NDM-1基因在不動(dòng)桿菌屬菌株中的分布調(diào)查*

牛冬梅 周萬青 張之烽

NDM-1基因在不動(dòng)桿菌屬菌株中的分布調(diào)查*

牛冬梅 周萬青 張之烽

目的 調(diào)查NDM-1基因在不動(dòng)桿菌屬菌株中的分布情況。方法 收集亞胺培南耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌25株、非鮑曼不動(dòng)桿菌5株（分別為洛菲不動(dòng)桿菌3株和瓊氏不動(dòng)桿菌2株）。采用改良Hodge試驗(yàn)及雙紙片協(xié)同試驗(yàn)進(jìn)行碳青霉烯酶表型篩選；PCR和DNA測序方法檢測碳青霉烯酶基因；接合試驗(yàn)探討耐藥基因的可傳遞性；PFGE調(diào)查菌株的同源性。結(jié)果25株鮑曼不動(dòng)桿菌改良Hodge試驗(yàn)陽性10株，金屬酶表型試驗(yàn)均陰性，均檢出OXA-23-like基因，未檢出NDM-1基因；5株非鮑曼不動(dòng)桿菌金屬酶表型試驗(yàn)均陽性，均攜帶NDM-1基因，改良Hodge試驗(yàn)均陰性；PFGE顯示鮑曼不動(dòng)桿菌同源性較高，主要為A克隆株，而NDM-1陽性菌株不具同源性。NDM-1陽性菌株接合試驗(yàn)未獲成功。結(jié)論 本院碳青霉烯類耐藥不動(dòng)桿菌屬菌株中NDM-1基因分布在非鮑曼不動(dòng)桿菌中，且為散發(fā)。

NDM-1 不動(dòng)桿菌屬 同源性

NDM-1（new delhi metallo-β-lactamase-1）是一種新型金屬酶基因，可造成菌株對除氨曲南之外其他所有β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。NDM-1基因一般存在于攜帶多種耐藥基因的質(zhì)粒上，從而造成菌株表現(xiàn)出多重耐藥性。該基因主要在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)，另外在一些假單胞菌和不動(dòng)桿菌屬菌株中也有報(bào)道[1-3]。不動(dòng)桿菌屬作為機(jī)會(huì)致病性病原菌，是院內(nèi)感染的重要病原菌，可造成肺炎、尿路感染、傷口感染、血流感染及心內(nèi)膜炎等。目前碳青霉烯酶耐藥的不動(dòng)桿菌屬菌株已呈世界范圍播散[3]?，F(xiàn)調(diào)查NDM-1基因在本院碳青霉烯耐藥不動(dòng)桿菌屬菌株中的流行情況，并對相關(guān)耐藥基因進(jìn)行檢測。

材料與方法

1 材料 收集2012年9月～2013年12月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院臨床分離耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌25株、洛菲不動(dòng)桿菌3株和瓊氏不動(dòng)桿菌2株。其中痰液18份、腹水4份、膽汁3份、導(dǎo)管頭和尿液各2份、血液1份，無重復(fù)分離株。所有菌株均經(jīng)API 32GN鑒定條（法國梅里埃公司）鑒定。以ATCC Escherichia coli 25922、ATCC Pseudomonas aeruginosa 27853、ATCC Klebsiella pneumoniae 1705、ATCC Klebsiella pneumoniae 1706為質(zhì)控菌株；E. coli 600（利福平耐藥）為接合試驗(yàn)的受體菌。

2 主要儀器及試劑 Taq DNA聚合酶、10×buffer（含Mg2+）、dNTPs（TaKaRa公司）；DNA Marker（北京全式金公司）；PFGE電泳瓊脂糖（Bio-Rad公司），ApaⅠ內(nèi)切酶（Fermentas公司），十二烷基肌氨酸鈉、EDTA、Tris（上海生工公司）；蛋白酶K（Merck公司）；PCR擴(kuò)增儀（PE公司）；CHEF Mapper XA 電泳儀及凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；PCR引物由英俊公司合成。

