梅花鹿鹿茸尖端組織Tβ-4基因全長cDNA的分離與生物信息學(xué)分析

黃皓郝麗肖向紅劉暢李和平柴龍會張晶鈺

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

梅花鹿鹿茸尖端組織Tβ-4基因全長cDNA的分離與生物信息學(xué)分析

黃 皓 郝 麗肖向紅 劉 暢李和平 柴龍會 張晶鈺

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

稿件運行過程

鹿茸； 胸腺素β4； cDNA文庫； 分離； 生物信息學(xué)

鹿是十分珍貴的藥用動物，幾乎全身都可入藥和經(jīng)濟利用，而鹿茸是其中重要的產(chǎn)品之一[1]。鹿茸是雄鹿(馴鹿除外)未骨化密生茸毛的幼角[2-3]，是唯一具有周期性再生能力的哺乳動物器官[4]，作為鹿體最活躍的生長點，擁有驚人的生長速度(最快可達2 cm/d)[5-6]，現(xiàn)已成為研究哺乳動物細胞增殖、生長與分化的理想材料，可作為模擬哺乳動物器官再生及創(chuàng)傷修復(fù)得天獨厚的理想動物模型[7-8]。

胸腺素(Thymosins)是由胸腺產(chǎn)生的一種淋巴生長因子，依據(jù)胸腺提取物組分等電點的不同，可劃分為α、β、γ 3個生化組成不同和功能不同的多肽家族，其β族胸腺素(Thymosin β，Tβ)屬極性蛋白質(zhì)分子家族，有著不同程度地影響血管發(fā)生以及誘導(dǎo)凋亡的特性[9-10]。目前已發(fā)現(xiàn)15種，Tβ-4、Tβ10和Tβ15為主要成員，而其中Tβ-4亞型分布最廣泛，含量最多[11-12]，是目前研究的熱點之一[13-14]。在絕大多數(shù)哺乳動物細胞中，Tβ-4 被認為是主要的G-肌動蛋白(G-actin)結(jié)合肽，其主要生理功能是能夠遮蔽單體G-actin的ATP結(jié)合位點，能與G-actin按1∶1比例結(jié)合成G-肌動蛋白-Tβ-4復(fù)合體，從而阻斷其聚合成微絲，在維持細胞骨架的動態(tài)平衡中起著重要作用[15]。Tβ-4不僅具有免疫活性，而且表現(xiàn)出多重生物學(xué)功能，參與了血管生成[16]、神經(jīng)發(fā)育[17-18]、創(chuàng)傷愈合[19-20]、炎癥反應(yīng)[21]、細胞凋亡[22]、惡性腫瘤發(fā)生[23-24]及毛囊發(fā)育[25]等多種生理、病理學(xué)過程的調(diào)節(jié)。

本實驗室從構(gòu)建的cDNA文庫的ESTs(表達序列標簽)測序數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)Tβ-4基因為鹿茸尖端組織絕對高豐度表達基因，提示它可能是鹿茸發(fā)育過程中重要的調(diào)節(jié)因子。因此，本研究從梅花鹿鹿茸尖端組織全長cDNA文庫中首次成功克隆了具有完整編碼區(qū)的 Tβ-4基因的全長cDNA序列，并利用生物信息學(xué)方法對其序列進行了結(jié)構(gòu)分析，為進一步研究Tβ-4的生物學(xué)功能及其在鹿茸生長發(fā)育中的分子調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

選取人工馴養(yǎng)的4歲健康東北梅花鹿(Cervus nippon)公鹿為試驗動物，在其生茸至二杠茸型時，將鹿麻醉，采集茸頂端組織為試驗樣品(該處為鹿茸生長發(fā)育中細胞增殖、生長和分化中心)。用手術(shù)刀迅速切取鹿茸頂端約4 cm組織用酒精棉擦去茸皮表面污物，參照Li等[26]對馬鹿(Cervus elaphus)生長頂端的分層方法(圖1)，切取皮膚層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層組織各25 mg，總共100 mg，于液氮保存。

