基于磁分選技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)的肺癌A549細(xì)胞的分離檢測(cè)

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(上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234)

基于磁分選技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)的肺癌A549細(xì)胞的分離檢測(cè)

周朝輝, 付聰穎,賈能勤*

(上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海200234)

采用磁分選技術(shù)及間接免疫熒光技術(shù)分離檢測(cè)肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs).將表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抗體連接到四氧化三鐵(Fe3O4)磁珠表面構(gòu)建免疫磁珠(MNPs-Anti-EGFR),通過(guò)EGFR抗體和肺癌A549細(xì)胞的表面抗原的特異性結(jié)合,將免疫磁珠與肺癌細(xì)胞結(jié)合.通過(guò)磁場(chǎng)作用,使肺癌細(xì)胞在磁場(chǎng)的作用下從混合細(xì)胞中分離富集.分離出的細(xì)胞利用間接熒光技術(shù)在其細(xì)胞表面連接結(jié)合PE熒光團(tuán)的特異性抗體,并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對(duì)細(xì)胞核染色以定位細(xì)胞位置.通過(guò)倒置熒光顯微鏡的觀察,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的定量計(jì)數(shù)檢測(cè).實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有較好的檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)下限,檢測(cè)下限可達(dá)3cells/mL.

循環(huán)腫瘤細(xì)胞; 磁分選技術(shù); 免疫熒光技術(shù); 肺癌A549細(xì)胞

0 引 言

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTCs)是從腫瘤組織脫落,通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)遠(yuǎn)離腫瘤組織的一類腫瘤細(xì)胞,其中大部分的循環(huán)腫瘤細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)中被吞噬或者凋亡,只有少數(shù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移并發(fā)展成轉(zhuǎn)移灶,形成新的腫瘤組織.惡性腫瘤細(xì)胞通過(guò)血液轉(zhuǎn)移到身體的其他器官,而CTCs的轉(zhuǎn)移是造成腫瘤患者死亡的主要原因[1-4].因此循環(huán)腫瘤細(xì)胞的早期診斷及治療,對(duì)于患者的預(yù)后判斷、療效評(píng)價(jià)和個(gè)體化治療都具有重要的意義.

CTCs在腫瘤病人外周血的含量極少,一般10mL血液中只有1～10個(gè)細(xì)胞,這對(duì)CTCs檢測(cè)系統(tǒng)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[5].需要高敏感性、可重復(fù)性、可靠、快速、便宜的富集手段才能解決這個(gè)問(wèn)題.目前CTCs的富集技術(shù)主要根據(jù)免疫親和性、物理性質(zhì)和直接分析這三類技術(shù)來(lái)進(jìn)分離富集[6-8].免疫磁珠法是免疫親和性的一種方法,CTCs的富集主要是利用捕獲抗體和CTCs抗原之間的高度特異性反應(yīng),免疫作用促使抗原與耦合到磁珠的抗體發(fā)生特異性的結(jié)合,然后抗原-抗體復(fù)合物被置于磁場(chǎng)作用之下,通過(guò)磁場(chǎng)對(duì)免疫磁珠固定從而使CTCs與其他血液細(xì)胞分離,產(chǎn)生富集效果[9-11].

目前已經(jīng)開發(fā)了大量的技術(shù)用于檢測(cè)CTCs,其中有些已經(jīng)成功的用于測(cè)試或者臨床評(píng)估[12].現(xiàn)有的CTCs檢測(cè)技術(shù)主要包含免疫細(xì)胞化學(xué)[13]、多聚酶鏈反應(yīng)[14]、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)[15]、流式細(xì)胞術(shù)[16]等.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法是基于抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的原理,利用單克隆抗體(McAb)與特異的腫瘤標(biāo)記物結(jié)合,并通過(guò)酶與底物反應(yīng)顯色來(lái)判斷腫瘤細(xì)胞的存在.檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物主要分三類[17]:1)上皮細(xì)胞角蛋白(CK),如CK19;2)上皮細(xì)胞膜特異性抗原,如黏蛋白類,包括上皮膜抗原(EMA)、人乳球蛋白(HMFG)等;3)腫瘤相關(guān)糖蛋白(TAG),如TAG12.目前,這些檢測(cè)技術(shù)仍然存在檢測(cè)限不夠低,檢測(cè)方法易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性等問(wèn)題.

