環(huán)尾狐猴源弓形蟲多位點基因的克隆、測序及基因分型

楊芳李康信徐春忠單芬陳武*彭仕明李婉萍李國清

(1.華南農(nóng)業(yè)大學，廣州，510642；2.上海市野生動物園有限公司，上海，201300；3.廣州動物園，廣州，510070)

環(huán)尾狐猴源弓形蟲多位點基因的克隆、測序及基因分型

楊 芳李康信徐春忠單 芬3陳 武3*彭仕明李婉萍李國清1*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學，廣州，510642；2.上海市野生動物園有限公司，上海，201300；3.廣州動物園，廣州，510070)

稿件運行過程

剛地弓形蟲； 基因分型； 環(huán)尾狐猴

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種呈世界性分布的專性細胞內(nèi)寄生原蟲，其宿主范圍十分廣泛，能感染包括人類在內(nèi)的幾乎所有溫血動物，引起人獸共患寄生蟲病[1]。人類對弓形蟲普遍易感，據(jù)估計全球約有1/3的人感染弓形蟲，我國人群弓形蟲血清抗體平均陽性率為7.88%[2]。本蟲的終末宿主為貓及其他貓科動物，人、多種哺乳動物和鳥類為其中間宿主。人和動物感染弓形蟲主要是通過食入含有包囊的生的或未煮熟的肉類，攝入被卵囊污染的食物或飲水，及垂直傳播[3]。免疫系統(tǒng)正常者感染弓形蟲通常表現(xiàn)為無癥狀的隱性感染，但對于免疫功能低下或缺陷者(如惡性腫瘤、器官移植或HIV感染者)則可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害和全身性播散感染，甚至引起死亡[4]。孕婦感染弓形蟲后可通過胎盤或者母體生理性免疫應(yīng)答紊亂導(dǎo)致不良妊娠[5]。

剛地弓形蟲的基因型有著高度的地域差異性和豐富的遺傳多樣性，目前，DNA序列分析是研究弓形蟲基因多態(tài)性的最精確的分子生物學的方法之一，通過PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)、微衛(wèi)星DNA序列分析和多位點DNA序列分析等方法可實現(xiàn)對弓形蟲的高分辨率基因分型[6-8]。一系列不同的遺傳位點已經(jīng)作為靶基因應(yīng)用于弓形蟲的PCR檢測方法中，目前應(yīng)用較多的特異性遺傳標記是B1基因、SAG2基因和529 bp DNA序列。Burg等[9]在1989年首次對B1基因進行鑒定，B1基因在弓形蟲基因組中有35個拷貝，具有公認的高度特異性。袁恒青等[5]對安徽豬源弓形蟲529 bp重復(fù)序列進行了PCR擴增和序列分析，結(jié)果表明該基因適合作為弓形蟲病診斷的靶基因。陳志強等[10]對弓形蟲上海株SAG2基因進行克隆與鑒定，并進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)不同宿主和不同區(qū)域上的弓形蟲SAG2基因序列差異很小，作為候選疫苗和診斷抗原，有著廣闊的發(fā)展前景。

環(huán)尾狐猴(Lemurcatta)對弓形蟲有較強的易感性，感染弓形蟲后可出現(xiàn)急性死亡。Sureau等[11]在1962年首次從環(huán)尾狐猴身上分離到剛地弓形蟲，隨后，有關(guān)環(huán)尾狐猴感染弓形蟲的研究相繼被報道。Dubey等[12]報道了辛辛那提動物園環(huán)尾狐猴由于感染弓形蟲而死亡，其傳染源可能是來自關(guān)在狐猴附近的貓排出的弓形蟲卵囊；Spencer等[13]報道了1頭3歲雌性環(huán)尾狐猴由于急性Ⅱ型弓形蟲感染而引起中度肺炎和肝病，最后導(dǎo)致死亡的病例；Yabsley等[14]對美國52頭環(huán)尾狐猴進行弓形蟲陽性率的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其陽性率為5.8%(3/52)。我國弓形蟲病的發(fā)現(xiàn)較晚，對于環(huán)尾狐猴弓形蟲病的報道極少，目前尚未見有關(guān)環(huán)尾狐猴源弓形蟲遺傳進化和生物學特性等方面的研究報道。本研究首次以環(huán)尾狐猴源弓形蟲株為研究對象，采用多位點DNA序列分析對中國廣東地區(qū)環(huán)尾狐猴源弓形蟲株進行基因分型，旨在探討其基因型以及豐富我國弓形蟲基因型資源庫，從而為弓形蟲病的流行病學調(diào)查、診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來源