圖1 鹿茸組織分離位置Fig.1 Position of isolated tissue in deer antlerD-茸皮層；RM-間充質(zhì)層；PC-前軟骨層；TZ-過渡層；C-軟骨層D-Drmis；RM-Reserve mesenchyme；PC-Precartilage；TZ-Transition zone；C-Cartilage

1.2 Tβ-4基因全長cDNA的獲得

按試劑盒 SV Total RNA Isolation System(Promega公司)操作說明提取鹿茸樣品總RNA。依照Creator TM SMART TM cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(Clontech公司)說明，進行全長cDNA文庫構(gòu)建：以逆轉(zhuǎn)錄酶PowerScript TM反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈 cDNA，通過LD-PCR合成并擴增ds cDNA。擴增產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶K消化、SfiⅠ酶切、過Chroma SPIN-400柱去除小片段后，連接到pDNR-LIB質(zhì)粒載體中，經(jīng)電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli DH5α，搖菌復(fù)蘇得到原始文庫。

在3730XL測序儀上使用M13通用引物對鹿茸尖端組織原始文庫中大量隨機挑取的單菌落進行了5′端 ESTs測序。采用 Cross-match 軟件去除 EST 中的低質(zhì)量序列、載體序列、重復(fù)序列等，利用Phrap軟件對高質(zhì)量的 ESTs 進行聚類和拼接，得到重疊群和單拷貝EST。對拼接后的序列采用BLASTX和BLASTN程序(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，在NCBI GenBank非冗余蛋白質(zhì)和核酸庫中進行序列同源性比對，并對具同源相似性的 unigenes使用Gene Ontolog分類標準進行功能注釋。挑取Tβ-4基因?qū)?yīng)的陽性菌落進行PCR鑒定，搖菌制備質(zhì)粒，并對菌落質(zhì)粒DNA進行雙向測序。

1.3 Tβ-4的生物信息學(xué)分析

采用NCBI的ORF和BlastP程序結(jié)合ExPASy ProSite進行開放閱讀框的查找和蛋白保守區(qū)預(yù)測；利用ExPASy服務(wù)器上的ProtParam和ProtScale計算蛋白分子量、理論等電點及分析蛋白疏水性等；程序SignalP 4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMpred(http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)預(yù)測蛋白的信號肽和跨膜區(qū)；使用SOPMA軟件(http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；應(yīng)用ClustalW程序(http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/)進行氨基酸的多重序列比對，MEGA5.1軟件繪制系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 Tβ-4基因全長cDNA的獲得

從梅花鹿茸尖端組織全長cDNA文庫中獲得的Tβ-4基因的陽性菌落經(jīng)PCR鑒定，得到一條長度在750 bp～1 000 bp之間的DNA插入片段(圖2)。進一步對該陽性菌落進行質(zhì)粒提取及雙向測通，測序結(jié)果為770 bp，與預(yù)期片段大小一致。經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，證實為Tβ-4基因的全長cDNA序列(圖3)。

圖2 梅花鹿Tβ-4基因cDNA菌落PCR結(jié)果Fig.2 Results of colony PCR of Tβ-4 gene cDNA from Sika Deer注：M-DL 2000 Marker；1-菌落 PCR 產(chǎn)物Note：M-DL 2000 marker；1-Colony PCR

圖3 梅花鹿鹿茸尖端組織Tβ-4基因的全長cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of Tβ-4 full-length cDNA of velvet antler tip tissue from sika deer

2.2氨基酸理化特性分析

對獲得序列的ORF程序查找顯示：Tβ-4全長cDNA的5′非翻譯區(qū)為198 bp，3′非翻譯區(qū)為437 bp，開放讀碼框為135 bp，編碼44個氨基酸；ProtParam軟件在線分析得到Tβ-4基因分子式C215H357N57O78S2，編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為5 052.65 u，理論等電點為5.02；不穩(wěn)定系數(shù)70.51，屬于不穩(wěn)定蛋白；親水性平均值-1.620；整個氨基酸組成中賴氨酸(20.5%)和谷氨酸(18.2%)占很高比例。