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物,再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體).在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光,可以通過(guò)熒光所在的細(xì)胞或組織,來(lái)確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用熒光定量技術(shù)測(cè)定含量[18].免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法[19]、夾心法[20]、間接法[21]和補(bǔ)體法[22].本研究發(fā)展了一種結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)雙重捕獲及檢測(cè)CTCs的方法.選用磁核為Fe3O4的免疫磁珠.在Fe3O4磁珠表面連接EGFR抗體.利用特異性抗體與細(xì)胞表面特異性抗原相結(jié)合,使得肺癌A549細(xì)胞和特異性的免疫磁珠結(jié)合,并在外界磁場(chǎng)的作用下,使得目的A549細(xì)胞在磁場(chǎng)的作用下從混合細(xì)胞中分離出來(lái).分離出的細(xì)胞由間接熒光技術(shù)在其細(xì)胞表面連接結(jié)合PE熒光素的特異性抗體,并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對(duì)細(xì)胞核染色以定位細(xì)胞位置.通過(guò)倒置熒光顯微鏡的觀察,從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的定量計(jì)數(shù)檢測(cè).檢測(cè)的原理如圖1所示.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

免疫磁珠(柏慧康生物技術(shù)有限公司);鼠抗人癌胚抗原單克隆抗體(CEA)一抗,熒光素PE標(biāo)記兔抗鼠IgG(聯(lián)科生物有限公司);A549細(xì)胞,MRC-5細(xì)胞(中科院細(xì)胞庫(kù));磷酸氫二鉀,磷酸二氫鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);DAPI、DMEM培養(yǎng)基,1640培養(yǎng)基(上海秉新生物科技有限公司);實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.

1.2Fe3O4免疫磁珠(MNPs-Anti-EGFR)的制備

首先通過(guò)共沉淀法合成Fe3O4磁珠,具體的合成如下,用電子天平稱取FeSO4·7H2O 1.5 g,將其倒入50 mL的小燒杯中,然后加30 mL的二次蒸餾水?dāng)嚢枞芙?待固體完全溶解后,在65 ℃的溫度下攪拌30 min,在攪拌過(guò)程中逐漸滴加5 mL的H2O2溶液.在N2保護(hù)下,將溶液溫度升至40 ℃并保持恒溫,然后加入1.5 g的FeSO4固體,攪拌溶解10 min后.將25 mL的NaOH溶液(物質(zhì)的量濃度為2 mol/L)逐滴滴加到溶液中,將溫度升至60 ℃并保持恒溫,溶液攪拌2 h.反應(yīng)結(jié)束后,在外界磁場(chǎng)分離后,用二次蒸餾水將所得固體清洗5次.所得固體即為Fe3O4磁珠,將磁珠貯存在4 ℃冰箱備用.

圖1 基于磁分選技術(shù)與間接熒光技術(shù)捕獲目的細(xì)胞機(jī)理示意圖

將1,2-二油?；蚜字?DOPC)、殼聚糖十六烷基季胺鹽、膽固醇溶于二氯甲烷溶液中,攪拌溶解,標(biāo)記為A液.將磁珠分散在二氯甲烷溶液中,標(biāo)記為B液.將A、B溶液一起轉(zhuǎn)移至梨型燒瓶?jī)?nèi),加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液定容到一定體積,孵育后,標(biāo)記為C液.用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于真空環(huán)境下將超聲后的混合溶液中的二氯甲烷溶劑除去.將N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)_、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCI)、表皮生長(zhǎng)因子受體抗體(Anti-EGFR)混合溶液在4 ℃的環(huán)境中攪拌反應(yīng)12 h后,即得Fe3O4免疫磁珠(以下簡(jiǎn)稱免疫磁珠).所得的免疫磁珠保存在4 ℃冰箱中.