從廣東某地采集具有典型弓形蟲病臨床癥狀的死亡環(huán)尾狐猴心肝肺腎和腦組織。

1.1.2主要試劑

Ex-Taq酶、buffer、MgCl2、dNTPs、DL 2000 DNA Marker、pMD-18 Vector均購自寶生物工程(大連)有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞均購自北京天根生化科技有限公司；TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒為天根公司產(chǎn)品；TaKaRa MiniBEST Plasmid Purifiction Kit Ver 4.0質(zhì)粒提取試劑盒為大連寶生物公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1病理組織學觀察

剖檢死亡環(huán)尾狐猴并觀察病理變化。采集心肝肺腎和腦等組織樣品，于10%中性福爾馬林中固定48 h后制作常規(guī)石蠟切片，經(jīng)HE染色，顯微鏡下觀察病理組織學變化。

1.2.2 DNA的提取

將采集的病料組織用滅菌的微型剪刀剪碎，然后加入200 μL的Buffer GA反復(fù)研磨，再加入20 μL的蛋白酶K，混勻后置于54℃恒溫水浴鍋中消化3～4 h(每30 min震蕩混勻1次)。消化好的組織懸液按TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒使用說明進行組織DNA的提取，DNA樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增

參照文獻[15]中的10個分型標志物基因特異性引物(其中SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358和PK1為核基因位點，Apico為頂質(zhì)體基因位點)，以本次分離的蟲株基因組DNA為模版，擴增上述10個基因片段。反應(yīng)體系如下：DNA模板2 μL(約55 ng總DNA)，上下游引物各1 μL(25 μmol/mL)，PCR PremixTaq25 μL，總體積為50 μL。擴增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物在含溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖凝膠中110 V電泳30 min，于紫外透射儀上觀察，并通過凝膠成像系統(tǒng)攝像記錄結(jié)果。

1.2.4 PCR擴增產(chǎn)物的克隆及鑒定

用DNA膠回收試劑盒對擴增產(chǎn)物進行回收和純化，純化產(chǎn)物連接pMD18-T Vector上，之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，取轉(zhuǎn)化好的菌液涂布于加有Amp + IPTG + X-gal的LB固體培養(yǎng)基上，倒置平皿，于37℃溫箱中培養(yǎng)12～16 h，無菌挑選白色單菌落(每個PCR產(chǎn)物挑選3個白色單菌落，作重復(fù)對照)，接種于含Amp的LB培養(yǎng)基中于37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜，對菌液進行PCR鑒定。

1.2.5序列測定與同源性分析

陽性菌液采用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purifiction Kit Ver 4.0試劑盒抽提重組質(zhì)粒，并將質(zhì)粒委托生工生物(上海)公司測序，測序采用Sanger法。所得序列運用GenBank中的BLAST工具進行序列比對，并運用DNAStar軟件進行同源性分析。

1.2.6系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

利用Clustalx 1.81及MEGA 5.05軟件對獲得的弓形蟲部分基因位點序列進行比對及計算遺傳距離，然后用MEGA 5.05程序中的鄰接法(neighbor-joining method，NJ)繪制種系發(fā)育樹，采用Tamura-Nei模型進行分析，采用自展檢驗(Bootstrap值)估算所構(gòu)建系統(tǒng)樹的可靠性，復(fù)制數(shù)為1 000。