2.3 Tβ-4蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用NCBI的BlastP程序進行蛋白保守區(qū)預(yù)測表明，與此基因匹配的蛋白保守區(qū)有1個“Thymosin family”結(jié)構(gòu)域(圖4)，其匹配區(qū)段從第18～29氨基酸為共有區(qū)，其模式為“L-[KR]-K-T-[DENT]-T-x(2)-K-N-[PT]-L”與ExPASy ProSite程序分析結(jié)果一致；SOPMA軟件預(yù)測結(jié)果顯示，Tβ-4二級結(jié)構(gòu)元件主要以無規(guī)則卷曲為主(分別占56.82%)，其次是α-螺旋(38.64%)，β-轉(zhuǎn)角較少(4.55%)，無折疊結(jié)構(gòu)(圖5)。軟件SignalP 4.1和TMpred預(yù)測結(jié)果指出該蛋白為非跨膜蛋白，且N端未發(fā)現(xiàn)信號肽編碼區(qū)。

圖4 推導(dǎo)的Tβ-4氨基酸保守區(qū)查找Fig.4 Search for the conserved domains in deduced amino acid sequence of Tβ-4

圖5 Tβ-4的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Secondary structure prediction of Tβ-4注：h：α-螺旋，c：無規(guī)則卷曲，t：β-轉(zhuǎn)角Note：h：Alpha helix，c：Random coil，t：Beta turn

2.4不同物種間Tβ-4的同源性分析

將梅花鹿與GenBank中選取的9種動物的Tβ-4氨基酸全序列進行BlastP，并用ClustalW和MEGA5.1軟件對其進行多重序列比對及系統(tǒng)進化樹的繪制(圖6，圖7)，發(fā)現(xiàn)該基因在各物種間存在高度保守性，相似性普遍集中在77%～90%之間，與白頰長臂猿(Nomascusleucogenys)、人(Homosapiens)、牛(Bosmutus)、彩色錦龜(Chrysemyspictabellii)、灰倉鼠(Cricetulusgriseus)、東北虎(Pantheratigrisaltaica)、抹香鯨(Physetercatodon)、光滑爪蟾(Xenopuslaevis)和鴕鳥(Struthiocamelusaustralis)的同源性分別為89 %、87.8%、85.5%、84.3% 、83.2%、82.8%、82.8%、80.1%和77%。

圖6 梅花鹿與其他動物Tβ-4氨基酸的多重序列比對Fig.6 Multiple alignment of amino acid sequences of the sika deer and other animal Tβ-4

圖7 動物Tβ-4系統(tǒng)進化樹Fig.7 The phylogenetic tree of Tβ-4 from animals.

3 討論

鹿茸頂端由幼嫩的組織構(gòu)成，而基部則由成熟組織構(gòu)成，頂端幼嫩組織是鹿茸生長的關(guān)鍵部位。鹿茸從頂端到基部依次分為增殖區(qū)、成熟區(qū)、肥厚區(qū)和鈣化區(qū)。鹿茸快速生長主要是通過激活存在于增殖區(qū)的細胞來實現(xiàn)的，該區(qū)可分為間充質(zhì)層，前軟骨層，過渡層和軟骨層，鹿茸的變長是通過增殖區(qū)細胞經(jīng)軟骨內(nèi)骨化過程完成。隨著鹿茸的不斷生長，增殖區(qū)的厚度逐漸變薄，直到秋季交配季節(jié)來臨，增殖區(qū)完全消失，茸角停止生長，隨后茸皮脫落，鹿茸完全骨化，形成鹿角。因此，本研究選取鹿茸頂端增殖區(qū)作為主要的試驗材料。

