曲古菌素A聯(lián)合全反式維甲酸誘導(dǎo)卵巢癌SK0V-3細(xì)胞株凋亡的研究

盛佳佳 劉雨生

·論著·

曲古菌素A聯(lián)合全反式維甲酸誘導(dǎo)卵巢癌SK0V-3細(xì)胞株凋亡的研究

盛佳佳 劉雨生

目的 探討TSA聯(lián)合ATRA對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的協(xié)同增殖抑制和凋亡作用。 方法 TSA聯(lián)合 ATRA處理卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞株，分別檢測SK0V-3細(xì)胞增殖抑制情況和細(xì)胞凋亡率及相關(guān)蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果 TSA聯(lián)合ATRA協(xié)同抑制SKOV-3細(xì)胞生長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合組SKOV-3細(xì)胞凋亡率明顯升高，與對(duì)照組和單獨(dú)用藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 TSA聯(lián)合ATRA在體外對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞具有較強(qiáng)的協(xié)同增殖抑制和促進(jìn)凋亡作用。

曲古菌素A 全反式維甲酸 細(xì)胞凋亡 SKOV-3細(xì)胞

卵巢癌作為婦科惡性腫瘤之一，死亡率最高，隱匿性強(qiáng)，一旦發(fā)現(xiàn)多為晚期，手術(shù)及化療效果差，5年生存率極低[1]。目前，治療晚期卵巢癌主要方法是瘤體縮減術(shù)聯(lián)合紫杉醇、鉑類等化療藥物治療，延緩了患者的中位生存期，但是在近40年的卵巢癌治療歷程中，卵巢癌復(fù)發(fā)率、死亡率并未得到明顯改善[2]。早期研究發(fā)現(xiàn)曲古菌素A（trichostatin A，TSA）可通過調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡[3]；研究證實(shí)全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞、 肝癌細(xì)胞、宮頸癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞凋亡[4]。本研究探討TSA聯(lián)合ATRA對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株的協(xié)同凋亡作用，為臨床上卵巢癌的藥物治療提供新的方法和理論依據(jù)。

材料與方法

1 材料

1.1 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；小牛血清（四季青生物工程材料有限公司），CellTiter 96? AQueous細(xì)胞增殖試劑盒（promega）；Annexin V凋亡檢測試劑盒（ebioscience）。兔抗人BCl-2多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）；鼠抗人caspase-3單克隆抗體（碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗人磷酸化STAT3、P21及β-actin單克隆抗體（Cell Signaling）；鼠抗人p53單克隆抗體（博士德生物工程有限公司）；AC-H3、BCL-2、MCL-1、BCL-XL

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：酶標(biāo)儀為美國Anthos公司；流式細(xì)胞儀為美國BD公司； Western blot儀為Bio-Rad公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 卵巢癌SKOV-3細(xì)胞在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每48小時(shí)傳代1次，細(xì)胞呈貼壁生長。

3 CellTiter 96? AQueous細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分為A組（對(duì)照）、B組（ATRA 1 μg/ ml）、C組（TSA 200 nmol/L）組、D組（TSA 200 nmol/L +ATRA 1 μg/ml）共4組。對(duì)照組加入等量溶媒DMSO。取對(duì)數(shù)生長期的卵巢癌SKOV-3細(xì)胞接種于96孔板，分別添加藥物干預(yù)24、48、72和96 h后，每孔加入CellTiter 96?AQueous溶液20 μl，37℃、5% CO2避光孵育3 h后，上酶標(biāo)儀在490 nm波長處測吸光度（D）值，根據(jù)D值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率=（對(duì)照組D值–實(shí)驗(yàn)組D值）/對(duì)照組D值×100%。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將SKOV-3細(xì)胞接種于90 mm培養(yǎng)皿，各組分別加入藥物培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，加入500 μl Binding Buffer制備單細(xì)胞懸液，分別加入Annexin V-FITC和PI 試劑，避光孵育后送流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡，檢測細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均凋亡率。