1.3細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所采用的細(xì)胞為細(xì)胞表面EGFR抗原陽(yáng)性表達(dá)的人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞,以及對(duì)EGFR 抗原不表達(dá)的人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞.A549細(xì)胞培養(yǎng)在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%牛血清蛋白的1640培養(yǎng)液中,MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%牛血清蛋白的DMEM培養(yǎng)液中.

1.4免疫磁珠特異性和細(xì)胞特異性實(shí)驗(yàn)

將A549細(xì)胞胰酶處理,離心收集,分散計(jì)數(shù).在2個(gè)1 mL EP管中分別放入100 μL A549細(xì)胞樣品,命名為a管、b管.在a號(hào)樣品管中加入免疫磁珠60 μL,在b號(hào)樣品中加入Fe3O4磁珠60 μL.同時(shí)在37 ℃恒溫環(huán)境下?lián)u床孵育1 h.在外界磁場(chǎng)作用下分離下,將分離得到的樣品用PBS溶液清洗3次(以下簡(jiǎn)稱分離,PBS清洗3次).加入50 μL的DAPI染色劑染色處理,放入4 ℃冰箱冷卻放置5 min,分離,PBS清洗3次.所得溶液用PBS溶液定容到50 μL.將溶液滴加到透明載玻片上,分別于倒置熒光顯微鏡下觀察.

將A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞胰酶處理,離心收集,分散計(jì)數(shù),分別取100 μL A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞樣品于2個(gè)1 mL EP管中,在兩個(gè)樣品中加入60 μL免疫磁珠.同時(shí)在37 ℃恒溫環(huán)境下?lián)u床孵育1 h.分離,PBS清洗3次,加入50 μL的DAPI染色劑染色處理,放入4 ℃冰箱冷卻放置5 min,分離,PBS清洗3次,定容到50 μL.將溶液滴加到透明載玻片上,分別于倒置熒光顯微鏡下觀察.

1.5實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

最優(yōu)孵育時(shí)間確定,具體如下:將A549細(xì)胞胰酶處理,離心收集,分散計(jì)數(shù).在樣品中分別加入60 μL免疫磁珠.分別在37 ℃恒溫環(huán)境下?lián)u床孵育0、15、30、45、60、75 min.最佳免疫磁珠加入量的確定如下:在細(xì)胞樣品中分別加入免疫磁珠20、40、60、80、100 μL.同時(shí)在37 ℃恒溫環(huán)境下?lián)u床孵育1 h,所有的樣品,經(jīng)分離,DAPI染色處理后,于倒置熒光顯微鏡下觀察.

最佳一抗和二抗稀釋濃度確定如下:將經(jīng)胰酶處理的A549細(xì)胞溶液培養(yǎng)在16孔板上,孵育24 h,將鼠抗人CEA一抗(原質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL)用PBS溶液稀釋50、100、250倍,各取100 μL不同稀釋比例的一抗分別加入到孔板中,在37 ℃恒溫環(huán)境下?lián)u床孵育1h.吸出培養(yǎng)液,并用PBS緩沖液清洗3次,將熒光素PE標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗(原質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL)PBS溶液稀釋100、250、500倍各取100 μL不同稀釋濃度的二抗分別加入到孔板中,在37 ℃恒溫環(huán)境下?lián)u床孵育1 h.并用PBS緩沖液清洗3次.DAPI染色處理后,于倒置熒光顯微鏡下觀察.

1.6結(jié)合磁分選技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)的靶向腫瘤細(xì)胞的特異性實(shí)驗(yàn)

將A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞胰酶處理,離心收集,分散計(jì)數(shù),分別取2個(gè)100 μL樣品A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞置于2個(gè)1 mL EP管中,分別加入60 μL免疫磁珠.在37 ℃恒溫環(huán)境下?lián)u床孵育1 h.分離,PBS清洗3次.在兩個(gè)樣品中分別加入100μL用PBS 緩沖溶液稀釋100倍的CEA一抗,在37 ℃恒溫環(huán)境下?lián)u床孵育1 h.分離,PBS清洗3次,然后分別加入100 μL用PBS緩沖溶液稀釋100倍的連接熒光素PE標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗,在37 ℃恒溫環(huán)境下?lián)u床孵育1 h.分離,PBS清洗3次.加入50 μL的DAPI染色劑染色處理,在4 ℃冰箱中冷卻放置5 min.再分離,PBS清洗3次,定容到50 μL.將溶液滴加到透明載玻片上,分別于倒置熒光顯微鏡下觀察.