2 結(jié)果

2.1病理組織學變化

肺臟見肺內(nèi)積塵，呈間質(zhì)性肺炎變化，肺泡壁內(nèi)見大量炎性細胞浸潤，肺泡腔中有炎性滲出物(圖1A)；氣管黏膜上皮脫落、出血；氣管固有層內(nèi)見大量淋巴和巨噬細胞為主的炎性細胞浸潤灶(圖1B)；肝發(fā)生局灶性壞死性肝炎，見大淋巴細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤(圖1C)；腦血管周圍水腫，神經(jīng)元變性，腦皮質(zhì)內(nèi)可見炎性粒細胞結(jié)節(jié)(圖1D)；腎小管上皮細胞發(fā)生不同程度的變性，甚至壞死，大量炎性細胞浸潤(圖1E)；心肌細胞出現(xiàn)變性、肌間水腫，可見巨噬細胞和淋巴細胞浸潤(圖1F)。

A：肺；B：肺；C：肝；D：腦；E：腎；F：心A：lung；B：lung；C：liver；D：brain；E：kidney；F：heart圖1 五種臟器的病理組織學觀察(×400)Fig.1 Histopathological observation of five organs(×400)

2.2 PCR擴增

以從環(huán)尾狐猴心肝肺腎組織中提取的基因組DNA為模板，對SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1及Apico這10個基因片段進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，分別可見400 bp、550 bp、300 bp、400 bp、350 bp、500 bp、450 bp、400 bp、900 bp和600 bp左右大小的條帶，均與預(yù)期目的片段大小相一致(圖2)，且無非特異性條帶。

圖2 剛地弓形蟲10個基因片段的PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of 10 gene segments of Toxoplasma gondii 注：M.DL 2000 DNA Marker；1.SAG3位點；2.BTUB位點；3.SAG1位點；4.c29-2位點；5.L358位點；6.GRA6位點；7.PK1位點；8.c22-8位點；9.Apico位點；10.SAG2位點；11.陰性對照 Note：M.DL 2000 DNA Marker；1.SAG3；2.BTUB；3.SAG1；4.c29-2；5.L358；6.GRA6；7.PK1；8.c22-8；9.Apico；10.SAG2；11.Negative control

2.3測序與序列分析

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序，結(jié)果顯示，SAG1基因片段大小為390 bp，SAG2基因片段大小為546 bp，SAG3基因片段大小為311 bp，BTUB基因片段大小為411 bp，GRA6基因片段大小為344 bp，c22-8基因片段大小為521 bp，c29-2基因片段大小為446 bp，L358基因片段大小為418 bp，PK1基因片段大小為903 bp，Apico基因片段大小為614 bp。將測序所得的10個基因片段序列與GenBank和ToxoDB網(wǎng)站(www.toxodb.org)下載的典型弓形蟲株RH株、ME49株和VEG株相應(yīng)序列進行比對，結(jié)果表明環(huán)尾狐猴弓形蟲株(TgRTL1)在SAG2、SAG3、c22-8、GRA6、PK1位點為基因Ⅱ型；在SAG1、L358、BTUB、c29-2位點為非典型基因型；在Apico位點為基因Ⅰ型(圖3)。

2.4弓形蟲部分基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

種系發(fā)育分析結(jié)果顯示，基于L358、PK1、c22-8基因序列以NJ法建立的系統(tǒng)進化樹基本一致(圖4)，弓形蟲RH株和GT1株屬于基因型Ⅰ型，位于同一分支上，弓形蟲基因Ⅰ型和Ⅱ型蟲株之間得到了較好的區(qū)分。本次所獲環(huán)尾狐猴源弓形蟲株(TgRTL1)基于L358、PK1、c22-8基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹均與基因Ⅱ型蟲株遺傳距離最近，在遺傳進化樹上處于同一分支。

MarkerSAG1-ChrVIIISAG2-ChrVIIIL358-ChrvNucleotide104192285302337355ALLELE92693594610861329ALLELE35157205ALLELEConsensusGCCGACCGGAATGCRHATGAGTⅠ．．．．．Ⅰ．．GⅠME49．．．．．．ⅡGCTC．ⅡCA．ⅡVEG．．．．．．Ⅲ．．．．GⅢ．．．ⅢTgRTL1．．．．G．U1GCTC．ⅡC．．U1A

