二甲雙胍對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及其機制研究

梅艷，歐三桃

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

二甲雙胍對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及其機制研究

梅艷，歐三桃

（西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 腎內(nèi)科，四川 瀘州 646000）

目的觀察二甲雙胍對鏈脲佐菌素（STZ）誘導糖尿病腎病大鼠腎臟的影響，分析二甲雙胍的防治功效及其機制。方法選取健康雄性14周齡Wistar大鼠36只，隨機分為3組：正常對照組、糖尿病模型組和二甲雙胍干預組。利用STZ誘導大鼠糖尿病，正常對照組給予生理鹽水，第8周時大鼠糖尿病腎病模型復制成功。采用Western blot檢測各組大鼠腎臟中炎癥細胞因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）]和抗炎癥細胞因子[白介素10（IL-10）]的表達。結(jié)果糖尿病模型組TNF-α、IL-1β及IL-6的表達水平高于正常對照組（P＜0.05），IL-10的表達水平低于正常對照組（P＜0.05）；給予二甲雙胍干預后，上述結(jié)果逆轉(zhuǎn)（P＜0.05）。結(jié)論二甲雙胍可通過抑制腎臟炎癥細胞因子的表達，保護STZ誘導的糖尿病大鼠的腎臟。

二甲雙胍；糖尿?。荒I?。谎装Y細胞因子

糖尿病腎病是糖尿病患者死亡的主要病因之一，其發(fā)病機制十分復雜，可能與代謝紊亂、腎小球血流動力學異常及遺傳易感性有關。最新研究發(fā)現(xiàn)，該病往往伴隨炎癥因子表達水平的增高[1-2]，甚至有學者認為，糖尿病腎病本身就是一種炎癥反應的過程[3-4]。二甲雙胍是雙胍類口服降糖藥物，是目前2型糖尿病一線用藥。據(jù)報道，二甲雙胍可有效降低糖尿病腎病患者的尿白蛋白排泄率，降低血肌酐和尿素氮水平，表現(xiàn)出較為滿意的腎臟保護作用[5-7]。但該種保護作用的機制目前并不清楚。大量研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可抑制多種代謝性疾病相關的炎癥因子[8-10]。因此，筆者提出假說，二甲雙胍通過抑制炎癥因子[腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）及白介素6（interleukin-6，IL-6）]的表達，而實現(xiàn)對糖尿病腎病的保護作用。為驗證該假說，設計本研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物

選取健康雄性Wistar大鼠36只，2月齡，體重220～260g[西南醫(yī)科大學動物中心提供，動物許可證號：SCXK（川）2013-17]，動物飼養(yǎng)室溫23℃，濕度44%，自由攝食飲水，實驗開始前測鼠尾外周血糖均正常，將動物適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.1.1 藥品與試劑 二甲雙胍、鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）購自美國Sigma公司，TNF-α、IL-1β、IL-6及 IL-10一抗和二抗購自美國 Abcam Biotechnology公司。

1.1.2 實驗動物分組 實驗動物分為3組：正常對照組、糖尿病模型組及二甲雙胍干預組，每組12只。單次腹腔注射STZ 65 mg/kg誘導糖尿病模型，各組大鼠均在48 h后空腹采取外周血。血糖≥16.7 mmol的大鼠模型復制成功，被視為糖尿病大鼠模型[11]。

1.2 方法

1.2.1 模型的復制 模型復制成功1周后，二甲雙胍干預組大鼠灌胃二甲雙胍20 mg/（kg·d），上午10∶00給藥，1次/d，連續(xù)灌胃6周，糖尿病模型組和正常對照組給予等劑量的生理鹽水NaCl灌胃，直至取材。

1.2.2 實驗動物組織標本的收集及檢測 在8周末時，使用代謝籠收集正常對照組、糖尿病模型組及二甲雙胍干預組大鼠12 h尿液，混勻后取6 ml，將其置于溫度＜40℃的冰箱保存。然后，對糖化血紅蛋白（haemoglobin A1C，HbA1c）、尿白蛋白（Albumin，ALB）、細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、單核細胞趨化蛋白-1及視黃醇結(jié)合蛋白（retinol binding protein，RBP）進行檢測，并對各組實驗大鼠的排泄率予以合理計算；同時經(jīng)大鼠股動脈取血2ml，予以肝素抗凝血，對血紅蛋白（Haemoglobin，Hb）水平進行檢測。將實驗大鼠麻醉后，取出兩側(cè)腎臟，在4℃、NaCl中洗凈，剝?nèi)ツI包膜，4℃、NaCl溶液沖洗腎臟6次。稱其左腎重量，計算腎臟肥大指數(shù)，腎臟肥大指數(shù)=左腎重/體重[12]。用德國羅氏血糖儀進行血糖檢測，Hb和尿ALB采用微柱層析法進行檢測。