1.7靈敏度實(shí)驗(yàn)

將A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞胰酶處理,離心收集,分散計(jì)數(shù),取7個(gè)1 mL的EP管,將含有不同數(shù)目的A549細(xì)胞分別加入到7個(gè)EP管中并定容至100 μL,編號(hào)從1～7的EP管中A549細(xì)胞的數(shù)目分別為50,50,50,50,50,5,3個(gè).從1～7的EP管中,分別加入100 μL不同數(shù)目的MRC-5細(xì)胞,使A549和MRC-5細(xì)胞數(shù)目比為1∶10,1∶100,1∶1 000,1∶104,1∶105,1∶106,1∶1.7×106.分別在7個(gè)樣品管中加入60 μL免疫磁珠,在37 ℃恒溫環(huán)境下?lián)u床孵育1 h.分離,PBS清洗3次.分別加入100 μL用PBS緩沖溶液稀釋100倍的CEA一抗,在37 ℃恒溫環(huán)境下?lián)u床孵育1 h.分離,PBS清洗3次,然后分別加入100 μL用PBS緩沖溶液稀釋100倍的連接PE熒光素的CEA二抗,在37 ℃恒溫環(huán)境下?lián)u床孵育1 h.分離,PBS清洗3次.加入50 μL的DAPI染色劑染色處理,在4 ℃冰箱內(nèi)冷卻放置5 min.再分離,PBS清洗3次,定容到50 μL.將溶液滴加到透明載玻片上,分別于倒置熒光顯微鏡下觀察.

2 結(jié)果與討論

2.1免疫磁珠的表征

首先通過(guò)沉淀法制備出Fe3O4磁珠,通過(guò)TEM表征(圖2A)可知,Fe3O4磁珠因?yàn)閳F(tuán)聚出現(xiàn)不規(guī)則形狀,單個(gè)粒子的直徑約在6 nm左右.免疫磁珠的TEM圖(圖2B)所示,包裹EGFR抗體后的Fe3O4磁珠,分散較為均勻,粒徑約在13 nm左右.并且從圖2可以看到Fe3O4磁珠表面有一層均勻的淺灰色的蛋白包裹,說(shuō)明免疫磁珠被成功制備,通過(guò)粒徑分析儀測(cè)得免疫磁珠的粒徑分布如圖2C所示,可知所合成的免疫磁珠粒徑比較均勻,平均粒徑約為325 nm.所制備的免疫磁珠符合捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞要求.

X射線衍射(XRD)是一種確定材料結(jié)晶情況的表征手段,圖3A是Fe3O4磁珠的XRD廣角衍射譜圖.從圖3A可以得到,Fe3O4磁珠的衍射峰分別出現(xiàn)在30.1°,35.5°,43.1°,53.7°,57.2°,62.7°處,分別對(duì)應(yīng)立方相Fe3O4的(220),(311),(400),(422),(511)和(440)晶面.由此可以判斷,制備的Fe3O4磁珠是立方相的Fe3O4,且結(jié)晶度良好.

紫外吸收光譜用來(lái)分析抗體是否成功地連接到Fe3O4磁珠表面.蛋白質(zhì)中含有色氨酸殘基和酪氨酸殘基,分子內(nèi)部存在著共軛雙鍵,因此在280 nm處有特征吸收峰.單獨(dú)的EGFR抗體的紫外吸收峰出現(xiàn)在280 nm(圖3B),為蛋白的特征吸收峰.圖3B中Fe3O4磁珠的紫外測(cè)試并沒有明顯的特征吸收峰.而包裹EGFR抗體后的免疫磁珠紫外特征吸收峰也出現(xiàn)在280 nm附近,由于偶聯(lián)基團(tuán)的影響,抗體的特征吸收峰發(fā)生藍(lán)移.結(jié)果證明Fe3O4磁珠表面成功包裹上了EGFR抗體.

圖2 Fe3O4磁珠的TEM圖(A)、免疫磁珠的TEM圖(B)和免疫磁珠在PBS溶液中的粒徑分布圖(C)

圖3 免疫磁珠的XRD圖(A)和紫外吸收光譜圖(B)

圖4 Fe3O4磁珠與免疫磁珠磁滯曲線

然后進(jìn)一步表征了所合成的免疫磁珠的磁性性能,通過(guò)磁強(qiáng)計(jì)檢測(cè)Fe3O4磁珠和免疫磁珠的磁滯強(qiáng)度.從圖4中Fe3O4磁珠和免疫磁珠的磁滯曲線可知,Fe3O4磁流體的飽和磁化強(qiáng)度為45.3 emu/g,具有較強(qiáng)的磁強(qiáng)度.合成后的免疫磁珠的飽和磁化強(qiáng)度為18.8 emu/g,磁化強(qiáng)度降低了26.5 emu/g.這是由于EGFR抗體不具有磁性,對(duì)于Fe3O4磁流體的包覆從一定程度上降低了粒子的磁性能.從圖4中還可以知道兩種粒子的矯頑力(Hc)及剩磁(Br)也都非常低.因此Fe3O4磁珠和免疫磁珠在外加磁場(chǎng)的作用下,磁珠被磁化充分,同時(shí)在撤掉外界磁場(chǎng)的作用下,磁性粒子磁性殘留較少.因此免疫磁珠符合捕獲腫瘤細(xì)胞的要求.

2.2免疫磁珠捕獲A549細(xì)胞特異性

將等量的Fe3O4磁珠及免疫磁珠加入到等量的A549細(xì)胞溶液中時(shí).從熒光圖(圖5)中可以看出,加入免疫磁珠的樣品中有藍(lán)色熒光標(biāo)記的細(xì)胞,而加入Fe3O4磁珠的樣品中則沒有,說(shuō)明免疫磁珠對(duì)表面EGFR陽(yáng)性表達(dá)的A549目標(biāo)細(xì)胞具有捕獲能力,而表面未包裹EGFR的Fe3O4磁珠對(duì)A549目標(biāo)細(xì)胞不具有捕獲能力.因此本實(shí)驗(yàn)所選用的免疫磁珠是一種特異性的磁珠,對(duì)肺癌A549細(xì)胞的捕獲具有良好的效果.

圖5 免疫磁珠捕獲肺癌A549細(xì)胞的倒置熒光顯微鏡熒光圖(A,B,C分別對(duì)應(yīng)加入免疫磁珠的明場(chǎng)、熒光和疊加圖;D,E,F分別對(duì)應(yīng)加入Fe3O4磁珠的明場(chǎng)、熒光和疊加圖)

2.3免疫磁珠捕獲A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞的特異性研究

將等量的免疫磁珠加入到等量的A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞溶液中時(shí),從圖6的熒光圖(A,B,C)中可以看出,藍(lán)色的熒光部分是被DIPA染色的細(xì)胞核.免疫磁珠對(duì)目標(biāo)細(xì)胞A549具有良好捕獲能力,這是因?yàn)锳549細(xì)胞表面為EGFR抗體陽(yáng)性表達(dá).而對(duì)于表面EGFR抗原陰性表達(dá)的MRC-5對(duì)照細(xì)胞不具有捕獲能力,從暗場(chǎng)圖6B,E中可以看出本實(shí)驗(yàn)所選用的免疫磁珠對(duì)目的細(xì)胞A549細(xì)胞具有特異性的捕獲能力,而對(duì)于對(duì)照細(xì)胞MRC-5細(xì)胞不能特異性捕獲.

圖6 免疫磁珠捕獲A549目標(biāo)細(xì)胞和MRC-5對(duì)照細(xì)胞的倒置熒光圖(A,B,C分別對(duì)應(yīng)A549目標(biāo)細(xì)胞的明場(chǎng)、熒光和疊加圖;D,E,F分別對(duì)應(yīng)MRC-5對(duì)照細(xì)胞的明場(chǎng)、熒光和疊加圖)

2.4實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.4.1 最優(yōu)孵育時(shí)間的確定

圖7 不同孵育時(shí)間下免疫磁珠捕獲A549細(xì)胞的明場(chǎng)、熒光和疊加圖(從左至右)的倒置熒光圖(A～R)以及不同孵育時(shí)間對(duì)A549細(xì)胞的捕獲率圖(S)

將等量的免疫磁珠加入到等量的A549細(xì)胞溶液中時(shí),分別孵育0、15、30、45、60、75 min后在熒光顯微鏡下觀察,以確定最佳的孵育時(shí)間.從圖7可以看出,在A549細(xì)胞濃度及免疫磁珠用量一定時(shí)(A549 細(xì)胞濃度為3.5×103cells/mL,免疫磁珠的用量為60 μL),隨著免疫磁珠與細(xì)胞孵育時(shí)間的增加,免疫磁珠捕獲的A549細(xì)胞的數(shù)目逐漸增加,從暗場(chǎng)圖中可以看出(圖7),到孵育60 min后捕獲細(xì)胞數(shù)目變化不大.這是因?yàn)楫?dāng)孵育時(shí)間在60 min以后時(shí),在一定的細(xì)胞濃度和一定量免疫磁珠的條件下捕獲目的細(xì)胞已趨于飽和狀態(tài).由捕獲的A549細(xì)胞數(shù)目與原加入的A549細(xì)胞數(shù)目的百分比得到在該孵育時(shí)間下的細(xì)胞捕獲率X(%)(圖7S).在60 min時(shí),細(xì)胞捕獲效率達(dá)到最高,因此,免疫磁珠捕獲腫瘤細(xì)胞所選用的孵育時(shí)間為60 min.

2.4.2 最優(yōu)免疫磁珠加入量確定

在等量的A549細(xì)胞溶液中時(shí),分別加入20、40、60、80、100 μL的免疫磁珠后孵育60 min,通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察,以確定最優(yōu)的免疫磁珠加入量.從圖8可以看出,當(dāng)A549細(xì)胞濃度及孵育時(shí)間一定時(shí)(A549 細(xì)胞濃度為3.5×103cells/mL,孵育時(shí)間為60 min),隨著免疫磁珠加入量的增加,藍(lán)色熒光部分逐漸增加,說(shuō)明免疫磁珠捕獲A549細(xì)胞的數(shù)目逐漸增加,但隨著免疫磁珠加入量越多對(duì)細(xì)胞顯現(xiàn)的熒光遮蔽作用越明顯,阻礙細(xì)胞的觀察及計(jì)數(shù).計(jì)算細(xì)胞捕獲率,根據(jù)免疫磁珠加入量和細(xì)胞捕獲率得到圖8P所示關(guān)系圖.基于捕獲率以及節(jié)約免疫磁珠的原則,所選用的最佳免疫磁珠加入量為60 μL.

2.4.3 一抗二抗稀釋比例優(yōu)化

在16孔板上培養(yǎng)A549細(xì)胞,待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿后,基于間接熒光技術(shù)在孔板中分別加入不同稀釋比例的CEA一抗(原質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL)和連接PE的CEA二抗(原質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL),在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)一抗二抗的稀釋比例均為1∶100時(shí),稀釋比例下細(xì)胞染色效果最佳如圖9(C)所示.因此本實(shí)驗(yàn)所選用的一抗二抗均選擇1∶100的稀釋濃度.

2.5磁分選技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)靶向細(xì)胞特異性和捕獲A549細(xì)胞的靈敏度研究

將60 μL的免疫磁珠加入到等量的A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞溶液中時(shí),孵育60 min后,經(jīng)過(guò)染色處理在熒光顯微鏡下觀察,從倒置熒光圖(圖10)中可以看出,表面具有EGFR抗體和CEA抗原陽(yáng)性表達(dá)的目的細(xì)胞A549能被免疫磁珠分選并被間接免疫熒光技術(shù)染色,在疊加圖10D中可看出,熒光顯微鏡下細(xì)胞顯現(xiàn)紅色及藍(lán)色的熒光.而表面EGFR抗體和CEA抗原陰性表達(dá)的MRC-5細(xì)胞,無(wú)法被磁分選以及染色(圖10H).因此磁分選后在倒置熒光顯微鏡下具有紅色及藍(lán)色熒光的細(xì)胞為肺癌A549細(xì)胞.

圖8 不同免疫磁珠加入量下捕獲 A549 細(xì)胞的明場(chǎng)、熒光和疊加圖(從左至右)的倒置熒光圖(A～O)以及不同加入量對(duì)A549細(xì)胞的捕獲率圖(P)

圖9 A549細(xì)胞的明場(chǎng)圖(A)、DIPA染色的熒光圖(B)、PE染料染色的熒光圖(C)和熒光疊加圖(D)(一抗和二抗的稀釋比例均為 1∶100)

圖10 最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下磁分選免疫磁珠靶向A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞的倒置熒光圖

將60 μL的免疫磁珠加入到有不同比例的A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞組成的混合溶液中時(shí),孵育60 min后,經(jīng)過(guò)染色處理后在熒光顯微鏡下觀察,計(jì)數(shù)捕獲的A549細(xì)胞數(shù)目,計(jì)算細(xì)胞捕獲率.從表1檢測(cè)靈敏度表中可知,在A549細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞組成的混合溶液中,通過(guò)磁分選技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)對(duì)肺癌A549目標(biāo)細(xì)胞的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到3 cells/mL[23].

表1 最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下,磁分選技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)對(duì)肺癌A549目標(biāo)細(xì)胞的檢測(cè)靈敏度

3 結(jié) 論

本工作采用磁分選技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)從混合細(xì)胞中分離檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞,在最優(yōu)條件為免疫磁珠加入量為60 μL,一抗和二抗的稀釋比均為1∶100,孵育時(shí)間為60 min.對(duì)細(xì)胞的捕獲特異性良好,檢測(cè)靈敏度可達(dá)到3 cells/mL.該方法對(duì)肺癌A549細(xì)胞具有良好的檢測(cè)特異性和檢測(cè)靈敏度,對(duì)于實(shí)際樣品CTCs的檢測(cè)具有良好的應(yīng)用前景.

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(責(zé)任編輯：郁 慧)

IsolationanddetectionofA549lungcancercellsbasedonmagneticseparationandindirectimmunofluorescencetechnologies

Zhou Chaohui,FuCongying,JiaNengqin*

(College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai200234,China)

This article reports the development of a combining immunomagnetic separation technology with indirect immunofluorescence technology for separating and determining of the carcinoma A549cells.Magnetic beads weresynthesized by chemical precipitation.Immunomagneticbeads were constructed by grafted EGFR to the surface of Fe3O4nanoparticles coated by lipid.The carcinoma A549cells could specifically bind with the EGFR antibody on the immunomagnetic′s surface.The carcinoma A549cells could be isolatedand enriched from the mixed cellsunder the action of in the magnetic field.The separated cells could connect with the specific antibody contained PE fluorophore and the location of cellnucleus can be confirmed by DAPI to stain the cell nucleus.The carcinoma A549cells could be quantitatively detectedbyobserving inversion fluorescence microscope.All those results indicate that the method of combining Immunomagnetic separation technology and indirect immunofluorescence technology have a good specificity and high sensitivity for isolationand detection of the carcinoma A549cells.thedetection limit is three cells per milliliter.

CTCs; immunomagneticseparationtechnology; immunofluorescencetechnology; carcinoma A549cells

2017-05-31

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(21373138);上海教委創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目 (15ZZ070)

周朝輝(1988-),男,助理實(shí)驗(yàn)師,主要從事納米生物技術(shù)方面的研究.E-mail:chaohuizhou@shnu.edu.cn

*通信作者: 賈能勤(1970-),男,教授,主要從事納米生物技術(shù)、生物電化學(xué)、生物傳感器等方面的研究.E-mail:nqjia@shnu.edu.cn

R73-34

:A

:1000-5137(2017)04-0489-10