HPLC法測(cè)定牡丹籽油中游離型和結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸及油酸的含量

羅國(guó)平，梁宇柱，閆夢(mèng)茹，張存勞，孟會(huì)寧，吳環(huán)環(huán)，宋 靜

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，西安 710021； 2.西安中糧工程研究設(shè)計(jì)院有限公司，西安 710082； 3.山東步長(zhǎng)醫(yī)藥銷售有限公司，山東 菏澤 274418)

HPLC法測(cè)定牡丹籽油中游離型和結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸及油酸的含量

羅國(guó)平1，梁宇柱2，閆夢(mèng)茹1，張存勞1，孟會(huì)寧3，吳環(huán)環(huán)1，宋 靜1

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，西安 710021； 2.西安中糧工程研究設(shè)計(jì)院有限公司，西安 710082； 3.山東步長(zhǎng)醫(yī)藥銷售有限公司，山東 菏澤 274418)

采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定牡丹籽油中游離型、結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸及油酸的含量。檢測(cè)條件為Agilent C18高效色譜柱(3.0 mm×50 mm， 2.7 μm)，流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水溶液(體積比85∶15)，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果表明，該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。α-亞麻酸在41.4～207 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系；亞油酸在20.2～101 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系；油酸在14.9～74.6 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。牡丹籽油樣品中，游離型α-亞麻酸、亞油酸和油酸的平均含量分別為4.47、1.89 mg/mL和0.92 mg/mL，結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸和油酸的平均含量分別為437、237 mg/mL和156 mg/mL。建立的方法具有分離效率高、選擇性好和條件溫和的優(yōu)點(diǎn)。

牡丹籽油；α-亞麻酸；亞油酸；油酸；高效液相色譜法

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是毛茛科芍藥屬灌木，牡丹籽油因具有豐富的營(yíng)養(yǎng)，又有醫(yī)療保健功效，被稱為植物油中的珍品[1-2]。牡丹籽油中含有α-亞麻酸、亞油酸、油酸、維生素E等多種營(yíng)養(yǎng)成分[3]。牡丹籽油中α-亞麻酸、亞油酸和油酸3種不飽和脂肪酸含量高低可作為評(píng)價(jià)牡丹籽油保健作用強(qiáng)弱的指標(biāo)之一。

據(jù)查，牡丹籽油中脂肪酸有兩種存在形式，游離型脂肪酸和結(jié)合型脂肪酸。前者的含量一般遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于后者，但是牡丹籽油在儲(chǔ)存過(guò)程會(huì)因儲(chǔ)存條件不當(dāng)或者儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致部分脂肪酸由結(jié)合型分解為游離型。目前，脂肪酸多采用氣相法進(jìn)行定量分析，該方法存在一些不足：一是需將樣品甲酯化[4-6]，影響因素多，容易導(dǎo)致反應(yīng)不完全；二是在分析過(guò)程中由于柱溫較高，易使亞油酸和α-亞麻酸的雙鍵斷裂或產(chǎn)生雙鍵的異構(gòu)化現(xiàn)象[7]；三是未將游離型脂肪酸和結(jié)合型脂肪酸加以區(qū)分。為此，筆者采用高效液相色譜(HPLC)法[8-10]，在相同色譜條件下，分別采用兩種方法制備供試品溶液，第一種方法為取牡丹籽油加甲醇超聲溶解，離心后取上清液進(jìn)樣，測(cè)定的是游離型脂肪酸的含量；第二種方法為牡丹籽油先堿水解、皂化，反應(yīng)完全后酸化，用正己烷萃取，萃取液除去正己烷，最后用甲醇溶解后進(jìn)樣，測(cè)定的是游離型脂肪酸和結(jié)合型脂肪酸含量之和，減去第一種方法中測(cè)得的游離型脂肪酸含量，即可得到結(jié)合型脂肪酸的含量。該方法具有分離效率高、選擇性好、條件溫和的特點(diǎn)，可分別測(cè)定游離型脂肪酸和結(jié)合型脂肪酸的含量。目前，采用HPLC法測(cè)定牡丹籽油中脂肪酸含量的文獻(xiàn)報(bào)道較少，鮮有采用此方法分別測(cè)定牡丹籽油中游離型、結(jié)合型的α-亞麻酸、亞油酸及油酸含量的研究報(bào)道，故本文所述方法具有一定的學(xué)術(shù)和實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

