D M T1在人胎盤絨毛膜癌細(xì)胞中表達(dá)的實驗研究*

曹曉曉，李燕琴

（1.陜西省西安市健康教育所，陜西 西安 710004；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西 西安 710061）

D M T1在人胎盤絨毛膜癌細(xì)胞中表達(dá)的實驗研究*

曹曉曉1，李燕琴2

（1.陜西省西安市健康教育所，陜西 西安 710004；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西 西安 710061）

目的進(jìn)一步確定二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1（DMT1）在人胎盤絨毛膜癌細(xì)胞（BeWo）中的表達(dá)定位，以及缺鐵狀態(tài)下mRNA的表達(dá)變化。方法采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察DMT1在BeWo細(xì)胞中的表達(dá)定位，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測DMT1在BeWo細(xì)胞缺鐵狀態(tài)下mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果DMT1在BeWo細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，其彌漫性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上；DMT1+IRE mRNA和DMT1-IRE mRNA的相對表達(dá)量隨缺鐵干預(yù)濃度和時間的增加而上調(diào)。DMT1+IRE mRNA的相對表達(dá)量高于DMT1-IRE mRNA。結(jié)論DMT1大量表達(dá)在BeWo細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，且表達(dá)受機(jī)體不同鐵水平的調(diào)節(jié)，說明其在胎盤鐵轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步探討胎盤鐵轉(zhuǎn)運分子機(jī)制提供實驗基礎(chǔ)。

鐵缺乏；鐵轉(zhuǎn)運；BeWo細(xì)胞；DMT1

胎兒所有鐵來自母體供給，母體通過胎盤向胎兒進(jìn)行單向的、主動的鐵轉(zhuǎn)運。鐵轉(zhuǎn)運過程分為鐵吸收、鐵轉(zhuǎn)運及鐵輸出3個階段。細(xì)胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)運過程即被還原酶還原的Fe2+從內(nèi)吞小體內(nèi)轉(zhuǎn)運入胞漿，以及Fe2+在細(xì)胞內(nèi)儲存利用的過程。二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1（divalent metal transporter 1，DMT1）是一種廣泛表達(dá)的膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白，其在細(xì)胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)運過程中具有重要作用。目前其在胎盤的表達(dá)仍未定義清楚。本實驗通過檢測DMT1在BeWo細(xì)胞中的表達(dá)定位，以及不同缺鐵狀態(tài)下mRNA的表達(dá)變化，來闡明胎盤鐵轉(zhuǎn)運分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材

人胎盤絨毛膜癌BeWo細(xì)胞（武漢大學(xué)細(xì)胞庫），去鐵胺（Desferoxamine，DFO）（美國Sigma公司），DMT1兔多克隆抗體（英國Abcam公司），山羊抗兔二抗試劑盒（美國Zymed公司SP系列），Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、MaximaTMSYBRgreen Realtime PCR Master Mix購自美國Fermentas Life Sciences公司。圖像采集系統(tǒng)Q550CW型（德國Leica公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀ABI Prism 7000 Seqμence Detection System（美國ABI公司）。引物設(shè)計與合成由北京三博遠(yuǎn)志技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色

細(xì)胞在24孔板中爬片，用80%酒精固定和脫水，加0.1～0.3%Triton-100通透細(xì)胞膜，孵育封閉后逐滴加入濃度為1∶50的一抗試劑，過夜浸泡后逐滴加入二抗試劑。孵育、浸泡后用已二酸二丁酯染色。蘇木素復(fù)染后，采用80%、90%和95%及無水酒精逐級脫水，并用二甲苯透明3次。封片采集圖像。

1.3 DFO缺鐵干預(yù)

BeWo細(xì)胞分為基線對照組、48h對照組、48h30μmol/L缺鐵組、48h60μmol/L缺鐵組、72 h對照組、72h30μmol/L缺鐵組、72 h 60μmol/L缺鐵組7組，進(jìn)行不同濃度的DFO缺鐵干預(yù)，并于0、48和72 h后收獲細(xì)胞。

