東莞地區(qū)臨床分離耐碳青霉烯的鮑曼不動桿菌的耐藥特點及其機制研究

郭主聲，林偲思，朱學(xué)海，張麗，張麗華，胡繼華，周謀清，閻紅霞，郭少卿

（中山大學(xué)附屬東莞東華醫(yī)院 1.檢驗科，2.感染科，3.呼吸科，4.急診科，廣東 東莞 523110）

東莞地區(qū)臨床分離耐碳青霉烯的鮑曼不動桿菌的耐藥特點及其機制研究

郭主聲1，林偲思1，朱學(xué)海1，張麗1，張麗華1，胡繼華2，周謀清2，閻紅霞3，郭少卿4

（中山大學(xué)附屬東莞東華醫(yī)院 1.檢驗科，2.感染科，3.呼吸科，4.急診科，廣東 東莞 523110）

目的回顧分析東莞東華醫(yī)院2011～2013年臨床分離的鮑曼不動桿菌的臨床分布及耐藥特點，為臨床合理用藥和防止醫(yī)源性感染提供依據(jù)。方法選取2011～2013年東華醫(yī)院臨床分離的非重復(fù)鮑曼不動桿菌菌株30株，采用瓊脂稀釋法檢測該菌對11種抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC），采用乙二胺四乙酸紙片協(xié)同實驗檢測待檢菌株的金屬酶表型，采用三維實驗檢測待檢菌株的AmpC酶表型和改良Hodge實驗篩查碳青霉烯酶，聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行OXA-23、OXA-24編碼基因的檢測，應(yīng)用脈沖場凝膠電泳進(jìn)行同源性分析。結(jié)果在監(jiān)測的14種抗菌藥物MIC中，耐藥率＞60%的達(dá)13種，其中只有頭孢哌酮舒巴坦耐藥率＜50%，共篩選出耐碳青霉烯酶的鮑曼不動桿菌30株，其中金屬酶表型和基因檢測均為陰性，AmpC酶陽性者21株，改良Hodge實驗陽性24株，其中26株OXA-23基因擴增陽性，未檢出OXA-24基因，可見OXA-23基因為主要的流行克隆株。結(jié)論東莞地區(qū)臨床分離的鮑曼不動桿菌多重耐藥十分嚴(yán)重，產(chǎn)OXA-23碳青霉烯酶是鮑曼不動桿菌對碳青霉烯酶類藥物耐藥的重要機制，且碳青霉烯酶耐藥菌株存在克隆流行。

鮑曼不動桿菌；耐碳青霉烯酶；藥敏實驗；耐藥基因

鮑曼不動桿菌實質(zhì)上就是臨床上經(jīng)常出現(xiàn)的一種革蘭陰性桿菌，尤其是在重癥監(jiān)護(hù)室（intensive care unit，ICU）中，其分布范圍十分廣泛，主要存在于機體的泌尿生殖道、呼吸道及皮膚，在土壤、水中也有分布，傳播途徑主要為接觸，是導(dǎo)致院內(nèi)感染狀況發(fā)生的主要病原菌。鮑曼不動桿菌主要由感染?？频哪X脊液、呼吸道分泌物、膿液、尿液及血液等一系列標(biāo)本中分離出現(xiàn)，極易誘發(fā)腦膜炎、敗血癥、尿路感染及獲得性肺炎等感染狀況?，F(xiàn)階段因為臨床上對于抗菌藥物的使用不合理、不規(guī)范，導(dǎo)致鮑曼不動桿菌對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類及喹諾酮類等一系列抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性越來越強，造成多重耐藥的鮑曼不動桿菌的數(shù)量越來越多，尤其是碳青霉烯類藥物的耐藥性，這在很大程度上增大臨床治療難度[1-4]。本文主要通過對30株多重耐藥的鮑曼不動桿菌，特別是耐碳青霉烯的鮑曼不動桿菌予以檢測，為臨床合理用藥提供有價值的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株來源

選取2011年1月-2013年12月本院臨床分離的30株耐耐碳青霉烯的鮑曼不動桿菌，其中20株痰標(biāo)本，3株傷口分泌物，3株引流液，2株咽拭子，2株尿標(biāo)本，均為不重復(fù)標(biāo)本。

