4株天牛致病菌對川硬皮腫腿蜂的毒力測定

陶園媛，向茂榕，劉昊澤，王理順，何 勇，楊 偉，楊 樺，楊春平

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

4株天牛致病菌對川硬皮腫腿蜂的毒力測定

陶園媛*，向茂榕，劉昊澤，王理順，何 勇，楊 偉**，楊 樺，楊春平

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

利用腫腿蜂攜菌防治天牛，可發(fā)揮腫腿蜂主動搜索和病菌致病力強(qiáng)的優(yōu)勢，收到較單純放蜂或噴施菌劑更好的效果。但需保證攜帶的病菌不會顯著影響腫腿蜂的寄主搜索能力。為了利用川硬皮腫腿蜂攜帶病原菌防治松墨天牛，本文測定了4株松墨天牛致病菌的孢子粉和孢子懸浮劑對川硬皮腫腿蜂的毒力。結(jié)果表明：雌成蜂攜帶粉劑孢子的死亡率高于攜帶懸浮劑孢子的死亡率；當(dāng)噴施孢子懸浮劑時，4個菌株的累計死亡率隨濃度的增加而增加；白僵菌對川硬皮腫腿蜂的毒力較綠僵菌高，致死速率也較綠僵菌大。研究結(jié)果可為川硬皮腫腿蜂攜菌防治松墨天牛的菌種選擇和劑型研發(fā)提供依據(jù)。

川硬皮腫腿蜂；松墨天牛；白僵菌；綠僵菌；毒力測定

松墨天牛是危害我國松樹的重要蛀干害蟲，分布在我國20個省(市)，更是松樹的毀滅性病害——松材線蟲病[1～2]的主要媒介昆蟲[3～4]。目前，國內(nèi)外控制松材線蟲病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是控制其傳播媒介松墨天牛[5]。利用天敵昆蟲和病原微生物防治松墨天牛是兩條主要的生物防治途徑。

川硬皮腫腿蜂(SclerodermasichuanensisXiao)屬膜翅目、腫腿蜂科、天牛腫腿蜂屬[6]，作為一種有效的能夠防治林木鉆蛀性害蟲的優(yōu)良寄生蜂，對天牛等鉆蛀性害蟲有重大的生防價值，但該蜂防治的寄主蟲齡有一定局限[7～9]；白僵菌等病原菌對天牛有較強(qiáng)的毒力，但病原菌難進(jìn)入蛀道感染天牛。因此單獨(dú)利用上述一種方法很難將松墨天牛的種群壓低至經(jīng)濟(jì)容許水平以下。而以生物導(dǎo)彈為理念，利用川硬皮腫腿蜂攜帶致病菌防治松墨天?？赡苁且粭l新的有效途徑[10]。

要利用川硬皮腫腿蜂攜帶致病菌防治松墨天牛，必需保證攜帶的病菌不會對川硬皮腫腿蜂有很強(qiáng)的毒力，不會顯著降低其寄主搜尋能力。本實(shí)驗(yàn)通過測定四株天牛致病菌的孢子粉和孢子懸浮劑對川硬皮腫腿蜂的毒力大小，分析不同的菌株與不同的劑型對川硬皮腫腿蜂的毒力，為利用川硬皮腫腿蜂攜菌防治松墨天牛奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

菌株來源綠僵菌1號四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森保實(shí)驗(yàn)室提供的感染松墨天牛幼蟲的綠僵菌白僵菌1號四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森保實(shí)驗(yàn)室提供的感染松墨天牛幼蟲的白僵菌綠僵菌2號西北農(nóng)林科技大學(xué)提供的分離自松墨天牛幼蟲的綠僵菌白僵菌2號西北農(nóng)林科技大學(xué)提供的分離自松墨天牛幼蟲的白僵菌

1.1.2 供試蟲源

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森保實(shí)驗(yàn)室提供的川硬皮腫腿蜂雌成蟲(以下簡稱川蜂)。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

將四個菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，放入人工氣候箱中培養(yǎng)，待各菌株充分產(chǎn)孢后，分別用無菌水將孢子洗入100 ml 0.1%的吐溫-80無菌水溶液中，在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?待均勻分散后,獲孢子懸浮液。在400倍顯微鏡下用血球計數(shù)板計量孢子數(shù)，據(jù)孢子懸浮液的初始濃度確定稀釋倍數(shù)，配成1×106cfu·ml-1、1×107cfu·ml-1、1×108cfu·ml-1的菌液，放在4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 孢子懸浮液對川硬皮腫腿蜂的毒力測定