1.4 qRT-PCR

提取總RNA，每組進(jìn)行總RNA純度測定，檢測每組總RNA的OD260/OD280nm吸光度比值（Ratio，R）。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。使用Lifeson Medical Tech Co，Ltd Two-Step qRT-PCR試劑盒構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行熔解曲線和定量結(jié)果分析，所得Ct值進(jìn)行函數(shù)運算得出2-△△Ct值。見表1。

表1 基因引物序列表

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D M T1在BeW o細(xì)胞的表達(dá)定位

BeWo細(xì)胞系為貼壁細(xì)胞，生長周期為1周，呈團(tuán)塊狀聚集生長。細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則的多角形，細(xì)胞核大而圓，呈卵圓形，位于細(xì)胞質(zhì)中央，狀況良好的細(xì)胞質(zhì)呈透明狀。

本實驗分為磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）對照組、1∶100和1∶50抗體濃度組。PBS對照組細(xì)胞核經(jīng)蘇木素染色呈紫紅色，細(xì)胞漿呈透明狀，并無非特異性染色，陰性反應(yīng)。1∶100與1∶50抗體濃度組相比，黃色陽性反應(yīng)物染色較淺，兩組陽性反應(yīng)物染色均勻，在細(xì)胞上呈彌漫著色。從1∶100抗體濃度組可看出DMT1在BeWo細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，大量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，并且推測在細(xì)胞膜上也有表達(dá)。見圖1。

圖1 DMT1蛋白的細(xì)胞表達(dá)定位（×400）

2.2 缺鐵狀態(tài)下BeWo細(xì)胞D MT1mRNA的表達(dá)變化

每組R值在1.8～2.0，總RNA純度較好。48h30μmol/L缺鐵組、48h60μmol/L缺鐵組及72 h 60μmol/L缺鐵組濃度高于其他組。總RNA濃度與各組細(xì)胞生長量及生長時間相關(guān)，整體上說BeWo細(xì)胞生長均勻一致。各組總RNA濃度整體較均勻，根據(jù)樣品濃度計算使用體積。由于SYBRgreen I能與任意雙鏈DNA結(jié)合后非特異地發(fā)出熒光，以及每個產(chǎn)物的解鏈溫度不同，qRT-PCR結(jié)果顯示，每個基因的擴(kuò)增曲線平滑，以及熔解曲線為單峰型，說明胎盤DMT1基因的反應(yīng)體系中無非特異性擴(kuò)增，沒有引物二聚體產(chǎn)生。見表2。

表2 各組細(xì)胞總R N A的R值和濃度比較 （±s）

表2 各組細(xì)胞總R N A的R值和濃度比較 （±s）

組別濃度/（ng /μ l）基線對照組 1 . 9 3 ± 0 . 1 3 5 4 6 . 0 ± 9 . 3 4 8 h對照組 1 . 9 1 ± 0 . 0 6 5 5 1 . 1 ± 4 . 6 4 8 h 3 0μ m o l / L缺鐵組 1 . 9 3 ± 0 . 0 6 6 3 0 . 3 ± 1 5 . 0 4 8 h 6 0μ m o l / L缺鐵組 1 . 9 4 ± 0 . 4 5 6 9 0 . 0 ± 1 2 . 0 7 2 h對照組 1 . 8 9 ± 0 . 0 5 4 9 7 . 0 ± 6 . 2 7 2 h 3 0μ m o l / L缺鐵組 1 . 8 7 ± 0 . 0 2 6 2 7 . 7 ± 9 . 0 7 2 h 6 0μ m o l / L缺鐵組 1 . 9 5 ± 0 . 0 2 5 2 7 . 8 ± 6 . 0 R值

