密封后37℃培養(yǎng)72-96 h判斷結(jié)果，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性測(cè)定 采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定抗菌活性。將樣品瓶中的發(fā)酵產(chǎn)物抽干，稱重后甲醇定容至 20 mg/mL，作為抗菌活性測(cè)定的母液。取10 μL母液加于直徑5 mm的濾紙片上，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.7 發(fā)酵產(chǎn)物的細(xì)胞毒活性測(cè)定 用MTT法測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的抗腫瘤活性。將培養(yǎng)好的腫瘤細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，用血細(xì)胞板計(jì)數(shù)并稀釋至細(xì)胞濃度為6×104-1×105個(gè)/mL。將細(xì)胞接種在96孔板中，每孔80 μL。另設(shè)2個(gè)沒有細(xì)胞、僅有80 μL培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔用于儀器調(diào)零。將96孔板置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后加入20 μL用培養(yǎng)液稀釋好的樣品，樣品終濃度為50 μg/mL和100 μg/mL。同時(shí)，在陽(yáng)性對(duì)照孔加20 μL順鉑（100 μg/mL），在陰性對(duì)照孔和空白對(duì)照孔各加20 μL培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每孔加10 μL 5 mg/mL MTT。37℃反應(yīng)3 h，每孔加100 μL MTT終止液反應(yīng)8-12 h。用酶標(biāo)儀比色測(cè)定（595 nm）。

2 結(jié)果

2.1 恥垢分枝桿菌抗性菌株的分離篩選

本研究從土壤樣品中分離獲得77株放線菌，篩選獲得9株具恥垢分枝桿菌抗性的菌株，占總分離菌株數(shù)的11.69%。不同菌株抑菌圈大小見表1，其中菌株HY286對(duì)恥垢分枝桿菌的抑菌效果最佳，抑菌圈達(dá) 22.3 mm（＞20 mm）（圖 1）。

表1 不同抗性菌株對(duì)恥垢分枝桿菌的抑菌作用

圖1 HY286抗恥垢分枝桿菌抑菌圈

2.2 菌株HY286的分類鑒定

菌株HY286在燕麥固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，菌落初期為白色，隨著孢子的不斷形成，菌落逐漸變?yōu)榈凵练奂t色。通過對(duì)菌株HY286進(jìn)行生理生化相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。結(jié)果（表2）表明，菌株HY286可在25-40℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)，可液化明膠、水解淀粉、還原硝酸鹽，不能使牛奶凝固、胨化，不產(chǎn)生H2S和黑色素。能利用葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、肌醇、半乳糖，不能利用棉籽糖、乳糖。

表2 HY286的生理生化特性

對(duì)篩選獲得的抗性菌株均進(jìn)行16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序，根據(jù)GenBank分析序列及同源性比對(duì)，通過N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖2）表明，HY286屬 于 馬 杜 拉 屬（Actinomadura）， 而另外8種抗性菌株中FDF35屬于擬諾卡氏屬（Nocardiopsis），JMB12屬于韓國(guó)生工屬（Kribbella），其余6株屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）。

2.3 菌株HY286發(fā)酵產(chǎn)物抗恥垢分枝桿菌的MIC值及其抗菌活性、細(xì)胞毒活性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，菌株HY286發(fā)酵產(chǎn)物的抗恥垢分枝桿菌的MIC為200 μg/mL，其對(duì)枯草芽孢桿菌（BS）和短小芽孢桿菌（BP）具有一定的抑制作用，100 μg發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)枯草芽孢桿菌（BS）和短小芽孢桿菌（BP）的抑菌圈大小均超過10 mm，達(dá)到15 mm和12 mm。

菌株HY286發(fā)酵產(chǎn)物在50 μg/mL時(shí)對(duì)HeLa和HepG2的抑制率分別為54.6%和54.5%，在100 μg/mL時(shí)對(duì)HeLa和HepG2的抑制率分別為93.7%和86.9%。

3 討論

海洋放線菌由于其特殊的生長(zhǎng)環(huán)境，通常具有特殊的代謝途徑和遺傳背景，形成了與陸生微生物不同的種類、生理形狀及特征，使其具備了產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能特殊的代謝產(chǎn)物的能力［19］。Goodfellow和Fiedler統(tǒng)計(jì)了目前海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的50個(gè)放線菌屬，研究表明多數(shù)海洋放線菌均可代謝產(chǎn)生具有生物活性物質(zhì)的新化合物，如鏈霉菌屬Streptomyces sp.、海孢菌屬M(fèi)arinispora sp.、皮球菌屬Dermacoccus sp.等［20］。近年來，隨著海洋放線菌資源的不斷開發(fā)，可為研究新藥提供多種先導(dǎo)化合物，所以，開發(fā)研究海洋放線菌資源及其天然產(chǎn)物已逐漸成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)［21］。恥垢分枝桿菌具有安全性高、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，對(duì)抗菌藥物的敏感性很強(qiáng)［22］，關(guān)艷等研究表明該菌還可作為模式菌替代MTB篩選具有抗結(jié)核活性的菌株及化合物。