Markerc22-8-ChrIbGRA6-ChrXBTUB-ChrIXNucleotide6696168376ALLELE98128163228ALLELE2489126129289ALLELEConsensusAATGCTCACCCGCRH．．CAⅠ．G．．Ⅰ．．．．TⅠME49．．．．ⅡT．．GⅡGGGC．ⅡVEGTG．．Ⅲ．．T．Ⅲ．．．．．ⅢTgRTL1．．．．ⅡT．．GⅡ．．．C．U1B

Markerc29-2-ChrIIIPK1-ChrVINucleotide164680190384403ALLELE3156144249325350437635766ALLELEConsensusGCAGTGGCGACGATCRHA．C．A．ⅠA．AC．．．GTⅠME49．．．A．AⅡ．．．．．．．．．ⅡVEG．G．．．．Ⅲ．A．．TATG．ⅢTgRTL1AG．．．．U1．．．．．．．．．ⅡC

MarkerApicoSAG3-ChrXIINucleotide150528ALLELE118145189ALLELEConsensusTCGTGRH．．ⅠC．．ⅠME49C．Ⅱ．CAⅡVEG．TⅢ-．．ⅢTgRTL1．．Ⅰ．CAⅡD

圖3環(huán)尾狐猴源弓形蟲10個遺傳標記基因多態(tài)性分析

Fig.3.Polymorphisms at 10 genetic markers by direct PCR-DNA sequencing ofToxoplasmagondiiisolates fromLemurcattafrom China

注：A、B、C、D分別為SAG1，SAG2，L358基因位點；c22-8，GRA6，BTUB基因位點；c29-2，PK1基因位點和Apico，SAG3基因位點的DNA序列分析。Consensus序列由至少2個典型Type I，II和III基因型的共同等位基因組成。使用RH株作為參考蟲株，其序列登錄號GQ253075，M33572，EU258490，AM055943，JX044183，JX045446 和 L42007分別對應(yīng)SAG1，SAG2，L358，c22-8，GRA6，BTUB和PK1基因位點，c29-2，Apico和SAG3基因片段在ToxoDB網(wǎng)站(www.toxodb.org)進行blasted搜索；使用ME49株作為參考蟲株，其序列登錄號XM_018781602，XM_018781958和XM_002371898分別對應(yīng)SAG2，L358和GRA6基因位點，SAG1，c22-8，BTUB，c29-2，PK1，Apico和SAG3基因片段在ToxoDB網(wǎng)站(www.toxodb.org)進行blasted搜索；使用VEG株作為參考蟲株，其序列登錄號LN714498，LN714498，LN714494，LN714490，LN714500，LN714499，LN714492和LN714495分別對應(yīng)SAG1，SAG2，L358，c22-8，GRA6，BTUB，c29-2和PK1基因位點，Apico和SAG3基因片段在ToxoDB網(wǎng)站(www.toxodb.org)進行blasted搜索?！?”指代和consensus序列相一致；“-”指代基因的插入或缺失?！皍”指代非典型等位基因；I，II 和III分別指TypeⅠ，Ⅱ和Ⅲ基因型分離株的典型等位基因序列

Note：DNA sequence analysis at(A)SAG1，SAG2，L358；(B)c22-8，GRA6，BTUB；(C)c29-2，PK1 and(D)Apico，SAG3.Consensus sequence is defined as the nucleotide shared by at least two of the three archetypal Type I，II and III strain alleles.GenBank accession no.GQ253075，M33572，EU258490，AM055943，JX044183，JX045446 and L42007 for SAG1，SAG2，L358，c22-8，GRA6，BTUB and PK1 respectively，for c29-2，Apico and SAG3 the amplicon was blasted(using the BlastN algorithm)at ToxoDB(www.toxodb.org)and the corresponding RH sequence used as the reference；GenBank accession no.XM_018781602，XM_018781958 and XM_002371898 for SAG2，L358 and GRA6 respectively，for SAG1，c22-8，BTUB，c29-2，PK1，Apico and SAG3 the amplicon was blasted(using the BlastN algorithm)at ToxoDB(www.toxodb.org)and the corresponding ME49 sequence used as the reference；GenBank accession no.LN714498，LN714498，LN714494，LN714490，LN714500，LN714499，LN714492 and LN714495 for SAG1，SAG2，L358，c22-8，GRA6，BTUB，c29-2and PK1 respectively，for Apico and SAG3 was blasted(using the BlastN algorithm)at ToxoDB(www.toxodb.org)and the corresponding VEG sequence used as the reference.“.”indicates identity with consensus；“-”indicates an insertion/deletion.“u”indicates a nonarchetypal allele；Ⅰ，Ⅱ or Ⅲ refers to an archetypal allelic sequence from a Type Ⅰ，Ⅱ or Ⅲ strain