3 藥敏試驗(yàn) 藥敏紙片購自英國Oxoid公司，多粘菌素B及替加環(huán)素MTS（MIC Test Strip，意大利Liofilchem公司）為輝瑞公司惠贈(zèng)，亞胺培南E-Test為梅里埃公司產(chǎn)品。按照CLSI 2014版文件[4]，采用紙片擴(kuò)散法檢測受試菌對阿米卡星、頭孢他啶、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、替卡西林/克拉維酸、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、米諾環(huán)素的耐藥性；采用瓊脂稀釋法測定菌株對多粘菌素B的MIC；采用MTS測定菌株對替加環(huán)素的MIC；采用E-Test測定菌株對亞胺培南的MIC。判斷標(biāo)準(zhǔn)參見CLSI 2014版。

4 碳青霉烯酶表型檢測 EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn)0.5麥?zhǔn)蠁挝淮郎y菌均勻涂布MH平板，分別貼兩張亞胺培南紙片，兩紙片相距25 mm。在其中1張紙片上滴加500 mmol/L（pH 8.0）EDTA溶液5μl。35℃培養(yǎng)過夜，亞胺培南+EDTA紙片與單純亞胺培南紙片的抑菌圈直徑之差≥7 mm為金屬酶陽性；改良Hodge試驗(yàn)（MHT）：按照CLSI 2009年版進(jìn)行，以ATCC 1705作為陽性對照，ATCC 1706作為陰性對照。

5 細(xì)菌DNA的提取 挑取純培養(yǎng)菌落置0.5 ml離心管內(nèi)（內(nèi)預(yù)置200 ng/ml蛋白酶K溶液200 μl），56℃水浴2 h，改95℃水浴10 min，13 000 g離心30 s。上清液即為基因檢測的模板液，置-20℃冰箱備用。

6 P C R擴(kuò)增和測序 采用P C R法擴(kuò)增金屬酶基因（M B L s），包括I M P、V I M、G I M、 S P M、S I M、N D M-1酶基因；O X A型碳青霉烯酶，包括O X A-2 3-l i k e、O X A-2 4-l i k e、OXA-51-like和OXA-58-like；KPC-2酶基因。參照文獻(xiàn)[5-7]合成引物。其中N D M-1引物為兩對，分別為NDM-1（1）：17U-191 5’-CAGCACACTTCCTATCTC-3’ 和17L-465 5’-CCGCCCTCCCCTCTT-3’；NDM-1（2）F-58 5’-GGCGGAATGGCTCATCACGA-3’和R-344 5’-CGCAACACAGCCTGACTTTC-3’，產(chǎn)物分別為292 bp和287 bp。反應(yīng)體系為50μl，其中10×buffer（含Mg2+）5 μl，dNTPs（各2.5 mmol/L）4 μl，DNA模板2μl，上下游引物（10 μml/L）各2μl，Taq DNA酶0.3 μl，ddH2O 34.7 μl，退火溫度為55 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送上海美吉公司進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果在GenBank上查詢，并與BLAST比對。

7 接合試驗(yàn) 對數(shù)生長期的供體菌及受體菌（E. coli 600 R）各0.2 ml加入0.6 ml新鮮LB肉湯中，37℃過夜培養(yǎng)后，接種含亞胺培南（4 mg/L）+利福平（256 mg/L）的MH平板篩選接合子。供體菌和受體菌作為質(zhì)控菌。

8 脈沖場凝膠電泳（PFGE）分型 將培養(yǎng)過夜的細(xì)菌用低熔點(diǎn)膠灌模，蛋白酶K消化2 h，限制性內(nèi)切酶ApaⅠ（30 U）30 ℃酶切2 h。使用CHEF-Mapper XA型脈沖電泳儀，電壓6 V/cm，夾角120?，脈沖參數(shù)5～35 s，電泳19 h、溫度14℃，分子量標(biāo)記物為酵母染色體DNA。EB染色30 min，拍照。結(jié)果判定參照Tenover標(biāo)準(zhǔn)[8]。