1.2 試劑與儀器

選取M-H瓊脂平板和乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）紙片（廣州迪景微生物試劑公司），蛋白酶K（德國Merck公司），Sea Kemgold Agarose（美國Cambrex公司），XbaⅠ酶（美國Promega公司），比濁儀（美國Dade Behring公司），GEL Doc EQ凝膠成像分析系統(tǒng)、Chef Mapper脈沖場凝膠電泳儀購自美國Bio-Rad公司，VITEK-2-COMPACT系統(tǒng)與配套GN鑒定卡（廣州華鑫行試劑有限公司）。低溫高速離心機（美國Sigma公司，2-16PK）；d3H2O純水儀器（美國Bio-Rad公司,儀器型號：CaSCada Bio．water．pallcorporation），聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀為Biometra PCR儀（美國Bio-Rad公司），電泳儀為BG·Power600（北京百晶生物技術(shù)有限公司），PCR反應(yīng)體系、引物及分子標(biāo)準(zhǔn)（廣州東盛生物科技有限公司），置入-70℃冰箱冷凍保存（美國賽默飛公司），-20℃冰箱冷凍保存（青島海爾公司）。

1.3 鑒定菌株

根據(jù)第3版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[5]對細(xì)菌予以分離、培養(yǎng)及鑒定等相關(guān)操作，先分離出要鑒定的純菌后，根據(jù)菌落生長形態(tài)、革蘭染色鏡下形態(tài)及相應(yīng)的生化實驗鑒定到種[6]。

1.4 藥敏實驗

采用采用瓊脂稀釋法，按美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會推薦的瓊脂稀釋法進(jìn)行，用手工接種法將鮑曼不動桿菌菌液接種于預(yù)先制備好一系列濃度梯度的含藥瓊脂表面，細(xì)菌接種量為1×104菌落形成單位（colony forming units，CFU）/點，37℃培養(yǎng)18 h，無菌落形成的最低抗菌藥物濃度為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），藥敏實驗所使用抗菌藥物為本院臨床的常用抗菌藥物。

1.5 質(zhì)控菌株

實驗質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株主要包括：金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）及大腸埃希菌（ATCC25922），所有質(zhì)控菌株來源于國家衛(wèi)計委臨床檢驗中心，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）肺炎克雷伯ATCC 700603和產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌為北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科謝秀麗老師贈送。

1.6 Am pC酶檢測

根據(jù)鄭力等[7]在相關(guān)研究報道中提出的三維實驗方法，①制備酶粗提物：選取血平板上已經(jīng)培養(yǎng)18～24 h的3～5個菌株，在營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行接種操作，溫度控制在35℃左右，培養(yǎng)時間6 h，于規(guī)定時間內(nèi)混合均勻，2 600 r/min離心30 min，棄上清液，將其沉淀于35℃和80℃，反復(fù)凍融8次左右，凍融時間≥2 h/次，凍融完成后加入0.01 mol磷酸鹽緩沖液，4℃、12000r/min離心20min，酶提取物即上清液；②三維實驗：欣二（Mueller-Hinton，MH）瓊脂平板上涂抹大腸埃希菌，其濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?，然后在平板中心黏貼頭孢西丁藥敏紙片，在距離頭孢西丁藥敏紙片邊緣5 mm位置，使用無菌刀片切1個小槽，將50μl酶提取物置于小槽中，進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在35℃左右，于第2天清晨觀察培養(yǎng)結(jié)果。若是抑菌圈處于不完整狀態(tài)，抑菌圈與頭孢西丁紙片端交接處發(fā)生趨向于平皿中心擴大狀況，即判定為AmpC酶陽性，若是抑菌圈處于完整狀態(tài)，即可判定為AmpC酶陰性。

1.7 ED TA紙片實驗

根據(jù)紙片擴散法，按照藥物敏感性實驗流程，對細(xì)菌進(jìn)行配置，將其濃度制備為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬鶆蛲坎加贛H瓊脂平板上，張貼2張亞胺培南藥敏紙片，且2張亞胺培南藥敏紙片中心距離≥25 mm。同時將5μl 500 mmol/L EDTA溶液滴入1張亞胺培南藥敏紙片上，培養(yǎng)溫度控制在35℃左右，培養(yǎng)20 h后進(jìn)行觀察。金屬酶陽性的判定指標(biāo)為單純亞胺培南紙片與亞胺培南+EDTA紙片的抑菌圈直徑差值≥7 mm。

