丙型肝炎病毒抗體復(fù)查策略的研究

張菁 邵春燕 卓海龍 王海平 駱群

·論著·

丙型肝炎病毒抗體復(fù)查策略的研究

張菁 邵春燕 卓海龍 王海平 駱群

目的 探討化學(xué)發(fā)光法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）聯(lián)合酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體（抗-HCV）的復(fù)查策略。方法 采用CLIA法篩選出抗-HCV S/CO﹥0.40的血清樣本，再采用2種ELISA法試劑進(jìn)行復(fù)查，對(duì)至少1種試劑檢測(cè)結(jié)果在臨界值（CLIA法S/CO﹥0.90，ELISA法S/ CO﹥0.80）以上的樣本，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（realtime fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）方法進(jìn)行HCV核酸定量（HCV RNA）。結(jié)果 從本院臨床患者中篩選出CLIA法抗-HCV S/CO﹥0.40的樣本進(jìn)行ELISA法檢測(cè)，至少1種試劑檢測(cè)結(jié)果在臨界值以上的血清樣本201例，其中強(qiáng)生CLIA、索林ELISA和科華ELISA法陽(yáng)性率分別為2.5%（150/5 800）、1.6%（96/5 800）和1.5%（89/5 800）。CLIA及2種ELISA法試劑檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性的樣本75例，陽(yáng)性率為1.3%（75/5 800）；FQ-PCR法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性51例，陽(yáng)性率為0.9%（51/5 800）。CLIA法檢測(cè)抗-HCV S/CO﹥0.40且＜0.90的樣本有40份，CLIA法檢測(cè)抗-HCV S/CO﹥0.90且＜0.99的樣本有8份；CLIA法檢測(cè)抗-HCV S/CO≥1.0的樣本有153例，其中S/CO 1.00～5.00的樣本有66例，S/CO 5.01～10.00的樣本16例，S/CO 10.01～20.00的樣本5例，S/CO﹥20.00的樣本66例。結(jié)論 對(duì)CLIA法檢測(cè)抗-HCV S/CO﹥0.40且＜0.90的樣本未發(fā)現(xiàn)漏檢，建議直接發(fā)放陰性結(jié)果，減少試劑浪費(fèi)；對(duì)CLIA和ELISA法檢測(cè)抗-HCV陽(yáng)性樣本進(jìn)行HCV RNA檢測(cè)，并結(jié)合臨床表現(xiàn)進(jìn)行診斷及療效評(píng)價(jià)。

化學(xué)發(fā)光法 酶聯(lián)免疫法 丙型肝炎病毒抗體

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的，主要經(jīng)輸注污染的血液及血液制品傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球HCV感染率約為3%，約1.8億人感染了HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬(wàn)例，呈全球性流行；可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞肝癌（HCC）[1]。HCV感染的標(biāo)志物主要有抗-HCV和HCV RNA。抗-HCV是檢測(cè)患者血清中針對(duì)HCV基因組編碼抗原產(chǎn)生的抗體，間接反映HCV感染和既往感染。CLIA法檢測(cè)精密度高、重復(fù)性好、高通量、可隨機(jī)進(jìn)樣、操作簡(jiǎn)便[2]，目前，本實(shí)驗(yàn)室臨床患者抗-HCV檢測(cè)使用CLIA法，CLIA S/CO＞0.4時(shí)用2種ELISA法試劑復(fù)查。當(dāng)CLIA和ELISA法至少1種試劑檢測(cè)抗-HCV S/CO在臨界值以上，進(jìn)行HCV RNA檢測(cè)。CLIA和ELISA法檢測(cè)抗-HCV時(shí)，2種方法存在不一致性，因此在實(shí)際工作中建立可靠的復(fù)查方法，對(duì)HCV感染的診斷和療效評(píng)價(jià)具有重要意義。本文對(duì)201例標(biāo)本采用不同方法檢測(cè)抗-HCV和HCV RNA，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 材料 2013年1月～2014年10月，本院臨床送檢的201份患者血液樣本（CLIA法檢測(cè)抗-HCV S/ CO＞0.90或1種ELISA法試劑檢測(cè)抗-HCV S/CO＞0.80）。

2 試劑

2.1 抗-HCV檢測(cè)：美國(guó)強(qiáng)生HCV抗體CLIA試劑盒（批號(hào)3490，3480，3460）：檢測(cè)結(jié)果≥1.00，判為抗-HCV陽(yáng)性；檢測(cè)結(jié)果＜0.90，判為抗-HCV陰性；檢測(cè)結(jié)果≥0.90且＜1.00，屬于邊界線樣本。