牡丹籽油，自制；α-亞麻酸(批號(hào)21967)、亞油酸(批號(hào)B21421)和油酸(批號(hào)B21592)對(duì)照品，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀，安捷倫；UV-2012型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；KQ-5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；ALC-210.4型精密電子天平，賽多利斯。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 油酸、亞油酸和α-亞麻酸混合對(duì)照品溶液的制備

分別取α-亞麻酸對(duì)照品約100 mg、亞油酸對(duì)照品約50 mg、油酸對(duì)照品約37 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后精密吸取混合液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液(α-亞麻酸質(zhì)量濃度為207 μg/mL，亞油酸質(zhì)量濃度為101 μg/mL，油酸質(zhì)量濃度為74.6 μg/mL)。

1.2.1.2 供試品溶液的配制

供試品溶液1：精密移取牡丹籽油125 μL，置25 mL容量瓶中，加甲醇23 mL，超聲30 min，充分溶解，放冷后用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液2：精密移取牡丹籽油125 μL，置25 mL三口燒瓶中，加0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液4 mL，在60℃水浴中皂化20 min，待油珠溶解，放冷，轉(zhuǎn)移至25 mL的分液漏斗中，加0.5 mol/L鹽酸5 mL，加正己烷萃取3次，每次5 mL，合并萃取液，除去正己烷，殘留物用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，精密量取1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

以甲醇作為空白對(duì)照溶液。

1.2.2 色譜條件

Agilent C18高效色譜柱(3.0 mm×50 mm，2.7 μm)，流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水溶液(體積比 85∶15)，流速1 mL/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和空白對(duì)照溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.3.2 線性關(guān)系考察

精密量取1.2.1.1混合對(duì)照品溶液2.0、 4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備成α-亞麻酸質(zhì)量濃度分別為41.4、82.8、124、166、207 μg/mL，亞油酸質(zhì)量濃度分別為20.2、40.4、60.6、80.8、101 μg/mL和油酸質(zhì)量濃度分別為14.9、29.8、44.8、59.7、74.6 μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。

1.2.3.3 精密度試驗(yàn)

取1.2.1.1混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積，分別計(jì)算油酸、亞油酸和α-亞麻酸峰面積的RSD。

1.2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取牡丹籽油6份，照1.2.1.2供試品溶液2方法分別制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，分別計(jì)算油酸、亞油酸和α-亞麻酸的平均含量和RSD。

1.2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份 1.2.1.2供試品溶液2方法制備的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)行檢測(cè)，分別計(jì)算油酸、亞油酸和α-亞麻酸峰面積的RSD。

1.2.3.6 加樣回收試驗(yàn)

精密量取已知α-亞麻酸、亞油酸、油酸含量的牡丹籽油6份，其中3份按1.2.1.2供試品溶液1方法制備，另外3份按1.2.1.2供試品溶液2方法制備，分別精密加入與供試品溶液中3種脂肪酸含量80%、100%和120%的對(duì)照品，按本方法測(cè)定，分別計(jì)算加樣回收率和RSD。

1.2.4 牡丹籽油中α-亞麻酸、亞油酸和油酸的含量測(cè)定

精密量取3份牡丹籽油，分別按照1.2.1.2方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL注入高效液相色譜儀，按本方法測(cè)定，記錄峰面積，分別計(jì)算3種脂肪酸(游離型和結(jié)合型)的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

雖然油酸、亞油酸、α-亞麻酸的分子結(jié)構(gòu)中僅含有非共軛雙鍵，但是在采用HPLC法測(cè)定脂肪酸含量時(shí)，很多文獻(xiàn)還是選擇了紫外檢測(cè)器。在檢測(cè)波長(zhǎng)選擇方面，有文獻(xiàn)選擇210 nm[11]，也有選擇205 nm[12]，還有選擇203 nm[13]；除此以外，還有文獻(xiàn)報(bào)道采用制備脂肪酸衍生物后，在檢測(cè)波長(zhǎng)為242 nm處進(jìn)行測(cè)定[14]。綜合考慮并經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，本文選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性試驗(yàn)(見圖1)

從圖1可看出，供試品1和供試品2色譜圖與混合對(duì)照品色譜圖中3個(gè)待測(cè)組分對(duì)應(yīng)的色譜峰的保留時(shí)間相同，色譜峰分離度好，且空白樣品無(wú)干擾，說(shuō)明本法專屬性好。

2.2.2 線性關(guān)系考察

α-亞麻酸回歸方程為y=22.217x+191.53，r=0.998 1，結(jié)果表明α-亞麻酸在41.4～207 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。亞油酸回歸方程為y=19.88x+42.821，r=0.998 6，結(jié)果表明亞油酸在20.2～101 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。油酸回歸方程為y=6.698 2x+20.998，r=0.999 3，結(jié)果表明油酸在14.9～74.6 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度試驗(yàn)