每個菌株為一處理，選擇大小一致活潑的川蜂先放于噴有無菌水的濾紙上爬走，去掉自身攜帶的雜物。將配好的不同濃度菌液分別裝入小型噴霧器中，手持噴霧器分別將各濃度的孢子懸浮液噴施在川蜂體上，每個濃度設(shè)7個重復(fù)，每個重復(fù)20只。然后將處理后的川蜂分別放入對應(yīng)的組培瓶中，并投入消毒后的黃粉蟲蛹，置于25℃±1℃、RH 70%～80%人工氣候箱中。以噴施含0.1%吐溫-80無菌水的川蜂為對照組，在相同條件下培養(yǎng)。每天觀察記錄試蟲的死亡數(shù)，計算平均死亡率。

1.2.3 孢子粉對川硬皮腫腿蜂的毒力測定

每個菌株為一處理，選擇大小一致活潑的川蜂先放于噴有無菌水的濾紙上爬走，去掉自身攜帶的雜物。采用平板爬行法，將川蜂輕置于產(chǎn)好孢子的平皿上，任其自由爬行，攜帶孢子粉，將處理后的川蜂放于裝有消了毒的黃粉蟲蛹的組培瓶中，每瓶20只，置于25℃±1℃、RH 70%～80%人工氣候箱中培養(yǎng)，每處理設(shè)7個重復(fù)，不設(shè)置對照。每天觀察記錄試蟲的死亡數(shù)，計算平均死亡率。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

以上試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)計算平均死亡率，本試驗(yàn)的對照組死亡率在5%～20%之間，需要用對照死亡率對試驗(yàn)死亡率結(jié)果進(jìn)行校正，得到校正死亡率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由DPS軟件進(jìn)行生物測定分析[11]，計算出致死中劑量(LD50)。

死亡率(%)=實(shí)驗(yàn)組死亡數(shù)/供試蟲數(shù)×100

校正死亡率(%)=(實(shí)驗(yàn)組死亡率—對照組死亡率)/(1—對照組死亡率)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 孢子懸浮液對川硬皮腫腿蜂的毒力

用孢子懸浮液處理川蜂的生測結(jié)果見表1。由表1可知，白僵菌2對川蜂的毒力最高，LD50為 7.213 8 cfu·ml-1，然后依次是白僵菌1、綠僵菌1，LD50分別為 8.594 1 cfu·ml-1、12.829 0 cfu·ml-1。綠僵菌2對川蜂毒力最小,LD50為 13.401 5 cfu·ml-1。從4個菌株的毒力回歸方程的斜率看：斜率大小為白僵菌2>白僵菌1>綠僵菌2>綠僵菌1，白僵菌2的斜率最大，其致死的速度也最快，而綠僵菌1的斜率最小，表明其致死速度相對較慢。

表1 4個菌株孢子懸浮液對川蜂的毒力測定結(jié)果

注:上列數(shù)據(jù)中的相關(guān)性p>0.05,并且相關(guān)系數(shù)r存在顯著性的差異

噴施各個菌株不同濃度孢子懸浮液的川蜂在人工氣候箱中飼養(yǎng)7 d后的死亡情況見表2。四個菌株在濃度為108cfu·ml-1時，校正死亡率最高，而在濃度為106cfu·ml-1時，校正死亡率最低。

表2 4個菌株孢子懸浮液處理7d后的校正死亡率

圖1 不同濃度孢子懸浮液處理川蜂的累計死亡率

從4個菌株不同濃度孢子懸浮液處理后川蜂不同時間累計死亡率的變化中可以看出(圖1)：當(dāng)濃度為106cfu·ml-1時，白僵菌2隨著時間的增加，累計死亡率的增長速率最快，其次是白僵菌1，而綠僵菌1與綠僵菌2的累計死亡率的變化速率趨勢相差不大，到第7天時累計死亡率趨于相同；當(dāng)濃度為107cfu·ml-1時，在前3 d，4個菌株的累計死亡率的大小相差不大。但從第3天開始，白僵菌2的累計死亡率隨著時間的增加，速率變快了，而從第4天開始，白僵菌1的累計死亡率也逐漸變快，在第7天時與白僵菌2的累計死亡率趨于相同。其中綠僵菌1和綠僵菌2在第3、4天時的累計死亡率增長趨勢比白僵菌1快，之后增長速率較之變小，綠僵菌1的累計死亡率的增長趨勢最??；當(dāng)濃度為1×108cfu·ml-1時，在前2 d，白僵菌1的累計死亡率增長速率較其它3個菌株快，而其它3個菌株的累計死亡率趨近于零。第3天開始白僵菌1與白僵菌2的累計死亡率增長速率迅速增加。綜合表1、表2和圖1可知，綠僵菌1和綠僵菌2的毒力相對較低。