意大利索林公司HCV抗體ELISA法診斷試劑盒（批號(hào)V915120，V918410，V916610）：臨界值（Cut-off）計(jì)算是將一個(gè)陰性對(duì)照值或陰性對(duì)照的平均值加0.6（陰性對(duì)照平均吸光度值＜0.25）；檢測(cè)樣本的吸光值小于臨界值，說(shuō)明檢測(cè)樣本抗-HCV陰性；檢測(cè)樣本的吸光值大于臨界值，說(shuō)明檢測(cè)樣本抗-HCV陽(yáng)性。

上?？迫A生物工程股份有限公司H C V抗體E L I S A法診斷試劑盒（批號(hào)2 0 1 4 0 3 0 1 1，201307021，201209031）：S/CO≥1.00，說(shuō)明檢測(cè)樣本抗-HCV陽(yáng)性，S/CO＜1.00，說(shuō)明檢測(cè)樣本抗-HCV陰性。

2.2 HCV RNA檢測(cè)：上?？迫AHCV RNA定量檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)結(jié)果﹥1.0×103拷貝/ml為陽(yáng)性。3 儀器

3.1 抗-HCV檢測(cè)：深圳愛(ài)康公司Uranus AE 280全自動(dòng)酶免儀；美國(guó)強(qiáng)生公司VITROS 5600全自動(dòng)生化免疫分析儀、VITROS 3600全自動(dòng)免疫分析儀。

3.2 HCV RNA檢測(cè)：上海宏石SLAN。

4 方法 見(jiàn)圖1。

圖1 檢測(cè)方法流程圖

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.5軟件分析，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 對(duì)201例（CLIA法檢測(cè)抗-HCV S/CO ＞0.90或1種ELISA法試劑檢測(cè)抗-HCV S/CO ＞0.80）患者血清樣本檢測(cè)抗-HCV及HCV RNA，結(jié)果見(jiàn)表1。

2 強(qiáng)生CLIA法檢測(cè)結(jié)果S/CO＞0.40且＜1.0的樣本有48例，2種ELISA法試劑復(fù)查結(jié)果見(jiàn)表2。CLIA法 S/CO范圍在0.40～0.89時(shí)，索林和科華ELISA法試劑檢測(cè)陽(yáng)性率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CLIA法S/CO≥0.90且＜1.00時(shí)，索林和科華ELISA法試劑檢測(cè)陽(yáng)性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 強(qiáng)生CLIA法檢測(cè)結(jié)果S/CO≥1.0的樣本有153例，2種ELISA法試劑復(fù)查結(jié)果見(jiàn)表3，強(qiáng)生CLIA法S/CO范圍在1.00～20.00時(shí)，CLIA和ELISA法檢測(cè)陽(yáng)性率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。S/CO 的范圍＞20.00時(shí)，CLIA和ELISA法檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%。見(jiàn)表3。

表1 201例患者血清樣本抗-HCV及HCV RNA檢測(cè)結(jié)果

表2 ELISA復(fù)查CLIA檢測(cè)抗-HCV S/CO＞0.40且＜1.0的結(jié)果

4 對(duì)201例患者血清樣本進(jìn)行3種方法檢測(cè)，HCV RNA含量＜1.0×103拷貝/ml時(shí)，3種方法的結(jié)果存在不符合性；HCV RNA含量＞1.0×103拷貝/ml時(shí)，3種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率為100%。見(jiàn)表4。