1.2.3 動物處理分析 將10%水合氯醛注射于腹腔內(nèi)，麻醉完成后通過頸椎脫臼的方式使大鼠死亡，將其腎臟取出，于-80℃冷凍保存。制備蛋白樣品、RNA：①對60～100g大鼠腎臟組織予以冷凍處理，同時加入1 ml Trizol，根據(jù)說明書提取總RNA，將RNA的A260/A280控制在1.8～2.0；②取腎臟組織約200 mg，在2 ml含蛋白酶抑制劑磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）中勻漿組織，離心15 min左右；③取上清液作為總蛋白樣本。

1.2.4 Western blot檢測 實驗通過Western blot檢測對腎臟中炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及抗炎癥細胞因子IL-10表達量進行比較。①4℃裂解分離組織，勻漿液離心，提取蛋白，離心總蛋白，超聲波裂解，提取破解液中的生物化蛋白；②組織勻漿后，提取蛋白變性成分，用聚丙烯酰胺凝膠對蛋白樣品電泳2 h左右，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上；③將膜置于3%牛血清蛋白溶液中孵育；④加炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及抗炎癥細胞因子IL-10一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，洗滌液洗一抗；⑤加二抗（1∶1 000），室溫孵40 min，洗滌液洗二抗，發(fā)光。選取NIH Image J和Imagine軟件分析圖像并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血糖、H bA1c比較

3組大鼠血糖、HbA1c比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩兩比較采用SNK-q檢驗，糖尿病模型組與正常對照組的血糖、HbA1c比較，差異有統(tǒng)計學意義（q=18.256和20.284，P=0.004和0.000），糖尿病模型組的血糖、HbA1c高于正常對照組；二甲雙胍干預組與糖尿病模型組的血糖、HbA1c比較，差異有統(tǒng)計學意義（q=11.933和30.203，P= 0.009和0.000），二甲雙胍干預組的血糖、HbA1c低于糖尿病模型組。見表1。

表1 3組大鼠血糖、H bA1c水平比較 （±s）

表1 3組大鼠血糖、H bA1c水平比較 （±s）

組別HbA1c/%正常對照組（n=12） 5.86±0.55 5.34±0.20糖尿病模型組（n=10） 31.45±2.09 9.18±1.43二甲雙胍干預組（n=11） 18.70±2.40 8.57±1,34 F值 36.924 41.792 P值 0.000 0.000血糖/（mmol/L）

2.2 尿生化、腎臟肥大指數(shù)比較

3組大鼠的ALB、RBP及腎臟肥大指數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩兩比較采用SNK-q檢驗，糖尿病模型組與正常對照組的ALB、RBP及腎臟肥大指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（q=23.940、20.810和49.117，均P=0.000），糖尿病模型組的ALB、RBP及腎臟肥大指數(shù)高于正常對照組；二甲雙胍干預組與糖尿病模型組的ALB、RBP及腎臟肥大指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（q=19.051、23.305和36.721，均P=0.000），二甲雙胍干預組的ALB、RBP及腎臟肥大指數(shù)低于糖尿病模型組。見表2。

2.3 腎臟病理學改變

二甲雙胍干預治療6周時，正常對照組的基底膜處于同一狀態(tài)，未出現(xiàn)顯著增厚，也未出現(xiàn)足突細胞融合；糖尿病模型組出現(xiàn)毛細血管基底膜增厚，結(jié)構(gòu)模糊不清，發(fā)生足突破壞、融合及消失，系膜基質(zhì)增多，且出現(xiàn)腫脹；二甲雙胍干預組出現(xiàn)少量足突融合，系膜區(qū)細胞出現(xiàn)輕度增生，胞漿腫脹變性。見圖1。

表2 3組大鼠尿生化、腎臟肥大指數(shù)的比較 （±s）

表2 3組大鼠尿生化、腎臟肥大指數(shù)的比較 （±s）

組別腎臟肥大指數(shù)正常對照組（n=12） 2.45±0.39 0.043±0.004 3.43±0.67糖尿病模型組（n=10） 24.98±2.03 0.208±0.017 6.67±0.45二甲雙胍干預組（n=11） 9.87±0.45 0.089±0.02 5.67±0.65 F值 36.104 19.174 28.135 P值 0.000 0.000 0.000ALB/（μg/min）RBP/（μg/min）