2.2 孢子粉對川硬皮腫腿蜂的毒力

四個菌株孢子粉處理川蜂7 d后的死亡情況表明：白僵菌1處理后死亡的川蜂最多，其次是綠僵菌1，綠僵菌2和白僵菌2的死亡數(shù)最少并且死亡數(shù)一致。而LT50從大到小分別為：綠僵菌1>白僵菌2>綠僵菌2>白僵菌1，可知致死速度最快的是白僵菌1，綠僵菌1致死速度最慢(表3)。

表3 4個菌株孢子粉處理川蜂7d后的死亡情況

從圖2可知：綠僵菌2和白僵菌2的累計死亡率曲線相同，前3 d綠僵菌2和白僵菌2的累計死亡率大于其他菌株，第3天后白僵菌1的累計死亡率大于其他3個菌株，并且死亡率的增長趨勢明顯增大，而其余3個菌株累計死亡率接近，增長緩慢。

圖2 孢子粉處理川蜂的累計死亡率

綜合表2、表3、圖1和圖2，發(fā)現(xiàn)孢子粉處理川蜂的死亡率要高于孢子懸浮液，并且致死的速度也相對較快。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)表明：噴施孢子懸浮劑，4個菌株的累計死亡率都隨濃度的增加而增加，毒力較低的兩個菌株分別是LD50為 12.829 0 cfu·ml-1的綠僵菌1號和LD50為 13.401 5 cfu·ml-1的綠僵菌2號。而爬行法攜帶孢子粉時，川蜂攜帶各個菌株孢子粉的量都相近，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于攜帶懸浮劑孢子的量，蟲體的死亡率都比較高，致死速度快。最高的是白僵菌1號，死亡率為97.14%，LT50為4.84/d，其他三個菌株的毒力相差不大。

白僵菌對川蜂的毒力較綠僵菌的高，川蜂被白僵菌致死的速率也相對綠僵菌要大一些。白僵菌中白1的毒力相對較高，綠僵菌中綠1的毒力相對較高。這兩個菌株均直接分離自感病的天牛蟲體，且觀察平板可知，白僵菌菌落孢子的黏結(jié)程度比綠僵菌孢子的黏結(jié)程度高，綠僵菌孢子易散落。這說明不同菌株對川硬皮腫腿蜂的毒力可能與菌株的來源和黏度有關(guān)，直接來源于感病天牛蟲體的菌株毒力相對較高，黏度越高對川蜂的影響也越大。

利用川硬皮腫腿蜂攜帶致病菌防治松墨天牛，首先要考慮致病菌對川蜂的毒力。只有天牛致病菌對川蜂的傷害較小，不會顯著降低其主動搜尋能力時，利用川蜂攜帶致病菌防治松墨天牛才有可能。進(jìn)一步對菌株和劑型開展研究，添加適宜的助劑，降低致病菌對川蜂的毒力，可為川蜂攜帶致病菌防治松墨天牛奠定良好基礎(chǔ)，有利于提高松墨天牛生物防治的實(shí)施效果。

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VirulenceDeterminationofFourMonochamusalternatusPathogensonSclerodermasichuanensis

TAO Yuan-yuan*XIANG Mao-rong LIU Hao-ze WANG Li-shun HE Yong YANG Wei**YANG Hua YANG Chun-ping

(Forest Conservation Laboratory of Forestry College，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，Sichuan，China)

Making use of Bethylidae carrying pathogens to prevent and control the longicorns could play advantage of active search of Bethylidae and strong pathogenicity of pathogens,better than releasing Bethylidae only or spraying microbial inoculum. However, it was necessary to ensure that the carrying pathogens would not significantly affect the Bethylidae’ host search ability. In order to useSclerodermasichuanensiscarrying pathogens to prevent and controlMonochamusalternatus,this paper measured the virulence of the conidial powder and spore suspensions of four strains of pathogens onS.sichuanensis. The results showed that the mortality rate of the powder spores inS.sichuanensiswas higher than that of the suspension spores. When spraying spore suspension, the cumulative mortality of four strains increased along with the increasing concentration. ForS.sichuanensis, the virulence ofBeauveriabassianawas relatively higher than that ofMetarhiziumanisopliae, and the lethal rate ofB.bassianawas also higher than that ofM.anisopliae. Research results could provide some basis data for the selection of strains and development of microbial inoculum which was useful forS.sichuanensiscarrying pathogens to prevent theM.alternatus.

Sclerodermasichuanensis，Monochamusalternatus，Beauveriabassiana，Metarhiziumanisopliae，Virulence determination

2017-01-18

四川省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項(xiàng)目201410626023。

陶園媛，女，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)專業(yè)2017屆本科生。

**通訊作者：Corresponding author, E-mail: ywei0218@aliyun.com。

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.04.007

S763.3

:A

:1003-5508(2017)04-0030-04