表3 ELISA復(fù)查CLIA法檢測(cè)抗-HCV S/CO≥1.00的結(jié)果

表4 3種方法檢測(cè)201例樣本的結(jié)果比較

HCV是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌發(fā)生的主要因素。中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病疫情報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，近年來(lái)我國(guó)丙肝發(fā)病人數(shù)逐年上升，最近5年內(nèi)報(bào)告人數(shù)增加了5倍。因此，丙型肝炎的早期診斷顯得十分重要。丙型肝炎的診斷，除癥狀、體征及肝功能檢查外，主要依靠血清病毒學(xué)檢測(cè)[3]?？?HCV是目前診斷丙型肝炎的主要指標(biāo)，反映HCV感染的存在，主要采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）和化學(xué)發(fā)光法（CLIA）。ELISA法是利用基因工程從HCV RNA獲得結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)HCV抗原包被于固相載體上，用間接法測(cè)定HCV抗體，本實(shí)驗(yàn)室用于檢測(cè)抗-HCV的ELISA法試劑為第3代，其特異性、靈敏度都較好，且成本低、操作方便，適用于大批量樣本檢測(cè)；但亦存在操作步驟多、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、窗口期較長(zhǎng)的缺點(diǎn)。CLIA法的檢測(cè)原理與ELISA相似，是基于抗-HCV 3.0 ELISA法設(shè)計(jì)，區(qū)別在于CLIA法是在反應(yīng)杯中加入一種含發(fā)光底物及一種含電子轉(zhuǎn)移物的試劑，酶結(jié)合物中的HRP催化魯米諾衍生物發(fā)生氧化反應(yīng)，并產(chǎn)生光，電子轉(zhuǎn)移物增強(qiáng)了光的強(qiáng)度，最后由檢測(cè)系統(tǒng)讀取光信號(hào)，HRP結(jié)合物的量與樣本中HCV抗體的濃度成正比。CLIA法方便、快捷、重復(fù)性好、時(shí)間短（有利于縮短報(bào)告的發(fā)布時(shí)間），靈敏度高，適用于臨床抗原、抗體的檢測(cè)，但成本較高。通過(guò)本組資料可以發(fā)現(xiàn)：檢測(cè)201例患者血清樣本抗-HCV，強(qiáng)生-CLIA法檢測(cè)陽(yáng)性150例，MUREX-ELISA法檢測(cè)陽(yáng)性96例，科華-ELISA法檢測(cè)陽(yáng)性89例。CLIA和ELISA法檢測(cè)抗-HCV存在較大差異，原因可能與試劑包被的抗原及方法學(xué)不同有關(guān)，強(qiáng)生CLIA法試劑包被的HCV編碼抗原是c22-3、c200（c200由HCV基因組NS3和NS4編碼）和NS-5；索林-ELISA法試劑包被的抗原為核心抗原（結(jié)構(gòu)區(qū)）、NS-3、NS-4、NS-5；科華-ELISA法試劑包被的是合成多肽抗原、核心抗原、非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原。索林和科華試劑所包被抗原及方法學(xué)相近，所以兩者結(jié)果差異較小。CLIA S/ CO＞20.00時(shí)，ELISA S/CO＞0.80的樣本數(shù)都為66例，檢測(cè)結(jié)果為強(qiáng)陽(yáng)性時(shí)，CLIA和ELISA法檢測(cè)抗-HCV的符合率為100%。在抗-HCV檢測(cè)中，CLIA法檢測(cè)陽(yáng)性率較高，為防止漏檢并排除假陽(yáng)性，對(duì)CLIA S/CO＞0.40樣本進(jìn)行ELISA法復(fù)檢后發(fā)現(xiàn)，雖然未有漏檢，但兩種方法都存在假陽(yáng)性率，給實(shí)際工作帶來(lái)不便；因此本實(shí)驗(yàn)室在遇到CLIA和ELISA法檢測(cè)結(jié)果不符合（CLIA法檢測(cè)抗-HCV S/CO＞0.90或ELISA法檢測(cè)抗-HCV＞0.80）時(shí)，建議進(jìn)行HCV RNA檢測(cè)。對(duì)于CLIA法檢測(cè)抗-HCV S/CO＞0.40且S/CO＜0.90的樣本，建議直接發(fā)放陰性結(jié)果，減少?gòu)?fù)查時(shí)試劑的浪費(fèi)，控制成本。

HCV RNA是判定HCV感染的直接證據(jù)，具有確診和抗病毒療效評(píng)估的價(jià)值[2]，但HCV RNA定量檢測(cè)技術(shù)成本高，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作人員技術(shù)水平要求高，不利于大批量樣本檢測(cè)[4]。目前，廣泛應(yīng)用于臨床診斷和血液篩查的HCV抗體檢測(cè)試劑都已發(fā)展到第3代，HCV RNA檢測(cè)技術(shù)也較成熟，但由于方法學(xué)的局限性，抗-HCV和HCV RNA會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不一致的情況。本次實(shí)驗(yàn)表明，抗-HCV陽(yáng)性率明顯大于HCV RNA，可能原因有：ELISA和CLIA法本身存在局限性，CLIA和ELISA法試劑都為第3代丙型肝炎抗體篩查試劑，易受體內(nèi)非特異性IgG干擾而導(dǎo)致假陽(yáng)性[5]；患者處于急性丙型肝炎的恢復(fù)期，HCV停止復(fù)制，HCV RNA滴度低，導(dǎo)致結(jié)果為陰性，抗-HCV仍可存在一定時(shí)間[5]。