2.4 各組大鼠腎臟中TNF-α、IL-1β、I L-6及I L-10表達水平比較

3組大鼠腎臟中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩兩比較采用SNK-q檢驗，糖尿病模型組與正常對照組TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（q=15.194、28.382、19.100和9.287，P=0.002、0.000、0.000和0.007），糖尿病模型組的TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平高于正常對照組，而IL-10的表達水平低于正常對照組；二甲雙胍干預組與糖尿病模型組TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（q= 17.828、23.092、28.124和 12.160，P=0.001、0.000、0.000和0.003），二甲雙胍干預組的TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平低于糖尿病模型組，而IL-10的表達水平較糖尿病模型組升高。見圖2、3。

圖1 3組大鼠腎臟病理學改變 （電鏡×1 000）

圖2 各組大鼠腎臟炎癥因子TNF-α、IL-1β及I L-6的表達 （±s）

圖3 各組大鼠腎臟抗炎因子I L-10的表達 （±s）

3 討論

高血糖可引起蛋白質(zhì)、脂類發(fā)生生理和生化特性的改變，最終形成糖基化終末產(chǎn)物[13]，其可誘導單核趨化蛋白轉(zhuǎn)化生長因子β1、結(jié)締組織生長因子及血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生，促使腎小球硬化[14-15]；并且可促使血管ICAM-1與腎小管上皮細胞表達增多，導致白細胞從小管周圍毛細血管內(nèi)皮細胞遷移至腎臟間質(zhì)，造成腎臟肥大，腎功能受損[16-17]。

二甲雙胍作為一種經(jīng)典降糖藥，可有效改善糖尿病腎病患者的腎功能，這可能涉及多種機制。首先，該藥可通過多種機制降低血糖，減少糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生[18]；二甲雙胍可減少谷胱甘肽過氧化物酶的表達，從而降低腎臟組織內(nèi)的氧化應激[19]；另外該藥可降低血小板聚集和黏附，改善腎臟血管反應性及微循環(huán)[20]。但目前關于二甲雙胍是否通過抗炎作用來實現(xiàn)對腎臟的保護作用尚少見報道。TNF-α、IL-1β及IL-6是臨床上較為常用的炎癥因子指標，常用來反應機體炎癥反應的強弱；而IL-10為應用較為成熟的抗炎因子指標，用來反映機體的抗炎能力。因此本研究采用TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10來反映大鼠腎臟的炎癥-抗炎反應狀態(tài)。

本實驗模型復制成功，并且發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎臟組織炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6增加，抗炎癥細胞因子IL-10減少。給予二甲雙胍治療后，血糖下降，腎臟肥大改善，腎臟炎癥細胞因子與抗炎癥細胞因子失平衡也得到改善。因此，筆者推測二甲雙胍改善糖尿病腎病患者的腎功能是通過對腎臟的炎癥細胞因子的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)。未來筆者將進一步開展相關實驗，一方面驗證抗炎治療是否對糖尿病腎病有直接的腎臟保護作用，另一方面將從細胞、基因水平進一步探究相關機制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對糖尿病腎病大鼠的腎臟具有保護作用，其機制可能與抑制糖尿病大鼠腎臟炎癥細胞因子表達有關。

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（童穎丹 編輯）

Protective effect of Metformin on Streptozotocin-induced nephropathy in diabetic rats

Yan Mei,San-tao Ou
(Department of Nephrology,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou,Sichuan 646000,China)

Objective To observe the effectofMetformin on diabetic nephropathy induced by Streptozotocin in rats,and to explore its preventive and therapeutic effect on diabetic nephropathy.MethodsThirty-six healthy male 14-week-old Wistar rats were randomly divided into threegroups,i.e.normal controlgroup,diabeticgroup and Metformin interventiongroup.Streptozotocin was used to induce diabetic rat model. TNF-α,IL-1β,IL-6 and anti-inflammatory cytokine IL-10 in the renal tissues were detected by Western blot.MethodsThe levels of TNF-α,IL-6 and IL-1β in the renal tissues of the diabetic rats were significantly higher than those in the normal controls,while the IL-10 level was significantly lower than that in the controlgroup (P＜0.05).After treatment with Metformin,the levels of TNF-α,IL-6 and IL-1β in the renal tissues decreased while the IL-10 level increased in the diabetic rats (P＜0.05).ConclusionsMetformin can ameliorate diabetic nephropathy induced by Streptozotocin in rats by inhibiting the expression of inflammatory cytokines.

Metformin;diabetes;nephropathy;inflammatory cytokine

R587.1

A

2017-01-10

歐三桃，E-mail：422216756@qq.com

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.20.001

1005-8982（2017）20-0001-05