圖4 弓形蟲 L358(A)、PK1(B)、c22-8(C)基因以NJ法建立的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on L358(A)，PK1(B)，c22-8(C)gene of Toxoplasma gondii by neighbor-joining (NJ)method

2.5 弓形蟲基因分型

采用10個遺傳位點，對本室分離的環(huán)尾狐猴源弓形蟲株進行PCR擴增和序列分析，對其進行基因分型，共揭示了1個基因型(ToxoDB#3)(表1)。

表1 中國廣州環(huán)尾狐猴源弓形蟲蟲株基因型

Tab.1 Multi-locus genotypes of Toxoplasma gondii isolates from Lemur catta from Guangzhou，China

3 討論

將廣東某地圈養(yǎng)感染弓形體死亡的環(huán)尾狐猴的心肝肺腎和腦組織制作石蠟切片，觀察其病理組織變化主要表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎的變化、肝發(fā)生局灶性壞死性肝炎、腎小管上皮細胞不同程度的變性和壞死變化、腦神經(jīng)元變性，腦皮質(zhì)內(nèi)可見炎性粒細胞結(jié)節(jié)和心肌細胞出現(xiàn)變性，可見巨噬細胞和淋巴細胞浸潤等變化，這些與王小波[16]等報道的豬感染弓形蟲主要病理組織學變化基本一致。

傳統(tǒng)的弓形蟲基因型分類基于弓形蟲對小鼠的毒力強弱可將其分為typeⅠ型、typeⅡ型和typeⅢ型。typeⅠ型蟲株為強毒株(LD100=1 parasite)，typeⅡ型和type Ⅲ型蟲株為弱毒株(LD50>1 000 parasites)。隨著PCR及其衍生技術(shù)在弓形蟲分離株的基因鑒定和分型中的廣泛應(yīng)用，對弓形蟲有了更廣泛深入的研究，越來越多的弓形蟲克隆世系被研究者們發(fā)現(xiàn)。研究表明，世界各地的弓形蟲株基因型具有豐富的遺傳多態(tài)性，王林等[3]對世界各地區(qū)弓形蟲株種群結(jié)構(gòu)分布概況的研究顯示，typeⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型為流行于北美和歐洲的優(yōu)勢基因型；流行南美洲的弓形蟲具有復(fù)雜的遺傳多態(tài)性，主要包括BrⅠ型、BrⅡ型、BrⅢ型和BrⅣ型，此外還有少數(shù)其他的基因型，如：ToxoDB#65型、ToxoDB#7型等；流行于非洲的弓形蟲分離株基因型主要以Ⅱ型和Ⅲ型為主，此外，Africa1型和Africa3型亦為流行非洲的弓形蟲株優(yōu)勢基因型。然而對于我國流行的弓形蟲蟲株基因型方面的研究尚十分欠缺，本研究在廣東省1只發(fā)生弓形蟲病死亡的環(huán)尾狐猴中分離得到弓形蟲蟲株(TgRTL1)，并采用多位點PCR-DNA測序法進行基因型鑒定，結(jié)果顯示其基因型為ToxoDB#3。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基于L358、PK1、c22-8基因構(gòu)建的進化樹具有一致性，均與屬于基因Ⅱ型的PTG株和ME49株位于同一分支，而屬于基因Ⅰ型的RH株和GT1株位于另一分支，這表明L358、PK1和c22-8基因能作為遺傳標記區(qū)分剛地弓形蟲蟲株。

