西藏青稞品種喜馬拉雅8號(hào)低溫處理的SSH-cDNA文庫(kù)構(gòu)建及分析

王玉林，徐齊君，原紅軍，曾興權(quán)，尼瑪扎西

(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所/省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏拉薩 850002)

西藏青稞品種喜馬拉雅8號(hào)低溫處理的SSH-cDNA文庫(kù)構(gòu)建及分析

王玉林，徐齊君，原紅軍，曾興權(quán)，尼瑪扎西

(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所/省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西藏拉薩 850002)

為進(jìn)一步研究青稞低溫抗性相關(guān)基因，以喜馬拉雅8號(hào)為材料，通過(guò)抑制差減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)的方法，構(gòu)建青稞低溫環(huán)境下的cDNA文庫(kù)，并通過(guò)nr及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選得到的高質(zhì)量EST序列進(jìn)行功能注釋。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)隨機(jī)挑選的281個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得209條高質(zhì)量ESTs序列，其中有117條序列能夠在GenBank庫(kù)中比對(duì)到同源性較高的基因或蛋白。對(duì)上述117條序列進(jìn)行GO功能注釋及KEGG代謝路徑分析，發(fā)現(xiàn)其涉及到植物的基礎(chǔ)物質(zhì)、能量代謝、光合作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面，說(shuō)明這些基因可能參與了青稞對(duì)低溫的抗性反應(yīng)。

青稞；抑制差減雜交(SSH)；低溫處理；EST

青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHK. f.)是禾本科大麥屬禾谷類作物，主要產(chǎn)自中國(guó)西藏、青海、四川、云南等地，是藏族人民的主要糧食[1]。在青藏高原地區(qū)，由于海拔較高，溫度較低，青稞在發(fā)育期往往遭受霜凍、雪、雹等迫害，但其仍能夠很好地生長(zhǎng)[2]。因此，西藏青稞在作物耐寒性的研究中是一個(gè)很好的遺傳資源庫(kù)。發(fā)掘青稞耐寒基因并研究其耐寒機(jī)制，對(duì)后續(xù)研究其他作物低溫調(diào)控相關(guān)基因以及其調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

抑制差減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)是由Diatchenko等建立的通過(guò)DNA差減雜交和抑制PCR技術(shù)相結(jié)合高效鑒定和分離克隆差異表達(dá)基因的一門技術(shù)[3-5]。本研究以青稞喜馬拉雅8號(hào)為材料，利用SSH技術(shù)，構(gòu)建青稞在常溫和低溫處理下的差減cDNA文庫(kù)，并通過(guò)nr及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選得到的高質(zhì)量EST序列進(jìn)行功能注釋，以期為進(jìn)一步研究青稞低溫抗性相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試青稞材料為喜馬拉雅8號(hào)，由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)研究所提供。

1.2 低溫處理

將供試材料種子播種于塑料盆缽(170 mm×220 mm)中，在溫室中生長(zhǎng)至3葉期后轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)箱(PRX-450D,Safe,Ningbo,China)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度20/15 ℃(光/暗)，光周期12 h，光照強(qiáng)度225±25 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度75%。

待幼苗第三葉完全展開(kāi)時(shí)，取部分植株于3/1 ℃(光/暗)的培養(yǎng)箱中冷馴化處理5 d。冷馴化結(jié)束后，進(jìn)行低溫處理，即先在-2 ℃下處理4 h，隨后以2 ℃·h-1的速率降溫至-8 ℃，并在該溫度下黑暗處理18 h，再以2 ℃·h-1的速率升溫至-2 ℃，繼續(xù)處理15 h，最后把植株全部轉(zhuǎn)移至正常溫度的培養(yǎng)箱。

1.3 總RNA的提取及cDNA的合成

待喜馬拉雅8號(hào)長(zhǎng)至四葉期時(shí)，分別選取經(jīng)低溫處理和常溫處理的葉片，采用Trizol(TaKaRa)法抽提總RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量和濃度，參照Oligotex(Qiagen)的操作方法分離和純化mRNA。根據(jù)SMART PCR cDNA Synthesis Kit (Clothtech)操作方法，將mRNA合成cDNA。

1.4 抑制差減雜交及PCR產(chǎn)物的克隆

對(duì)1.3中所得cDNA進(jìn)行純化，并在RsaⅠ酶切下產(chǎn)生比較短的平端片段，便于下一步的接頭連接和差減雜交，具體操作參照PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clothtech)說(shuō)明書。分別以低溫處理所得cDNA作為driver，常溫處理所得cDNA作為tester，以及以常溫處理所得cDNA作為driver，低溫處理所得cDNA作為tester，進(jìn)行兩種差減雜交，將兩種差減雜交的第2次PCR產(chǎn)物純化后與pMD-18T(Takara)連接，構(gòu)建兩個(gè)抑制差減cDNA文庫(kù)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含X-gal/IPTG和Amp的瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑取200個(gè)白色克隆，37 ℃條件下培養(yǎng)5 h以上，取1 μL菌液作模板，用引物Nested primer 1/Nested primer 2R進(jìn)行PCR檢測(cè)，鑒定差減雜交cDNA片段。將鑒定正確的陽(yáng)性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性10 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)。

1.5 序列分析

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中Blastn和Blastx對(duì)所得ESTs序列進(jìn)行同源核苷酸和蛋白序列比對(duì)分析，并對(duì)所獲得的ESTs序列進(jìn)行GO功能注釋和KEGG代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 所提取的總RNA和mRNA的質(zhì)量

上述1.3中所提取的經(jīng)低溫和常溫處理的葉片總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，大部分RNA集中在18S和28S rRNA區(qū)域，且28S的亮度約為18S的1.5～2.0倍，表明所提取總RNA完整性較好(圖1A)。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280的比值，結(jié)果均在1.85～2.10之間，說(shuō)明總RNA純度較高。純化后的mRNA呈現(xiàn)出彌散狀的亮帶，說(shuō)明mRNA質(zhì)量良好(圖1B)。

M:Marker;1：低溫處理；2：常溫處理。圖2中同。

2.2 雙鏈cDNA的合成及RsaⅠ酶切效果

將純化后的兩種mRNA按照SMART cDNA文庫(kù)合成的方法合成雙鏈cDNA。取5 μL雙鏈cDNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，片段主要分布于100～2 000 bp(圖 2A)。用RsaