組織培養(yǎng)過程中污染和褐化的防治

程遙

摘 要：就植物組織培養(yǎng)而言，污染和褐化現(xiàn)象較為常見，是影響組織培養(yǎng)實驗效果的主要因素。污染主要由真菌和細(xì)菌導(dǎo)致，褐化則主要由外植體中多酚氧化酶激活導(dǎo)致。筆者從2種問題的根本成因入手，結(jié)合自身工作經(jīng)驗，就污染和褐化防治措施發(fā)表幾點看法，以供相關(guān)人員參考。

關(guān)鍵詞：植物組織培養(yǎng)；污染；褐化；防治措施

中圖分類號：Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170833008

污染和褐化既是組織培養(yǎng)實驗的常見問題，也是組織培養(yǎng)質(zhì)量管理的工作難點。污染和褐化問題之所以難以根除，是由微生物的特性導(dǎo)致的。微生物是污染和褐化問題的根本成因，但由于其具有體積微小、生存能力強(qiáng)、繁殖速度快、容易傳播等特點，防治管理較為困難。本文重點分析了組織培養(yǎng)污染和褐化問題的形成原因，并提出了有針對性的防止措施，具體內(nèi)容如下。

1 污染現(xiàn)象成因及防治措施分析

1.1 污染現(xiàn)象成因分析

1.1.1 細(xì)菌污染分析

細(xì)菌污染主要是由交叉污染或表面消毒未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求導(dǎo)致的，其特征是菌斑表現(xiàn)為黏液狀，且較容易被發(fā)現(xiàn)，通常在接種后的24～48h內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。從操作實施的角度分析，細(xì)菌污染主要是由操作人員使用工具未經(jīng)過合格消毒及人體呼吸放出的細(xì)菌造成的，少數(shù)情況下，操作人員的手與培養(yǎng)器皿邊緣或相關(guān)材料接觸也會導(dǎo)致細(xì)菌污染。

1.1.2 真菌污染分析

真菌污染主要是由于接種箱或接種室內(nèi)空氣污染導(dǎo)致的。具體原因如下：接種室室內(nèi)空氣消毒處理未達(dá)到培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)；操作過程中，瓶蓋打開狀態(tài)下，有真菌孢子進(jìn)入瓶內(nèi)；在去除包頭紙橡皮筋或包頭紙過程中，揚起了其表面附著的真菌孢子，造成室內(nèi)空氣污染。

1.1.3 潛伏性污染分析

有些污染是由培養(yǎng)材料內(nèi)部菌體導(dǎo)致的，如維管組織帶菌等，此類組織自身具有一定的防御細(xì)菌的能力，在培養(yǎng)初期，微生物處于潛伏狀態(tài)。隨著培養(yǎng)的持續(xù)進(jìn)行，培養(yǎng)環(huán)境發(fā)生較大的變化，外植體組織發(fā)生壞死，微生物開始繁殖，最終導(dǎo)致污染。

1.2 污染防治措施分析

組織培養(yǎng)污染防治措施，主要分為以下幾點內(nèi)容：做好培養(yǎng)室內(nèi)的消毒工作，使用濃度為70.0%的酒精噴霧進(jìn)行降塵消毒，使用標(biāo)準(zhǔn)消毒水對工作臺、地板及墻板等物體表面進(jìn)行消毒，并使用紫光燈進(jìn)行照射消毒；從加強(qiáng)對菌類來源的控制和管理，超凈工作臺門口應(yīng)懸掛雙層紗布，以阻隔灰塵及菌類污染物的進(jìn)入；操作人員在正式操作前，還應(yīng)做好個人消毒處理，并嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)操作規(guī)定，科學(xué)避免污染問題的發(fā)生。

2 褐化現(xiàn)象及防治措施分析

2.1 褐化問題成因分析

褐化主要是因外植體內(nèi)部多酚氧化酶處于激活狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞代謝變化造成的，酚類物質(zhì)在氧化過程中產(chǎn)生醌類物質(zhì)，此類物質(zhì)會對其他類型酶的活性產(chǎn)生抑制，并隨著培養(yǎng)的進(jìn)行而不斷擴(kuò)散，最終形成毒害。由于其顏色為褐色，所以這種變化被稱為褐化。褐化的影響因素眾多，如基因型、植物種類及外植體生理狀況等，均會引起褐化差異，不同類型的褐化，危害程度也不同。

2.1.1 基因型影響分析

在組織培養(yǎng)實踐過程中可以發(fā)現(xiàn)，同一種植物組織培養(yǎng)過程中，部分樣品的褐變較少，而部分樣品較容易發(fā)生褐變。酚類物質(zhì)含量差異和多酚氧化酶活性差異，是造成這種實踐差異的主要原因。

2.1.2 外植體生理狀態(tài)影響

相關(guān)研究表明，材料自身生理狀態(tài)與接種后褐化現(xiàn)象有著直接且緊密的聯(lián)系，以歐洲栗為例，當(dāng)幼年體植株的醌類物質(zhì)含量就會遠(yuǎn)少于成年體植株。同時，外植體長短、生長季節(jié)等均會對褐變造成影響。

2.2 褐化問題防治措施分析

在植物培養(yǎng)前，應(yīng)確保外植體和培養(yǎng)條件的適宜性。多項試驗研究證明，優(yōu)化外植體選擇，加強(qiáng)培養(yǎng)條件的管理和控制，是避免組織培養(yǎng)出現(xiàn)褐化問題的主要渠道和手段。通常情況下，外植體具備較強(qiáng)的分生能力，創(chuàng)建適宜的培養(yǎng)條件，使外植體細(xì)胞脫分化和再分化處于最優(yōu)狀態(tài)，即可達(dá)到理想的抑制褐變發(fā)生的目的；操作人員可選擇使用抗氧化劑的形式，人工降低醌類物質(zhì)的不良影響。目前，常用的抗氧化劑包括檸檬酸、血清白蛋白、Vit E、Vit C及聚乙烯吡咯烷酮等。

3 結(jié)語

植物組織培養(yǎng)是一個系統(tǒng)、復(fù)雜的過程，對于外植體選擇、培養(yǎng)條件控制及培養(yǎng)環(huán)境潔凈狀態(tài)有著較高且嚴(yán)苛的標(biāo)準(zhǔn)要求。為避免污染和褐化問題的發(fā)生，相關(guān)人員應(yīng)全面提高對組織培養(yǎng)工作的重視，加強(qiáng)消毒管理和個人衛(wèi)生管理，優(yōu)化外植體選擇和培養(yǎng)條件控制，以確保植物組織培養(yǎng)實施效果。

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