5 Western 印跡法檢測相關(guān)抗體的表達(dá) 將SKOV-3細(xì)胞接種于90 mm培養(yǎng)皿，各組分別加入藥物培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，提取蛋白，測定蛋白濃度，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，經(jīng)脫脂牛奶封閉1 h，一抗4℃孵育過夜；二抗室溫孵育2 h，采用化學(xué)發(fā)光法顯影15～60 min，Actin作為等量上樣的標(biāo)準(zhǔn)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TSA與ATRA聯(lián)合可抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖CellTiter 96? AQueous細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測A、B、C、D共4組的SKOV-3細(xì)胞生長情況。結(jié)果證實(shí)：與對(duì)照組和ATRA（1 μg/ml）組相比，TSA（200 nmol/L）對(duì)SKOV-3細(xì)胞的抑制增殖作用明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而TSA（200 nmol/ L）聯(lián)合ATRA組優(yōu)于VPA、ATRA 單獨(dú)用藥組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見圖1。2 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果 FCM法檢測結(jié)果顯示，TSA聯(lián)合ATRA用藥組的細(xì)胞凋亡率為7.79%，與對(duì)照組0.09%、TSA組2.71%、ATRA組2.52%相比，細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。ATRA組與TSA組相比，細(xì)胞凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。ATRA組和TSA組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。3 TSA聯(lián)合ATRA作用后乙?；暗蛲鱿嚓P(guān)蛋白的表達(dá)變化 Western blot 檢測結(jié)果顯示，SKOV-3細(xì)胞經(jīng)TSA聯(lián)合ATRA處理48 h后，P53、P21、AC-H3、active-caspase-3蛋白表達(dá)較單獨(dú)用藥組升高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而與對(duì)照組比較，TSA與ATRA聯(lián)合用藥組的P-sat-3、BCL-2、MCL-1、BCL-XL蛋白表達(dá)有所下降，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖1 曲古菌素A聯(lián)合全反式維甲酸處理后SKOV-3細(xì)胞的生長曲線（n=4）

圖2 曲古菌素A聯(lián)合全反式維甲酸對(duì)SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響

圖3 TSA聯(lián)合ATRA對(duì)SKOV-3細(xì)胞中P53、P21、P-sat-3、AC-H3、BCL-2、MCL-1、BCL-XL activecaspase-3蛋白表達(dá)的影響

討 論

組蛋白的乙酰化和去乙?；钦{(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄的重要修飾，在正常情況下，組蛋白的乙?；叭ヒ阴；跈C(jī)體細(xì)胞內(nèi)存在動(dòng)態(tài)平衡，控制著染色體的結(jié)果和基因表達(dá)[5]。目前研究證實(shí)組蛋白乙?；叭ヒ阴；胶馕蓙y與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系。組蛋白去乙?；敢种苿┛烧{(diào)節(jié)基因表達(dá)，包括一些腫瘤抑制基因，從而發(fā)揮抗癌效應(yīng)[6]。TSA作為HDACIS中重要成員之一，可顯著抑制HDAC活化，對(duì)結(jié)腸癌、前列腺癌和甲狀腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞均有增殖抑制及促進(jìn)凋亡作用[7]。ATRA是新型的腫瘤誘導(dǎo)分化藥物，目前研究報(bào)道較多，兩種藥物聯(lián)合抗腫瘤，對(duì)很多腫瘤細(xì)胞系有較好的促凋亡作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)TSA聯(lián)合ATRA對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖抑制和協(xié)同凋亡作用；周虎等研究證實(shí)TSA聯(lián)合ATRA對(duì)宮頸癌細(xì)胞株具有協(xié)同誘導(dǎo)凋亡作用；在此基礎(chǔ)上，本研究選擇TSA藥物濃度為TSA 200 nmol/L和ATRA 1 μg/ml[8]。本研究亦證實(shí)TSA（200 nmol/L）聯(lián)合ATRA（1 μg/ml）組在卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中優(yōu)于TSA、ATRA單獨(dú)用藥組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。胡軼等研究證實(shí)低劑量曲古菌素A聯(lián)合硼替佐米作用于人卵巢癌細(xì)胞系能協(xié)同誘導(dǎo)凋亡，協(xié)同作用遠(yuǎn)大于相同劑量單獨(dú)用藥組[9]。本研究應(yīng)用流式凋亡試劑盒檢測，證實(shí)TSA和ATRA的聯(lián)合誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞株的凋亡作用，其聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率為7.79%，與對(duì)照組、TSA組、ATRA組相比，細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。證實(shí)TSA聯(lián)合ATRA對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株具有協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