Tβ-4蛋白的構(gòu)象顯示7～15位和34～44位氨基酸形成2個α-螺旋結(jié)構(gòu)，在鹽溶液中該二級結(jié)構(gòu)是Tβ-4與肌動蛋白結(jié)合所必需的條件，且N端螺旋區(qū)，是相互結(jié)合的必需結(jié)構(gòu)，其中央保守序列“LKKTETQ”尤為重要，且前3個氨基酸是相互作用的主要接觸點。N端螺旋區(qū)作為與actin作用最強的區(qū)域，通過識別結(jié)合ATP的G-actin，起到分離actin的作用。Tβ-4蛋白其余部分結(jié)構(gòu)不規(guī)則，呈伸展?fàn)顟B(tài)，無折疊，這種結(jié)構(gòu)使Tβ-4具有可變性，而正是這種可變性使其易于識別不同種類的分子目標，通過與G-actin相互作用，從而與免疫和細胞生長的級聯(lián)信號間相互傳遞信息，從而具備多種生物學(xué)功能。

根據(jù)ProtScale軟件分析發(fā)現(xiàn)，Tβ-4蛋白疏水峰值主要出現(xiàn)在score 0.000以下，因此推斷Tβ-4蛋白具有強疏水性，這與軟件ProtParam所獲得的親水性平均值-1.620的結(jié)果相吻合。同源序列分析表明，Tβ-4不僅在哺乳動物中，且從人到兩棲類再到鳥類等各物種動物體內(nèi)均高度保守。梅花鹿與牛、人、白頰長臂猿親緣關(guān)系較近，氨基酸同源性高于85%；與彩色錦龜、灰倉鼠、虎、抹香鯨的親緣關(guān)系次之，氨基酸同源性均高于82%；與光滑爪蟾、鴕鳥的親緣關(guān)系較遠?？梢娒坊古c陸生哺乳動物親緣關(guān)系更近，與兩棲類和鳥類親緣關(guān)系較遠。

鹿茸是在復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控下短期內(nèi)能迅速成長為骨、血管、毛發(fā)和神經(jīng)等俱全的綜合器官，受特定的作用機理調(diào)控，許多重要的功能基因，都參與了其生長發(fā)育過程的調(diào)節(jié)。鹿茸除了具有周期性再生能力外，還存在多種特殊的生命現(xiàn)象，例如鹿茸含其他哺乳動物所沒有的血管化軟骨組織；茸角傷口愈合而不留疤痕；鹿茸角的生長最快可達2 cm/d，其速度比癌細胞還要快30幾倍，且在這樣快速生長情況下形成的鹿茸組織竟然沒有任何癌變跡象等等，然而至今對這些生命現(xiàn)象的內(nèi)在機制還沒有從根本上闡明。由于Tβ-4在真核生物細胞中具有多重生物學(xué)功能(參與了包括血管生成、神經(jīng)發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、惡性腫瘤發(fā)生及毛囊發(fā)育等多種生理和病理學(xué)過程的調(diào)節(jié))，且在鹿茸尖端組織屬絕對高豐度表達基因，推測Tβ-4很可能參與了鹿茸發(fā)育中多種生物學(xué)過程的調(diào)控。因此，本研究首次從梅花鹿鹿茸尖端組織cDNA文庫中成功克隆了具有完整編碼區(qū)的Tβ-4基因的全長cDNA序列，并且本實驗室正在以此為基礎(chǔ)進行進一步的表達和功能研究。

[1] Huo Yushu，Huo Hong，Zhang Jie.The contribution of deer velvet antler research to the modern biological medicine [J].Chinese Journal of Integrative Medicine，2014，20(10)：723-728.

[2] Brockes J P，Kumar A.Appendage regeneration in adult vertebrates and implications for regenerative medicine [J].Science，2005，310(5756)：1919-1923.

[3] 陳雪龍.鹿茸的藥理作用及其研究進展 [J].四川畜牧獸醫(yī)，2008，32(1)：29-30.

[4] Kierdorf U，Kierdorf H.Deer antlers-a model of mammalian appendage regeneration：an extensive review [J].Gerontology，2011，57(1)：53-65.