α-亞麻酸、亞油酸和油酸峰面積的RSD分別為1.62%、1.25%和1.33%，說(shuō)明檢測(cè)儀器的精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

α-亞麻酸、亞油酸和油酸的平均含量分別為441、239 mg/mL和157 mg/mL，RSD分別為2.32%、1.68%和2.58%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

α-亞麻酸、亞油酸和油酸峰面積的RSD分別為2.01%、1.76%和1.36%，表明供試品溶液中這3種成分在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 加樣回收試驗(yàn)(見表1)

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

從表1可看出，游離型α-亞麻酸、亞油酸和油酸的平均加樣回收率分別為95.57%、103.07%和102.00%，RSD分別為2.18%、7.06%和4.02%；結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸和油酸的平均加樣回收率分別為94.87%、97.07%和94.40%，RSD分別為4.13%、1.87%和2.52%。

2.3 牡丹籽油中α-亞麻酸、亞油酸和油酸的含量(見表2)

表2 牡丹籽油中α-亞麻酸、亞油酸和油酸的含量 mg/mL

從表2可看出，牡丹籽油中，游離型α-亞麻酸、亞油酸、油酸的平均含量分別為4.47、1.89、0.92 mg/mL，結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸、油酸的平均含量分別為437、237、156 mg/mL。樣品中3種脂肪酸結(jié)合型的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于游離型的含量(基本都相差100倍左右)，說(shuō)明自制的牡丹籽油中脂肪酸主要以結(jié)合型存在。

3 結(jié) 論

本文采用高效液相色譜法測(cè)定牡丹籽油中游離型和結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸及油酸的含量，色譜柱為Agilent C18高效色譜柱(3.0 mm×50 mm，2.7 μm )，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(體積比85∶15)，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量20 μL。該方法具有分離效率高、選擇性好、條件溫和的特點(diǎn)，而且能分別測(cè)定游離型脂肪酸和結(jié)合型脂肪酸的含量，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的一些不足，如樣品前處理煩瑣、反應(yīng)不完全，柱溫高導(dǎo)致脂肪酸雙鍵異構(gòu)化等，特別是為測(cè)定牡丹籽油在儲(chǔ)存過(guò)程中3種功能性不飽和脂肪酸由結(jié)合型轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x型的含量變化提供了一個(gè)新方法。

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Determinationofcontentsoffreeandconjugatedα-linolenicacid,linoleicacidandoleicacidinPaeoniasuffruticosaAndr.seedoilbyHPLC

LUO Guoping1，LIANG Yuzhu2，YAN Mengru1，ZHANG Cunlao1， MENG Huining3，WU Huanhuan1，SONG Jing1

(1.College of Pharmacy, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, China; 2. Xi’an COFCO Engineering Research & Design Institute Co., Ltd., Xi’an 710082, China; 3. Shandong Buchang Medicine Co., Ltd., Heze 274418, Shandong, China)

The contents of free and conjugatedα-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid inPaeoniasuffruticosaAndr. seed oil were determined by HPLC. The detection conditions were as follows: Agilent C18 column (3.0 mm×50 mm, 2.7 μm), mobile phase acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution (volume ratio 85∶15), flow rate 1 mL/min, detection wavelength 203 nm, column temperature 35℃ and injection volume 20 μL. The results showed that the method had good precision, repeatability and stability. Good linear relationships ofα-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid were achieved in the mass concentration ranges of 41.4-207 μg/mL, 20.2-101 μg/mL and 14.9-74.6 μg/mL, respectively. The average contents of freeα-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid were 4.47，1.89 mg/mL and 0.92 mg/mL respectively, and the average contents of conjugatedα-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid were 437，237 mg/mL and 156 mg/mL respectively inPaeoniasuffruticosaAndr.seed oil. The methods had the advantages of high separation efficiency, good selectivity and mild conditions.

PaeoniasuffruticosaAndr. seed oil;α-linolenic acid; linoleic acid; oleic acid; HPLC

2016-12-14；

：2017-04-17

2016年陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(16JK1650)；陜西省2014年省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(1644)；西安醫(yī)學(xué)院2015年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(2015DXS1-18)

羅國(guó)平(1979)，男，副教授，碩士，主要從事藥物新制劑、新劑型和新技術(shù)的教學(xué)和科研工作(E-mail)36163297@qq.com。

TS227;Q547

：A

1003-7969(2017)08-0140-05

檢測(cè)分析