PCR-DNA測序是對生物遺傳信息鑒定的標準，是研究弓形蟲基因多態(tài)性的最精確的分子生物學的方法之一。Fraz?o-Teixeira等[17]采用PCR-RFLP和PCR-DNA測序法分析來源于豬的弓形蟲分離株的基因，對兩種方法進行對比研究，認為PCR-DNA測序法比PCR-RFLP方法更能有效地發(fā)現(xiàn)非典型等位基因，并且PCR-RFLP技術(shù)對于存在大量非典型等位基因的部分地區(qū)分離株很難做出準確的基因分型，而PCR-DNA測序法卻能彌補PCR-RFLP技術(shù)的這一不足，能對含有較多非典型等位基因的弓形蟲蟲株做出準確分型。Binas等[18]對DNA聚合酶α基因的625 bp的內(nèi)含子進行序列分析，進而鑒定10株屬于兩個不同世系的弓形蟲蟲株是有毒力的。

我國地域遼闊，動物種類繁多，但研究顯示，流行于中國的弓形蟲分離株具有有限的遺傳多態(tài)性，且以Chinese 1型(ToxoDB#9)為其優(yōu)勢基因型[2，19-21]。本研究對從廣東分離的環(huán)尾狐猴源弓形蟲株采用PCR-DNA測序法進行基因型分析，結(jié)果顯示其基因型為ToxoDB#3(表1)，該基因型亦在分離自中國青海的綿羊、新疆維吾爾自治區(qū)的鳥類弓形蟲中有過報道[22]。同時，Zhou等[23]應(yīng)用PCR-RFLP分析17株來自中國不同地區(qū)不同宿主的弓形蟲株基因型，結(jié)果顯示，12株(70.6%)屬于ToxoDB#3；Dubey等[24]報道的17株從廣東分離到的貓源性弓形蟲中，15株(88%)屬于ToxoDB#3型譜系。這些數(shù)據(jù)表明我國弓形蟲不僅有優(yōu)勢基因型Chinese 1型流行，ToxoDB#3也是中國大陸流行的主要世系之一。

基因型ToxoDB#3在斯里蘭卡、哥倫比亞、越南和澳大利亞的狗源和貓源弓形蟲分離株中亦有過報道，這表明它在亞洲、澳洲和南美也普遍流行[25-28]。本研究對廣東環(huán)尾狐猴源弓形蟲株進行基因分型，運用DNA序列分析法對10個遺傳位點進行擴增和序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染廣東環(huán)尾狐猴的弓形蟲株基因型為ToxoDB#3型，進一步驗證了我國弓形蟲株優(yōu)勢基因型不僅有Chinese 1型，且ToxoDB#3也有廣泛的分布。同時豐富了我國現(xiàn)有的弓形蟲蟲株基因庫的數(shù)據(jù)，也為進一步探討我國弓形蟲生物學、流行病學、弓形蟲病的診斷和疫苗的研究提供了理論依據(jù)。

[1] Switaj K，Master A，Skrzypczak M，et al.Recent trends in molecular diagnostics forToxoplasmagondiiinfections [J].Clinical Microbiology and Infection，2005，11(3)：170-176.

[2] Chen Z W，Gao J M，Huo X X，et al.Genotyping ofToxoplasmagondiiisolates from cats in different geographic regions of China [J].Veterinary Parasitology，2011，183(1/2)：166-170.

[3] 王林，沈繼龍.剛地弓形蟲基因型和與基因型相關(guān)的致病機制研究進展[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2013，31(4)：319-324.

[4] 徐曉佩，劉文閣，張念章，等.剛地弓形蟲GRA25基因的克隆及序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2016，43(3)：650-655.

[5] 袁恒青，徐前明，李培英.弓形蟲529 bp基因的克隆及序列分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2012，44(11)：60-63.

[6] Ajzenberg D，Banuls A L，Su C，et al.Genetic diversity，clonality and sexuality inToxoplasmagondii[J].International Journal for Parasitology，2004，34(10)：1185-1196.

[7] Khan A，F(xiàn)ux B，Su C，et al.Recent transcontinental sweep ofToxoplasmagondiidriven by a single monomorphic chromosome [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2007，104(37)：14872-14877.