1.8 檢測產(chǎn)滅活酶基因

1.8.1 制備模版 從MH平板中提取細(xì)菌，數(shù)量控制在3、4個，于300μl 0.85%生理鹽水制備細(xì)菌懸液，混合均勻。12 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入無菌雙蒸水300μl，混合均勻，置于100℃左右水中，15 min后15 000 r/min離心2 min，離心處理后DNA模板即為上清液。

1.8.2 擴增PCR 總反應(yīng)體系為50μl，其中0.36u/L DH2O，0.25μl Taq酶，1μl正向引物，1μl反向引物，3μl DNA模板，4μl dNTPs mixture，5μl 10×緩沖液。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸7 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳處理PCR產(chǎn)物，觀察特異性擴增條帶。采用PCR檢測OXA-23型酶的編碼基因。見表1。

1.9 脈沖場凝膠電泳同源性

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基接種單個菌落，維持溫度在35℃左右，振蕩、孵育過夜。1ml肉湯加入1.5 ml離心管（eppendorf tubes，EP），離心收集細(xì)菌沉淀。加入500μl SE buffer，充分混合均勻，12 000 r/min離心1 min，棄上清液。加入300μl SE buffer，重新懸浮沉淀。制備2%低熔點瓊脂糖，將0.2g低熔點瓊脂糖加入10 ml SE buffer，用微波爐溶化處理，保持溫度在60℃～70℃，避免出現(xiàn)凝固。混充分合2%低熔點瓊脂糖與菌懸液，置于模具中制作成膠塊，4℃固化30 min左右。裂解液的制備：500μg/ml蛋白酶K、pH 9.5、0.5 mol/L EDTA及1%N-十二烷基肌氨酸鈉。破裂過程中從-20℃條件下取出20 mg/ml蛋白酶K母液，配置所需濃度。將1 ml裂解液置于EP管中并推入固化膠塊，56℃孵育過夜；次日更換裂解液，保持裂解液的新鮮，56℃再次孵育過夜。將裂解液吸出，防止膠塊碎裂。加入1 ml TE buffer，上下顛倒，4℃條件下放置30 min，重復(fù)3次后洗滌。4℃、TE緩沖液中存儲膠塊，存儲時間可≥6個月，每間隔1個月需要更換TE緩沖液。酶切：將膠塊切成長條，長度在1 mm左右，每一個標(biāo)本切2條。置入100μl 1×酶切緩沖液，4℃條件下平衡1h左右。將酶切緩沖液吸出，酶切處理，100μl酶切體系，其中包含30 u ApaⅠ，10μl 10×酶切緩沖液，離子雙蒸水補足體積，35℃消化過夜。酶切液吸出后，加入2 00μl TE buffer，混合均勻，4℃條件下放置30 min左右，重復(fù)3次后洗滌。加入100μl 0.5×TBE緩沖液，4℃條件下放置30 min。80 ml 0.5×TBE緩沖液中置入0.8g電泳用瓊脂糖，混合均勻，制備1%脈沖場凝膠電泳。配置5×TBE母液：20 ml 0.5 mol/L EDTA，27.5g硼，54g Tris堿，pH 8.0，定容至1 L。取出經(jīng)酶切處理后的膠條，與加樣孔的前壁上樣緊靠，1%電泳瓊脂糖液封閉每個加樣孔。6 v/cm、14℃、線性變化時間控制在5～8 s，電泳20 h后溴化乙錠染色，紫外凝膠成像儀進(jìn)行拍攝。結(jié)果評價：將圖譜完全一致的作為同一型，相差1個條帶的作為同一型的不同亞型，相差2或3個條帶的判定為親緣關(guān)系十分密切，相差4～6個條帶的判定為可以有一定聯(lián)系，相差≥7個條帶的判定為無任何親緣關(guān)系，同時隨機選取字母分型，按照A、B、C、D的順序。

表1 靶基因PC R擴增引物序列

2 結(jié)果

2.1 鮑曼不動桿菌對常用抗生素的藥敏結(jié)果

本院分離的21株產(chǎn)AmpC酶、24株產(chǎn)碳青霉烯酶、24株產(chǎn)AmpC酶和碳青霉烯酶的鮑曼不動桿菌對14種常用抗生素的藥敏結(jié)果見表2。