BeWo細(xì)胞經(jīng)過不同濃度DFO和不同時間的缺鐵干預(yù)后，各組DMT1+IRE mRNA的相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=184.347，P= 0.001）。3個對照組相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.662，P=0.060），說明培養(yǎng)時間不會影響相對表達(dá)量的變化。48 h 3組相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=3.588，P=0.094）。72 h 3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 231.021，P=0.001）；72 h兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，30μmol/L組與對照組相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.703，P=0.001），30μmol/L組相對表達(dá)量是對照組2.03倍；60μmol/L組與對照組相對表達(dá)量比較，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.969，P= 0.001），60μmol/L組相對表達(dá)量是對照組5.05倍；60μmol/L組與30μmol/L組相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.104，P=0.001），60μmol/L組相對表達(dá)量是30μmol/L組的2.49倍。不同時間相同濃度相比，72 h 30μmol/L組與48 h 30μmol/L相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.203，P= 0.001），72 h組相對表達(dá)量是48 h組的1.52倍；72 h 60μmol/L組與48 h 60μmol/L組相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.817，P=0.001），72 h組相對表達(dá)量是48 h組的3.65倍。結(jié)果表明，DFO干預(yù)濃度和時間可以影響DMT1+IRE mRNA的相對表達(dá)量，DFO的干預(yù)濃度越高、時間越長，其DMT1+ IRE mRNA的相對表達(dá)量越高。見表3和圖2。

表3 各組細(xì)胞D MT1+IRE和D MT1-IREmRNA表達(dá)的比較 （±s）

表3 各組細(xì)胞D MT1+IRE和D MT1-IREmRNA表達(dá)的比較 （±s）

組別D M T 1 -I R E m R N A基線對照組 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 2 0 1 . 0 0 0 ± 0 . 0 2 1 4 8 h對照組 1 . 4 3 0 ± 0 . 2 9 8 0 . 7 2 7 ± 0 . 1 5 0 4 8 h 3 0μ m o l / L缺鐵組 1 . 8 1 5 ± 0 . 1 5 4 1 . 5 0 7 ± 0 . 1 5 1 4 8 h 6 0μ m o l / L缺鐵組 1 . 8 8 1 ± 0 . 1 9 0 1 . 3 6 7 ± 0 . 1 2 3 7 2 h對照組 1 . 3 6 0 ± 0 . 1 1 7 0 . 9 1 5 ± 0 . 2 5 0 7 2 h 3 0μ m o l / L缺鐵組 2 . 7 5 8 ± 0 . 0 4 4 2 . 6 7 1 ± 0 . 0 8 4 7 2 h 6 0μ m o l / L缺鐵組 6 . 8 6 7 ± 0 . 5 5 1 3 . 7 0 3 ± 0 . 2 4 4 D M T 1 + I R E m R N A

圖2 各組D M T1+I R E m R N A的表達(dá)比較 （±s）

BeWo細(xì)胞經(jīng)過不同濃度DFO和不同時間的缺鐵干預(yù)后，各組DMT1-IRE mRNA的相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=131.854，P= 0.001）。3個對照組相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.061，P=0.209）。48 h 3組相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 25.759，P=0.001）；48 h兩兩比較經(jīng) LSD-t檢驗，30μmol/L組與對照組相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.490，P=0.011），30μmol/L組相對表達(dá)量是對照組的2.07倍；60μmol/L組與對照組相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.042，P=0.016），60μmol/L組相對表達(dá)量是對照組的 1.88倍；60μmol/L組與30μmol/L組相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.882，P=0.4284）。72 h 3組相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 138.519，P=0.001）；72 h兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，30μmol/L組與對照組相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.154，P=0.002），30μmol/L組相對表達(dá)量是對照組的2.92倍；60μmol/L組與對照組相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.766，P=0.001），60μmol/L組相對表達(dá)量是對照組的4.05倍；60μmol/L組與30μmol/L組相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.890，P=0.008），60μmol/L組相對表達(dá)量是30μmol/L組的1.39倍。不同時間相同濃度比較，72 h 30μmol/L組與48 h 30μmol/L組相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.673，P=0.001），72 h組相對表達(dá)量是48 h組的1.77倍。72 h 60μmol/L組與48 h 60μmol/L組相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.812，P=0.001），72 h組相對表達(dá)量是48 h組的2.71倍。證明DFO的干預(yù)濃度越高和時間越長，其DMT1-IRE mRNA的相對表達(dá)量越高。見表3和圖3、4。