[8] Su C，Shwab E K，Zhou P，et al.Moving towards an integrated approach to molecular detection and identification ofToxoplasmagondii[J].Parasitology，2010，137(1)：1-11.

[9] Burg J L，Grover C M，Pouletty P，et al.Direct and sensitive detection of a pathogenic protozoan，Toxoplasmagondii，by polymerase chain reaction [J].Journal of Clinical Microbiology，1989，27(8)：1787-1792.

[10] 陳志強，程天印，王權(quán)，等.弓形蟲上海株SAG2基因克隆和序列分析[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病，2007，15(2)：12-15.

[11] Sureau P，Raynaud J P，Lapeire C，et al.1st isolation ofToxoplasmagondiiin Madagascar.Spontaneous and experimental toxoplasmosis inLemurcatta[J].Bulletin de la Société de Pathologie Exotique et de Ses Filiales，1962，55(3)：357-362.

[12] Dubey J P，Kramer L W，Weisbrode S E.Acute death associated withToxoplasmagondiiin ring-tailed lemurs [J].Journal of the American Veterinary Medical Association，1985，187(11)：1272-1273.

[13] Spencer J A，Joiner K S，Hilton C D，et al.Disseminated toxoplasmosis in a captive ring-tailed lemur(Lemurcatta)[J].Journal of Parasitology，2004，90(4)：904-906.

[14] Yabsley M J，Jordan C N，Mitchell S M，et al.Seroprevalence ofToxoplasmagondii，Sarcocystisneurona，andEncephalitozooncuniculiin three species of lemurs from St.Catherines Island，GA，USA [J].Veterinary Parasitology，2007，144(1/2)：28-32.

[15] Ferreira I M R，Vidal J E，de Mattos C C B，et al.Toxoplasmagondiiisolates：multilocus RFLP-PCR genotyping from human patients in Sao Paulo State，Brazil identified distinct genotypes [J].Experimental Parasitology，2011，129(2)：190-195.

[16] 王小波，許金俊，吳力力，等.豬源弓形蟲YZ株的分離與鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學報，2013，35(11)：940-942.

[17] Fraz?o-Teixeira E，Sundar N，Dubey J P，et al.Multi-locus DNA sequencing ofToxoplasmagondiiisolated from Brazilian pigs identifies genetically divergent strains [J].Veterinary Parasitology，2011，175(1/2)：33-39.

[18] Binas M，Johnson A M.A polymorphism in a DNA polymerase alpha gene intron differentiates between murine virulent and avirulent strains ofToxoplasmagondii[J].International Journal for Parasitology，1998，28(7)：1033-1040.

[19] Wang L，Chen H，Liu D，et al.Genotypes and mouse virulence ofToxoplasmagondiiisolates from animals and humans in China [J].PLoS One，2013，8(1)：e53483.

[20] Wang H，Wang T，Luo Q，et al.Prevalence and genotypes ofToxoplasmagondiiin pork from retail meat stores in Eastern China [J].International Journal of Food Microbiology，2012，157(3)：393-397.

[21] Jiang H H，Huang S Y，Zhou D H，et al.Genetic characterization ofToxoplasmagondiifrom pigs from different localities in China by PCR-RFLP [J].Parasites & vectors，2013，6(1)：227.

[22] Huang S Y，Cong W，Zhou P，et al.First Report of Genotyping ofToxoplasmagondiiIsolates From Wild Birds in China [J].Journal of Parasitology，2012，98(3)：681-682.

[23] Zhou P，Zhang H，Lin R Q，et al.Genetic characterization ofToxoplasmagondiiisolates from China [J].Parasitology International，2009，58(2)：193-195.

[24] Dubey J P，Zhu X Q，Sundar N，et al.Genetic and biologic characterization ofToxoplasmagondiiisolates of cats from China [J].Veterinary Parasitology，2007，145(3/4)：352-356.

[25] Dubey J P，Rajapakse R P V J，Wijesundera R R M K K，et al.Prevalence ofToxoplasmagondiiin dogs from Sri Lanka and genetic characterization of the parasite isolates [J].Veterinary Parasitology，2007，146(3/4)：341-346.