本研究從77株海洋放線菌中篩選到9株具有抗恥垢分枝桿菌活性的菌株，比例高達(dá)11.69%，表明海洋放線菌可作為結(jié)核病新藥研究與開發(fā)的重要資源。其中，菌株HY286對(duì)恥垢分枝桿菌抑菌效果最佳，初步鑒定其為馬杜拉屬放線菌。馬杜拉屬為L(zhǎng)echevalier等［23］于1970年建立，該屬放線菌廣泛分布于熱帶和亞熱帶，主要特征為具基內(nèi)菌絲體（粉紅色至玫瑰紅）和氣生菌絲體（白色、灰色、淺藍(lán)色或淺粉紅色），有分枝，不斷裂，僅在氣生菌絲上形成短孢子鏈［24］。前人研究表明，馬杜拉屬放線菌可產(chǎn)生多種抗性化合物［25］，結(jié)構(gòu)種類多樣，如芳香聚酮類［26］、蒽環(huán)類［27］、雙萜類［28］、雜環(huán)類化合物［29］等。其中，具細(xì)菌抗性的化合物有madurastatin A1［30］、madurastatin C1［27］、JBIR-65［28］、CP-82［31］等；具真菌抗性的化合物有madurastatin AC104［32］、madurastatin ACD1［26］等；具抗腫瘤活性的化合物chandrananimycins A-C［33］、BCC27169［34］等。目前，部分化合物已應(yīng)用于生產(chǎn)如莫能菌素［31］、利福霉素［34］等藥物，應(yīng)用研究前景廣闊。本研究中菌株HY286的發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗菌及抗腫瘤作用，表明其具有可觀的研究前景和藥用潛力。目前，本課題組仍在對(duì)該菌株代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，并對(duì)其化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和活性測(cè)試，以期為新型結(jié)核病藥物的研發(fā)提供菌株材料和奠基研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究以恥垢分枝桿菌為模式菌株，篩選獲得9株具有抗恥垢分枝桿菌抗性的放線菌。其中編號(hào)為HY286的菌株對(duì)恥垢分枝桿菌的抑制作用最為突出。經(jīng)菌落形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA測(cè)定分析，初步鑒定其為馬杜拉屬放線菌。通過對(duì)HY286發(fā)酵產(chǎn)物的測(cè)定，該菌MIC為100 μg/ml，對(duì)枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌也有較好的抑制作用，且對(duì)HeLa和HepG2的抑制率分別為89.3%和94.2%。

圖2 恥垢分枝桿菌抗性菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 菌株HY286代謝產(chǎn)物的抗菌活性及細(xì)胞毒活性

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Screening of Anti-Tuberculosis Marine Actinomycetes and the Bioactivity of Strain HY286

QU Jia ZHAO Ling-xia CHEN Rui LU Peng-peng SUN Xiao-yu SHEN Wei-rong
（Microbial Resource Center，Microbiology Institute of Shaanxi，Xi’an 710043）

Marine actinomycetes are recognized as an important resource of screening new anti-tuberculosis drugs and their precursor compounds. Nine marine actinomycetes strains with efficient antagonism to Mycobacterium smegmatis（Msm）were screened by plate confrontation method from 77 actinomycetes in shallow soil，Zhangzhou. One strain HY286 with the highest inhibitory effect was identified as Actinomadura genus by colony morphological，physiological and biochemical characteristics，and 16S rDNA sequence analysis. The MIC of fermentation crude extract of strain HY286 was 200 μg/mL，indicating that it had a significant inhibitory effect on Msm. The fermentation crude extract of strain HY286 also showed inhibitory effects on Bacillus subtilis and Bacillus pumilus，and the inhibition rate to HeLa and HepG2 was 89.3% and 94.2%，respectively.

anti-tuberculosis；Actinomadura；marine actinomycetes；screening；bioactivity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0388

2017-05-11

陜西省科技廳項(xiàng)目（2016FWPT-10），陜西省科學(xué)院科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014k-35-2）

瞿佳，女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：微生物資源；E-mail：q_jia@163.com

沈衛(wèi)榮，男，研究員，研究方向：微生物菌種選育、發(fā)酵工程等應(yīng)用微生物研究及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)；E-mail：shenweirong@21cn.com

（責(zé)任編輯 狄艷紅）