圖3 各組D M T1-I R E m R N A的表達(dá)比較 （±s）

圖4 各組D M T1-I R E和D M T1+I R E m R N A的表達(dá)比較（±s）

3 討論

妊娠期孕婦鐵缺乏和缺鐵性貧血患病率分別為46.44%和19.94%，并隨孕周增加而升高[1]。孕期缺鐵時，母體血液透過胎盤屏障向胎兒血液最大限度地轉(zhuǎn)運鐵，防止胎兒患缺鐵性貧血及貧血導(dǎo)致的相關(guān)疾病[2-4]。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞（syncytiotrophoblast，STB）基底膜與胎兒血循環(huán)緊挨，頂部STB細(xì)胞膜與母體血循環(huán)接觸，在物質(zhì)交換中具非常重要作用，BeWo細(xì)胞在形態(tài)及分泌等特性上與STB細(xì)胞相似，性質(zhì)均一并易于傳代。

胎盤鐵轉(zhuǎn)運包括3個過程：①鐵吸收，即鐵從母體血漿轉(zhuǎn)運入胎盤屏障最外層STB母體面頂端的過程；②鐵細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，即被還原酶還原的Fe2+從內(nèi)吞小體內(nèi)轉(zhuǎn)運入胞漿，以及Fe2+在細(xì)胞內(nèi)的儲存利用的過程；③鐵輸出，即Fe2+穿過STB細(xì)胞的基底膜并轉(zhuǎn)運入胎兒血循環(huán)的過程。DMT1目前是Fe2+從STB細(xì)胞內(nèi)吞小體內(nèi)轉(zhuǎn)入胞漿最好的假說。DMT1基因定位于第12條染色體，含43 999 kb，長4 142 bp，能編碼2種mRNA：+IRE和-IRE。DMT1+IRE mRNA在3'端非翻譯區(qū)有1個鐵調(diào)節(jié)元件IRE（含有30個核苷酸，呈氫環(huán)狀結(jié)構(gòu)），DMT1-IRE則不含有[5]。DMT1蛋白的第4跨膜結(jié)構(gòu)域具有維持DMT1轉(zhuǎn)運Fe2+等金屬離子活性的重要作用。

本實驗觀察到DMT1彌漫性地表達(dá)于BeWo細(xì)胞，陽性反應(yīng)物在BeWo細(xì)胞均勻著色，表明DMT1表達(dá)于BeWo細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，揭示胎盤DMT1在母體向胎兒鐵轉(zhuǎn)運機(jī)制中的作用。DMT1廣泛表達(dá)在哺乳類動物的各個組織，2種亞型具有組織細(xì)胞分布特異性及亞細(xì)胞特異性。有研究表明，DMT1表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)[6-7]；還有研究表明，DMT1表達(dá)在STB細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)和基底膜上[8-9]，在鐵釋放和透過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)中起重要的作用。但BASTIN等[10]研究結(jié)果顯示，其在STB細(xì)胞不間斷、連續(xù)地表達(dá)，并且在基質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)，與本實驗結(jié)果相同。由此推斷，一方面表達(dá)DMT1的部分母體面STB細(xì)胞頂部膜凹陷為內(nèi)吞小體，在內(nèi)吞小體內(nèi)Fe3+由還原酶還原為Fe2+后，F(xiàn)e2+可通過DMT1穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，F(xiàn)e2+在STB細(xì)胞胞漿中主要以鐵蛋白形式貯存，進(jìn)入胞漿后，鐵或以鐵蛋白的形式貯存、或參與生物合成或被轉(zhuǎn)出細(xì)胞；另一方面，受細(xì)胞外鐵濃度的影響，當(dāng)細(xì)胞外鐵吸收增多時，30%左右與Fe2+結(jié)合的DMT1出現(xiàn)內(nèi)化后以囊泡的形式游離在細(xì)胞質(zhì)中，含鐵的囊泡在細(xì)胞質(zhì)中從STB細(xì)胞頂部膜上，向基底膜轉(zhuǎn)運鐵，隨后在基底膜附近Fe2+從囊泡中釋放出去，最后DMT1內(nèi)化的囊泡再重新返回母體面STB細(xì)胞頂部膜，參與細(xì)胞質(zhì)中鐵的轉(zhuǎn)運。