[5] Landete-Castillejos T，Estevez J A，Martínez A，et al.Does chemical composition of antler bone reflect the physiological effort made to grow it? [J].Bone，2007，40(4)：1095-1102.

[6] Pita-Thomas W，F(xiàn)ernández-Martos C，Yunta M，et al.Gene expression of axon growth promoting factors in the deer antler[J].PloS One，2010，5(12)：e15706.

[7] Li Chunyi，Zhao Haiping，Liu Zhen，et al.Deer antler-a novel model for studying organ regeneration in mammals[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2014，56：111-122.

[8] 劉振，趙海平，楊春，等.鹿茸再生及其分子調(diào)節(jié)機理研究進展 [J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40(2)：50-53.

[9] Koutrafouri V，Leondiadis L，Avgoustakis K，et al.Effect of thymosin peptides on the chick chorioallantoic membrane angiogenesis model[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects，2001，1568(1)：60-66.

[10] Lee S H，Zhang W，Choi J J，et al.Overexpression of the thymosin β-10 gene in human ovarian cancer cells disrupts F-actin Stress Fiber and Leads to Apoptosis[J].Oncogene，2001，20(46)：6700-6706.

[11] Goldstein A L，Hannappel E，Kleinman H K.Thymosin β 4：actin-sequestering protein moonlights to repair injured tissues[J].Trends in Molecular Medicine，2005，11(9)：421-429.

[12] Huff T，Müller C S G，Otto A M，et al.β-Thymosins，small acidic peptides with multiple functions[J].The International Journal of Biochemistry & Cell Biology，2001，33(3)：205-220.

[13] Knop J，App C，Hannappel E.Antibodies in research of thymosin β4：investigation of cross-reactivity and influence of fixatives [J].Annals of the New York Academy of Sciences，2012，1270(1)：105-111.

[14] Wang Xiaolei，Yang Guihua，Li Shanshuang，et al.TheEscherichiacoli-derived thymosin β4 concatemer promotes cell proliferation and healing wound in mice[J].BioMed Research International，2013，2013：241721.

[15] Stark C，Taimen P，Tarkia M，et al.Therapeutic potential of thymosin β4 in myocardial infarct and heart failure [J].Annals of the New York Academy of Sciences，2012，1269(1)：117-124.

[16] Yan B，Singla R D，Abdelli L S，et al.Regulation of PTEN/Akt pathway enhances cardiomyogenesis and attenuates adverse left ventricular remodeling following thymosin β4 overexpressing embryonic stem cell transplantation in the infarcted heart[J].PloS One，2013，8(9)：e75580.

[17] Xiong Y，Mahmood A，Meng Y，et al.Neuroprotective and neurorestorative effects of thymosin β4 treatment following experimental traumatic brain injury[J].Annals of the New York Academy of Sciences，2012，1270(1)：51-58.

[18] Morris D C，Zhang Z G，Zhang J，et al.Treatment of neurological injury with thymosin β4[J].Annals of the New York Academy of Sciences，2012，1269(1)：110-116.

[19] Wei M，Duan D，Liu Y，et al.Increased thymosin β4 levels in the serum and SF of knee osteoarthritis patients correlate with disease severity [J].Regulatory Peptides，2013，185：34-36.

[20] Li Xiankui，Zheng Lishu，Peng Fuwang，et al.Recombinant thymosin beta 4 can promote full-thickness cutaneous wound healing [J].Protein Expression and Purification，2007，56(2)：229-236.

[21] Philp D，Badamchian M，Scheremeta B，et al.Thymosin β4 and a synthetic peptide containing its actin‐binding domain promote dermal wound repair in db/db diabetic mice and in aged mice[J].Wound Repair and Regeneration，2003，11(1)：19-24.

[22] Müller C S，Huff T，Hannappel E.Reduction of thymosin β4 and actin in HL60 cells during apoptosis is preceded by a decrease in their mRNAs [J].Molecular and Cellular Biochemistry，2003，250(1/2)：179-188.