結(jié) 果

1 藥敏結(jié)果 30株不動(dòng)桿菌屬菌株對12種抗菌藥物呈現(xiàn)出多重耐藥。K-B紙片法結(jié)果顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對米諾環(huán)素、阿米卡星的敏感率分別為36%和32%，對其余10種抗菌藥物耐藥率為100%；5株非鮑曼不動(dòng)桿菌對米諾環(huán)素、阿米卡星、復(fù)方新諾明敏感，對其余藥物均耐藥；所有檢測菌株對多粘菌素敏感（MIC值均≤2μg/ ml），對亞胺培南全部耐藥（MIC值均≥256μg/ ml）；5株非鮑曼不動(dòng)桿菌對替加環(huán)素全部敏感（MIC值均≤2 g/ml）；25株鮑曼不動(dòng)桿菌對替加環(huán)素敏感20株（80%），中介5株（20%）。

2 碳青霉烯酶表型篩選結(jié)果 25株鮑曼不動(dòng)桿菌的MHT試驗(yàn)陽性10株，而EDTA協(xié)同試驗(yàn)均陰性；5株非鮑曼不動(dòng)桿菌MHT試驗(yàn)均陰性，而EDTA協(xié)同試驗(yàn)均陽性，提示菌株攜帶金屬酶。

3 耐藥基因檢測 25株鮑曼不動(dòng)桿菌OXA-23-like和OXA-51-like基因全部陽性，未擴(kuò)增出金屬酶基因及OXA-24-like、OXA-58-like和KPC-2。5株非鮑曼不動(dòng)桿菌所測耐藥基因中僅NDM-1兩對引物擴(kuò)增結(jié)果為陽性，其余碳青霉烯酶基因均為陰性。NDM-1陽性產(chǎn)物在GenBank上比對結(jié)果顯示與肺炎克雷伯桿菌（登錄號(hào)JN677524.1）、陰溝腸桿菌（登錄號(hào)JF798502.1）和鮑曼不動(dòng)桿菌（登錄號(hào)JF798501.1）的NDM-1基因同源性為100%。NDM-1 PCR結(jié)果電泳圖譜及部分測序結(jié)果分別見圖1、2。

4 PFGE圖譜 25株鮑曼不動(dòng)桿菌分為A（21株）、B（4株）兩個(gè)克隆株，其中A克隆可分為A1、A2、A3和A4各8株、8株、4株和1株；而3株洛菲不動(dòng)桿菌和2株瓊氏不動(dòng)桿菌PFGE圖譜不具同源性，見圖3。

5 接合試驗(yàn)結(jié)果 對NDM-1陽性菌株多次接合試驗(yàn)均未獲成功。

圖1 NDM-1 PCR結(jié)果電泳圖譜

圖2 NDM-1基因部分測序結(jié)果

討 論

圖3 非鮑曼不動(dòng)桿菌PFGE電泳圖譜

目前，鮑曼不動(dòng)桿菌仍是院內(nèi)感染的主要病原菌。其他少見細(xì)菌如瓊氏不動(dòng)桿菌、洛菲不動(dòng)桿菌同樣可造成免疫低下患者的院內(nèi)感染，常見類型為導(dǎo)管相關(guān)性血流感染[9]。多重耐藥不動(dòng)桿菌除鮑曼不動(dòng)桿菌外，多重耐藥的洛菲不動(dòng)桿菌及瓊氏不動(dòng)桿菌所引起的院內(nèi)感染也屢有報(bào)道[10，11]。不動(dòng)桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥機(jī)制較復(fù)雜，包括產(chǎn)碳青霉烯酶、外膜蛋白的缺失、外排泵的激活、青霉素結(jié)合蛋白的改變，其中產(chǎn)碳青霉烯酶最重要[12]。常見的碳青霉烯酶主要為兩類：一類為金屬酶（MBLs），如IMP、VIM、SPM、SIM、 GIM、NDM；另一類為D類的OXA型酶，主要為OXA-23、24、51和58。NDM-1作為一種新型金屬酶，對除氨曲南之外的所有β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，包括碳青霉烯類。該酶最初在1例印度裔瑞典尿路感染患者中發(fā)現(xiàn)，而后在全球范圍均有報(bào)道。該類菌株除對所有β-內(nèi)酰胺類耐藥外，對喹諾酮類、氨基糖苷類也可耐藥，僅對替加環(huán)素和黏菌素保持一定敏感性[2]。