本實驗對BeWo細(xì)胞進(jìn)行DFO干預(yù)使細(xì)胞處于缺鐵狀態(tài)時，DMT1+IRE mRNA相對表達(dá)量升高。DMT1的表達(dá)受多種影響因素調(diào)控，包括酸堿度值、炎癥介質(zhì)、鐵調(diào)素、蛋白激酶C、生長發(fā)育等，主要受機(jī)體不同鐵水平的調(diào)節(jié)。機(jī)體缺鐵時小腸組織DMT1+ IRE mRNA表達(dá)升高[11]，肝臟組織和宮頸癌細(xì)胞等表達(dá)是否受機(jī)體鐵水平調(diào)控研究結(jié)果不一致[12]。本實驗結(jié)果揭示，DMT1+IRE型受鐵反應(yīng)元件——鐵調(diào)控蛋白機(jī)制（iron regulatory element-iron regulatory proteins，IRE/IRPs）的調(diào)節(jié)，屬于轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控，與CORNOCK等[13]動物實驗缺鐵時，DMT1+ IRE mRNA相對表達(dá)量提高結(jié)果一致。由此可推斷當(dāng)BeWo細(xì)胞處于缺鐵狀態(tài)時，IRPs與IRE結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合在一起，從而增強(qiáng)DMT1+IRE mRNA編碼蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，防止翻譯過程中內(nèi)切酶的降解作用，最終增加DMT1蛋白的表達(dá)。目前關(guān)于DMT1-IRE mRNA的研究還很少，一般認(rèn)為其不含有IRE結(jié)構(gòu)，因此不受IRE-IRPs機(jī)制的調(diào)節(jié)。本實驗結(jié)果顯示，DMT1-IRE mRNA的相對表達(dá)量隨DFO干預(yù)的時間和濃度上調(diào)，可能存在未知的調(diào)節(jié)機(jī)制，但是其調(diào)控能力不及IRPs/IRE調(diào)控機(jī)制。

胎盤DMT1除受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控外，還受翻譯水平的調(diào)控，應(yīng)進(jìn)一步采用Western blot檢測蛋白的表達(dá)變化，對胎盤DMT1的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行更為深入的研究。

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（童穎丹 編輯）

Expression of divalent metal transporter 1 in BeWo cells*

Xiao-xiao Cao1,Yan-qin Li2
(1.Xi'an Institute for Health Education,Xi'an,Shaanxi 710004,China;2.Department of Public Health,Medical School of Xi'an Jiaotong University,Xi'an,Shaanxi 710061,China)

ObjectiveTo further determine the positioning and the mRNA expression changes of divalent metal transporter 1 (DMT1)under iron deficiency conditions in human placental choriocarcinoma BeWo cells.MethodsAdopting immunocytochemical technique,the localization of DMT1 in BeWo cells was detected.RNA of the cells was extracted,and detected the changes of DMT1+IRE mRNA and DMT1-IRE mRNA using qRT-PCR.MethodsDMT1 waspositivelyexpressed in BeWocells,and distributed in cytoplasm and membrane.TheexpressionsofDMT1+IRE andDMT1-IRE mRNAsraisedwiththeincreaseofdrug concentration and time of iron deficiency treatment.The relative expression level of DMT1+IRE mRNA was significantly higher than that of DMT1-IRE mRNA.ConclusionsDMT1 is abundantly expressed in the cytoplasm and cell membrane of BeWo cells and regulated by the body's iron levels,suggesting that DMT1 plays an important role during the iron transfer process in the placenta,which provides an experimental basis for the study of molecular mechanism of placental iron transport.

iron deficiency;iron transport;BeWo cell;divalent metal transporter 1

R181.24

A

2016-10-24

國家自然科學(xué)基金（No：30800909）

李燕琴，E-mail：741213252@qq.com；Tel：15353556592

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.20.005

1005-8982（2017）20-0021-05