表2 鮑曼不動桿菌對14種常用抗生素的藥敏結(jié)果 %

2.2 產(chǎn)酶表型和基因表型檢測結(jié)果

所有菌株EDTA為陰性，Hodge實驗陽性菌株為24株，三維實驗陽性菌株為21株，26株菌株的OXA-23陽性，所有菌株OXA-24為陰性。見表3和圖1、2。

2.3 PFG E結(jié)果

1～3、6、7、9、11～13、15～17、19～21為同一克隆株，4、5、10、14、18與上述菌株僅差1個條帶，為同一克隆株的不同亞型。見圖3。

表3 30株鮑曼不動桿菌產(chǎn)酶表型和基因表型檢測結(jié)果

圖1 H odge實驗和改良三維實驗結(jié)果

圖2 O XA-23 PC R電泳圖

圖3 鮑曼不動桿菌PFG E結(jié)果

3 討論

鮑曼不動桿菌是醫(yī)院內(nèi)不動桿菌感染爆發(fā)流行最主要的菌株。據(jù)文獻(xiàn)報道，由于臨床對三代頭孢菌素的廣泛使用或甚至濫用，導(dǎo)致鮑曼不動桿菌在醫(yī)院病原菌分離所占比例呈上升趨勢，特別是重癥監(jiān)護(hù)病房、急診病區(qū)及呼吸內(nèi)科病房[7-9]。而且從臨床分離的藥敏資料來看，鮑曼不動桿菌對臨床常用的抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥。而鮑曼不動桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥機制有以下幾個方面：藥物靶位修飾和藥物外排泵作用、外膜通透性降低、產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶等。其中最主要的是產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶[10]，主要有AmpC酶、廣譜β-內(nèi)酰胺酶、ESBLs、碳青霉烯酶及金屬β-內(nèi)酰胺酶。

Ampc酶實質(zhì)上就是一種β-內(nèi)酰胺酶，根據(jù)其產(chǎn)生方式，可以將其劃分為：持續(xù)低產(chǎn)酶、持續(xù)高產(chǎn)酶及誘導(dǎo)高產(chǎn)酶[11]。前兩者與β-內(nèi)酰胺類抗生素的存在有關(guān)。近年來研究表明，隨著β-內(nèi)酰胺類抗生素，尤其是頭孢菌素的廣泛應(yīng)用，AmpC酶不僅可由染色體上的基因編碼，而且可由質(zhì)粒介導(dǎo)[12]。

本研究收集的30株鮑曼不動桿菌的B內(nèi)酰胺酶實驗、改良三維實驗法及Hodge實驗結(jié)果中，頭孢噻吩紙片法檢測到產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶菌株30株，陽性率為100.0%；改良三維實驗法檢測到AmpC酶陽性株21株，陽性率為70.0%；Hodge實驗檢測到碳青霉烯酶陽性株24株，陽性率為80.0%。同時產(chǎn)AmpC酶和碳青霉烯酶陽性株24株，陽性率為70.0%。

碳青霉烯酶實質(zhì)上就是一種可以水解亞胺培南的β-內(nèi)酰胺酶，包含Ambler分子，主要分為A、B、D 3類酶；其中，B類酶是一種金屬酶，可由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)。其碳青霉烯酶主要有金屬酶和OXA類酶。碳青霉烯類抗菌藥物是目前臨床治療革蘭陰性菌感染最為有效的抗菌藥物之一。然而隨著其在臨床治療中廣泛應(yīng)用，對碳青霉烯類抗菌藥物呈耐藥的菌株也逐漸被發(fā)現(xiàn)和證實，臨床應(yīng)用前景面臨著巨大的挑戰(zhàn)。不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物有關(guān)的耐藥機制為：外膜孔蛋白缺失、藥物主動外排表達(dá)、青霉素結(jié)合蛋白改變、產(chǎn)碳青霉烯酶等，其中產(chǎn)碳青霉烯酶的關(guān)注度最高[13-16]。進(jìn)一步了解與掌握耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌在耐藥方面的機制，其研究更加趨向于選用分子生物方法，并在此基礎(chǔ)上尋找更加有效的方式。