[23] Can B，Karagoz F，Yildiz L，et al.Thymosin β4 is a novel potential prognostic marker in gastrointestinal stromal tumors [J].Apmis，2012，120(9)：689-698.

[24] Xiao Yongtao，Chen Yingwei，Wen Jie，et al.Thymosin β4：a potential molecular target for tumor therapy[J].Critical ReviewsTMin Eukaryotic Gene Expression，2012，22(2)：109-116.

[25] 李曄，包旭，陳曦.小鼠毛囊再生與胸腺素β4的促進效應(yīng)[J].中國組織工程研究，2014，18(11)：1687-1693.

[26] Li C，Suttie J M.Tissue collection methods for antler research[J].European Journal of Morphology，2003，41(1)：23-30.

Velvet antler； Thymosin β4 (Tβ-4)； cDNA library； Isolation； Bioinformatics

胸腺素β4(Thymosin β4，Tβ-4)是真核生物細胞中的一種具有多重生物學(xué)功能的肌動蛋白螯合分子。本研究首次從梅花鹿鹿茸尖端組織全長cDNA文庫中成功克隆了Tβ-4基因的全長cDNA序列，并結(jié)合生物信息學(xué)方法對該基因的氨基酸序列進行了分析。結(jié)果表明，梅花鹿Tβ-4基因cDNA全長為770 bp，編碼44個氨基酸，相對分子質(zhì)量為5 052.65 u，理論等電點為5.02，其一級結(jié)構(gòu)中賴氨酸和谷氨酸殘基所占比例最高，二級結(jié)構(gòu)元件主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Tβ-4蛋白氨基酸序列含有“Thymosin family”結(jié)構(gòu)域，沒有N端信號肽，沒有跨膜區(qū)。同源序列分析表明，梅花鹿與白頰長臂猿、人、牛的親緣關(guān)系較近，氨基酸同源性高于85%。Tβ-4在鹿茸尖端組織全長cDNA文庫中高豐度表達，提示它可能在鹿茸生長發(fā)育中起到重要調(diào)節(jié)作用。

Isolation and Bioinformatics Analysis of Tβ-4 Full Length cDNA in Sika Deer (Cervus nippon hortulorum)Velvet Tip Tissue

Huang Hao Hao Li*Xiao Xianghong Liu ChangLi Heping Chai Longhui Zhang Jingyu

(Northeast Forestry University，Harbin，150040，China)

Thymosin β4 (Tβ-4)is an actin chelating molecule with multiple biological functions in eukaryotic cells.We isolated the full-length cDNA of the Tβ-4 gene from velvet tip tissue full-length cDNA library of Sika Deer，and analyzed the bioinformatics of the amino acid sequence.The results showed the full-length cDNA of the Tβ-4 gene was 770 bp，encoding a peptide of 44 amino acids.The relative molecular weight of the peptide was 5 052.65u，isoelectric point was 5.02，and Lys and Glu occupied the highest proportion in primary structure.α-helix and random coil-based were dominant in the secondary structure.Structure analysis showed that the Tβ-4 protein contained a “Thymosin family” structural domain without and N-terminal signal peptide and transmembrane domain.Homologous sequence analysis indicated that sika deer was close toBosmutus，HomosapiensandNomascusleucogenys(the amino acids homology was higher than 85%).Tβ-4 gene has a higher expression level in velvet tip tissue full-length cDNA library，indicating that this gene may play a regulatory role in growth development of velvet antler.

國家自然科學(xué)基金資助項目(31271324)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助(2572014EA05-03; 2572015CA18)

黃皓，女，23歲，碩士研究生；主要從事動物生理學(xué)研究。E-mail：694180823@qq.com

*通訊作者：郝麗，E-mail：haoli958@sina.com

2016-11-16

S825；S813

A

修回日期：2016-12-16

發(fā)表日期：2017-05-10

2310-1490(2017)02-162-06