[26] Dubey J P，Cortés-Vecino J A，Vargas-Duarte J J，et al.Prevalence ofToxoplasmagondiiin dogs from Colombia，South America and genetic characterization ofT.gondiiisolates [J].Veterinary Parasitology，2007，145(1/2)：45-50.

[27] Dubey J P，Huong L T T，Sundar N，et al.Genetic characterization ofToxoplasmagondiiisolates in dogs from Vietnam suggests their South American origin [J].Veterinary Parasitology，2007，146(3/4)：347-351.

[28] Brennan A，Donahoe S L，Beatty J A，et al.Comparison of genotypes ofToxoplasmagondiiin domestic cats from Australia with latent infection or clinical toxoplasmosis [J].Veterinary Parasitology，2016，228：13-16.

Toxoplasmagondii； Genotyping； Ring-tailed lemur (Lemurcatta)

為確定引起廣東環(huán)尾狐猴(Lemurcatta)疑似弓形蟲病的病原，從2只死亡的環(huán)尾狐猴體內(nèi)無菌采集肺臟、肝臟、心、腎和腦等組織制作常規(guī)石蠟切片，HE染色。通過病理組織學觀察，鑒定為弓形蟲(Toxoplasmasp.)后，采用PCR-DNA測序分析方法對環(huán)尾狐猴源分離蟲株(TgRTL1)的SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、L358、PK1、c22-8、c29-2和Apico基因位點進行PCR擴增、克隆和測序，采用DNAStar和MEGA5.05軟件，將所獲序列與網(wǎng)上下載的弓形蟲RH株、ME49株和VEG株相應(yīng)序列進行比對和同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，從廣東分離的環(huán)尾狐猴源弓形蟲株，在10個遺傳位點經(jīng)PCR-DNA測序分析，確定該蟲株的基因型為ToxoDB#3。本研究是對中國環(huán)尾狐猴源弓形蟲采用多位點DNA序列分析進行基因型鑒定的首次報道，為進一步研究我國弓形蟲流行病學、生物學特性以及弓形蟲病的診斷提供了科學理論依據(jù)。

Multi-Locus Genotyping of the Toxoplasma gondii Isolated from Captive Ring-Tailed Lemur (Lemur catta)in China

Yang Fang1Li Kangxin1Xu Chunzhong2Shan Fen3Chen Wu3*Peng Shiming3Li Wanping3Li Guoqing1*

(1.South China Agricultural University，Guangzhou，510642，China；2.Shanghai Wild Animal Park Company Limited，Shanghai，201300，China；3.Guangzhou Zoo，Guangzhou，510070，China)

To determine the pathogen of a case suspected toxoplasmosis in lemurs in Guangdong，we sampled tissues of lung，liver，heart，kidney and brain from two dead ring-tailed lemurs and made routine paraffin sections for HE staining.After the pathogen was identified asToxoplasmaby pathological histology observation，10 genetic markers of theT.gondiistrain (TgRTL1)，including 9 nuclear loci of SAG1，SAG2，SAG3，BTUB，GRA6，L358，PK1，c22-8，c29-2 and an apicoplast locus of Apico were amplified，cloned and sequenced.The nucleotide variations and sequence similarities amongT.gondiistrains were analyzed by software DNAStar and MEGA version 5.05，and a phylogenetic tree was constructed.The result indicated that theT.gondiiisolates fromLemurcattain Guangdong belong to the genotype of ToxoDB#3 according to 10 genetic markers.This study is the first report of genotyping of theT.gondiiisolates fromLemurcattain China by multi-locus DNA sequencing，and provides basis for research onT.gondiiepidemiology and its biological characteristics，and the diagnosis of toxoplasmosis in future.

楊芳，女，24歲，碩士研究生；主要從事獸醫(yī)寄生蟲研究。

*通訊作者：陳武，E-mail：guangzhouchenwu@sina.com；李國清，E-mail：gqLi@scau.edu.cn

2016-11-18

S852.73

A

修回日期：2016-12-06

發(fā)表日期：2017-05-10

2310-1490(2017)02-187-07