組蛋白高乙?；谷旧|(zhì)呈開放狀態(tài)，是轉(zhuǎn)錄活化所必需的條件之一。本實(shí)驗(yàn)中TSA聯(lián)合ATRA明顯上調(diào)組蛋白H3（AC-H3）的表達(dá)，提示聯(lián)合用藥可明顯提高腫瘤細(xì)胞的乙?；?。研究證實(shí)乙?；揎椏烧{(diào)控抑癌基因 p53、P21、P-STAT3 等表達(dá)[10]。P53基因具有監(jiān)視基因組的完整性和修復(fù)DNA 損傷的作用[11]。HDACs可以嚴(yán)格調(diào)控p53乙?；饔?，用TSA處理后細(xì)胞內(nèi)乙酰化p53的比例明顯增高。p21是分化相關(guān)基因，位于p53基因下游，可以和 p53 共同構(gòu)成細(xì)胞周期G1檢查站，阻斷周期素依賴性激酶活性，對(duì)細(xì)胞生長阻滯發(fā)揮重要作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；敢种苿⊿uberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）提高p21基因相關(guān)的染色質(zhì)乙?；M蛋白的表達(dá)[13]。本研究中經(jīng)TSA和ATRA聯(lián)合處理后，Western Blot方法檢測卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中p53、p21蛋白的表達(dá)明顯升高，可能通過提高p53、p21的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Stat-3與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、血管新生及腫瘤免疫逃避等密切相關(guān)，Stat-3通路持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡變。Huang等研究發(fā)現(xiàn)Stat3在卵巢癌細(xì)胞系中持續(xù)激活表達(dá)升高，阻斷Stat3的高表達(dá)可抑制 CyclinD1 蛋白的表達(dá)[14]。本研究證實(shí)TSA聯(lián)合ATRA抑制了P-stat-3的表達(dá)，提示TSA與ATRA的協(xié)同作用可能是通過下調(diào)P-stat-3的表達(dá)來調(diào)控卵巢惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。

細(xì)胞凋亡是維持機(jī)體在細(xì)胞數(shù)量上動(dòng)態(tài)平衡的機(jī)制之一，惡性腫瘤的細(xì)胞凋亡往往與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān) ，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡 ，可抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展 。細(xì)胞凋亡主要涉及的蛋白有Caspase 家族蛋白、BCL-2家族蛋白。目前主要研究的BCL-2家族蛋白包括BCL-2、MCL-1、BCL-XL等[15]。Caspase家族共有14個(gè)成員，研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡中存在Caspase的活化，參與多種與凋亡有關(guān)的生理和病理過程。Caspase 家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者是Caspase-3[16]。本研究證實(shí)TSA聯(lián)合ATRA顯著下調(diào)了BCL-2、MCL-1、BCL-XL的表達(dá)，提高Caspase-3活性，促進(jìn)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞的凋亡。綜上所述，TSA聯(lián)合ATRA對(duì)SKOV-3細(xì)胞具有協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，其相關(guān)的協(xié)調(diào)凋亡機(jī)制增強(qiáng)了卵巢癌SKOV-3的乙?；饔?，上調(diào)了AC-H3表達(dá)，并進(jìn)一步上調(diào)P53、P21、activecaspase-3蛋白表達(dá)水平，下調(diào)P-sat-3、BCL-2、MCL-1、BCL-XL蛋白表達(dá)水平。同時(shí)這一協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞作用為卵巢癌的治療提供了新的方法，值得進(jìn)一步研究探索。

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（本文編輯：王虹）

Trichostatin A Combined with All-trans Retinoic Acid Induce Apoptosis in Human Ovarian Cancer Cell Line SKOV-3

SHENG Jia-jia，LIU Yu-sheng. Anhui Women and Child Health Care Hospital，HeFei，230001

Objective To investigate the apoptotic effect on human ovarian cancer cells by both Trichostatin A（TSA）and all-trans retinoic acid（ATRA）and synergistic effect. Methods SKOV-3 cells were treated by different group of TSA and ATRA. The inhibitory rate of proliferation and the apoptosis rate were examined. Western blot was introduced to evaluate the protein expression levels. Results The proliferation of SKOV-3 cells was significantly suppressed by TSA combined with ATRA and the difference was significant compared with other groups （P＜0.05）. The apoptosis rate of combination group was higher than that of other groups and the difference was significant （P＜0.05）. Conclusion TSA combination with ATRA induces cytotoxicity in ovarian cancer cells in vitro，and the effect was much more significant than other groups.

Trichostatin A All-trans retinoic acid Cell apoptosis SKOV-3 cells

R984 R737.31

A

1671-2587（2017）04-0321-04

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.04.003

230001 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院，安徽省婦幼保健院

盛佳佳（1985–），女，安徽合肥人，醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤及生殖醫(yī)學(xué)研究工作，（E-mail）sheng13956942890@163.com。

劉雨生，男，主任醫(yī)師，主要從事生殖醫(yī)學(xué)與內(nèi)分泌學(xué)研究，（E-mail）shengzhizhongxin@126.com。（Santa Cruz）。辣根酶標(biāo)記二抗（北京中杉金橋公司）。TSA和ATRA（Sigma）用二甲基亞砜（DMSO）稀釋，–20℃保存。

2017-01-28）