本研究對30株耐碳青霉烯酶的鮑曼不動桿菌進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測出26株OXA-23陽性菌株，但未檢測出OXA-24菌株，說明OXA-23是東莞地區(qū)碳青霉烯酶抗生素耐藥鮑曼不動桿菌主要的碳青霉烯酶基因型。通過鮑曼不動桿菌PFGE檢測結(jié)果顯示，東莞地區(qū)碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌絕大多數(shù)為同一克隆株。同一克隆株可以在同一醫(yī)院病房內(nèi)或不同病房內(nèi)，甚至是不同醫(yī)院間造成克隆傳播。因此微生物室一旦發(fā)現(xiàn)高耐菌株，應(yīng)立即與院感部門和臨床科室溝通聯(lián)系，落實做好各項預(yù)防措施，防止耐藥克隆株的院內(nèi)播散流行。

本研究藥敏結(jié)果顯示，產(chǎn)AmpC酶和產(chǎn)碳青霉烯酶是本院鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物耐藥的主要原因，呈多重耐藥性。鮑曼不動桿菌的特點主要是使其具有多重耐藥基因，而且夠?qū)⒃摶蜣D(zhuǎn)移至其他細(xì)菌上，與其他具有耐藥基因的細(xì)菌相結(jié)合，因此對于一系列抗生素具有一定耐藥性，在很大程度上增加臨床抗感染治療難度，所以應(yīng)當(dāng)充分重視產(chǎn)酶菌株的檢出。在對抗生素進(jìn)行選取的時候，應(yīng)當(dāng)充分考慮抗生素具備的細(xì)菌耐藥突變適應(yīng)能力和抗菌活性，根據(jù)藥敏結(jié)果，選取抗菌活性強的抗生素藥物，避免高耐藥株細(xì)菌出現(xiàn)。同時對于一些反復(fù)運用廣譜抗生素、反復(fù)感染、病程長，以及基礎(chǔ)疾病嚴(yán)重的產(chǎn)酶菌株感染患者，應(yīng)當(dāng)給予精心護(hù)理，避免產(chǎn)酶菌株大量傳播。除此之外，應(yīng)提高醫(yī)務(wù)人員對院內(nèi)下呼吸道感染的認(rèn)識，加強醫(yī)院環(huán)境消毒，防止醫(yī)源性感染。

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（童穎丹 編輯）

Study ongenotyping of beta-lactamase in Carbapenem-resistant Acinetobacter baumanniiseparated in Dongguan area

Zhu-shengguo1,Si-si Lin1,Xue-hai Zhu1,Li Zhang1,Li-hua Zhang1, Ji-hua Hu2,Mou-qing Zhou2,Hong-xia Yan3,Shao-qingguo4
(1.Clinical Laboratory;2.Department of Infectious Diseases;3.Department of Respiratory Medicine;4.Emergency Department,Tungwah Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University, Dongguan,Guangdong 523110,China)

ObjectiveTo analyze clinical distribution and drug resistance ofAcinetobacter baumannii isolated in Tungwah Hospital,to learn β-lactamasegene ofAcinetobacter baumanniiresistant to Carbapenem so as to provide the basis for clinical use of drugs and prevention of nosocomial infections.MethodsThirty strains of non-repetitiveAcinetobacter baumanniiresistant to Carbapenem which were isolated in Tungwah Hospital from January 2011 to December 2013 were collected.Agar dilution method was used to detect the minimal inhibitory concentrations (MIC)of 11 kinds of antimicrobial agents.Pidemiological analysis was conducted.Carbapenemase was screened by modified Hodge test.The metalloenzyme phenotype and AmpC enzyme phenotype of the tested strains were detected by EDTA-disk synergy test and three-dimensional test respectively.PCR amplification ofOXA-23,OXA-24and pulsed fieldgel electrophoresis (PFGE)homology analysis were used to analyze the moleculer type andgenetic relationship between the resistant strains.MethodsIn the 14 antimicrobial agents with monitored MIC,the resistance rate of 13 species was over 60%, only that of SCF was lower than 50%.Totally 30 strains of Carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii were screened out,of which the metalloenzyme phenotype andgene were both negative,21 strains had AmpCenzyme and 24 strains showed positive modified Hodge test;among whichOXA-23gene was amplified in 26 strains whileOXA-24gene was not detected.ConclusionsThe resistance ofAcinetobacter baumanniiisolated in clinic of Dongguan area is very severe.OXA-23gene is the main carbapenemasegene,and Carbapenemresistant strains are prevalent in this area.

Acinetobacter baumannii;resistance to carbapenemase;drug sensitive test;drug resistancegene

R446

A

2016-05-25

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.20.007

1005-8982（2017）20-0034-06