本調(diào)查顯示，臨床分離亞胺培南耐藥不動(dòng)桿菌屬菌株對多種藥物呈現(xiàn)出耐藥性。通過表型篩選試驗(yàn)提示5株非鮑曼不動(dòng)桿菌菌株表達(dá)B型碳青霉烯酶，PCR及測序結(jié)果證實(shí)為NDM-1型金屬酶，而25株鮑曼不動(dòng)桿菌主要攜帶OXA-23-like基因。NDM-1陽性菌株同時(shí)對喹諾酮類耐藥，而對氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類、多粘菌素B和替加環(huán)素敏感。產(chǎn)NDM-1菌株主要通過質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)菌種之間的水平傳播，部分菌株可克隆傳播[1]。本文對NDM-1陽性菌株進(jìn)行多次的接合試驗(yàn)，但均未獲成功。整合子在菌株耐藥性及耐藥基因的傳遞上具有重要意義[7]。但是對于NDM-1陽性菌株的整合子相關(guān)基因研究表明，NDM-1并未存在于整合子上（結(jié)果未列出）。由此我們推測該基因不存在于可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上，可能存在于該菌株的染色體上。對于NDM-1基因在非鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的定位及基因環(huán)境尚待進(jìn)一步研究。

菌株同源性分析結(jié)果顯示，本院分離亞胺培南耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌存在以A克隆株為主的克隆播散，而NDM-1陽性非鮑曼不動(dòng)桿菌菌株為散發(fā)。院內(nèi)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染情況較嚴(yán)重，需加強(qiáng)院感防護(hù)，降低或杜絕院內(nèi)感染的發(fā)生。雖然非鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯類耐藥分離率不高，但其攜帶NDM-1基因，仍需加強(qiáng)院感監(jiān)控，以防院內(nèi)暴發(fā)流行。

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Distribution of NDM-1 Gene in Strains of Acinetobacter sp NIU Dong-mei，

ZHOU Wan-qing，ZHANG Zhi-feng
Department of Medical Laboratory，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，PLA，Nanjing 210008

Objective To investigate the distribution of NDM-1 in Acinetobacter spp. Methods Twenty-five isolates of Acinetobacter baumannii and 3 isolates of A. lwoffii and 2 isolates of A.junnii that were resistant to imipenem were selected for the study. Carbapenemases were screened by modified Hodge test and EDTA disk synergy test. The genotypes of carbapenamases were determined by PCR and DNA sequencing. Plasmid conjugation was performed to study the transfer of carbapenem resistance. Strain homology was analyzed by PFGE. Results Ten out of 25 A. baumannii strains were positive for MHT but all were negative for EDTA disk synergy test，and all the 25 strains were positive with OXA-23-like but negative for NDM-1. All the non-A.baumannii isolates were positive for EDTA disk synergy test but negative for MHT. The strains were just positive for NDM-1 detected by PCRs and negative for the other carbapenamases. The NDM-1 positive strains had different PFGE profiles. PFGE showed high homology for A.baumannii with mainly A clone. Conclusions NDM-1 was distributed in the bacterias rather than A. baumannii，which were resistant to imipenem and the positive isolates had different PFGE profiles.

NDM-1 Acinetobacter Homology

R446.5

A

1671-2587（2017）04-0364-04

2017-01-17）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.016

*本課題受中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（No.021414380025）資助

210002 江蘇省南京軍區(qū)南京總醫(yī)院檢驗(yàn)科（牛冬梅）；南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科（周萬青，張之烽）

牛冬梅（1982–），女，江蘇興化人，主管技師，碩士，主要從事微生物研究，（E-mail）ndm082@163. com。

周萬青，（E-mail）zwq_096@163.com。