本研究的201例樣本中有51例經(jīng)3種方法檢測(cè)結(jié)果都為陽(yáng)性；24例樣本CLIA和ELISA法陽(yáng)性而PCR法檢測(cè)結(jié)果為陰性。推測(cè)可能與HCV感染后抗-HCV與HCV RNA的變化規(guī)律有關(guān)[5]：病毒感染1～3周后，HCV RNA可在外周血檢測(cè)出來(lái)，在慢性感染中，HCV RNA常在高峰期后下降到較低水平，低于最低檢測(cè)限。大多數(shù)丙肝患者抗-HCV持續(xù)很久甚至是終身存在，有效抗病毒治療后抗-HCV也不一定轉(zhuǎn)陰。目前，CLIA和ELISA法檢測(cè)抗-HCV的結(jié)果存在不符合性，聯(lián)合ELISA法檢測(cè)抗-HCV可篩出部分假陽(yáng)性樣本，降低假陽(yáng)性率；建議臨床對(duì)CLIA和ELISA法檢測(cè)抗-HCV陽(yáng)性樣本進(jìn)行HCV RNA檢測(cè)，并結(jié)合臨床表現(xiàn)進(jìn)行診斷及療效評(píng)價(jià)。

1 丁華，何維娜，陳望，等.3種檢測(cè)方法在丙型肝炎診斷中的臨床評(píng)價(jià)[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（24）：3387-3388．

2 張金良，白燕，鄧慶梅.丙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)的意義[J].實(shí)用肝臟病雜志，2006，7（4）：218-219．

3 白廣紅，張玲玲，孫文利，等.第四代抗-HCV試劑盒對(duì)無(wú)償獻(xiàn)血者篩檢價(jià)值評(píng)價(jià)[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2012，27（6）：116-117．

4 周永香.丙型肝炎病毒抗體與丙型肝炎病毒核糖核酸的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，2003，16（8）：890-891.

5 鄧麟宇，劉鳳君，楊家紅，等.丙型肝炎患者血清丙型肝炎病毒核糖核酸與丙型肝炎抗體及肝功能的檢測(cè)[J].臨床薈萃，2008，23（22）：1600-1603.

Study on the Rechecked Strategy of Antibody to Hepatitis C Virus

ZHANG Jing，SHAO Chun-yan，ZHUO Hailong，
et al. The 307th Hospital of Chinese People's Liberation Army 100071

Objective To Investigate the rechecked strategy of chemiluminescence immunoassay（CLIA）combined with enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）in order to detect Hepatitis C virus antibodies. Methods Two hundred and one sera samples of CLIA anti-HCV S/CO﹥0.40 were collected from the patients by ELISA. and the samples over the cutoff value with at least one reagent detection were checked for HCV RNA by realtime fluorescence quantitative PCR（FQ-PCR） . Results Among the positive 201 samples，CLIA provided by Johnson，ELISA by MUREX，and ELISA by Kehua companies revealed positivities of 2.5%，1.6%，and 1.5%，respectively. There were 75（1.3%，75/5 800）samples that had both CLIA and two ELISA reagents positive detections. FQ-PCR positive detections were noted in 51（0.9%，51/5 800）samples. Forty samples exhibited anti-HCV S/CO﹥0.40 and ＜0.90 in CLIA detection. Eight samples showed anti-HCV S/CO﹥0.90 and ＜0.99 in CLIA detection. There were 153 samples that revealed the anti-HCV S/CO≥1.0 in CLIA detection，among them，66 samples indicated S/CO 1.00-5.00，16 samples，S/CO 5.01-10.00；5 samples，S/CO 10.01-20.00； and 66 samples，S/CO﹥20.00. Conclusion CLIA is reliable for detection of anti- HCV with S/CO﹥0.40 and ＜0.90. HCV RNA detection is useful for laboratory diagnosis and treatment evaluation in the samples that have showed positive anti-HCV by using CLIA and ELISA.

Chemiluminescence immunoassay Enzyme linked immunosorbent assay Hepatitis C virus antibody

R446.11 R512.6+3

A

1671-2587（2017）04-0358-04

2016-12-16）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.014

100071 中國(guó)人民解放軍第三〇七醫(yī)院輸血科

張菁（1987–），女，蒙古族，內(nèi)蒙古呼和浩特人，技師，本科，主要從事血液檢驗(yàn)工作，（Tel）15901132614（E-mail）465933707@qq.com。

駱群（1967–），男，碩士生導(dǎo)師，副主任醫(yī)師，主要從事臨床輸血研究，（Tel）010-66947206（E-mail）luoq66@aliyun.com。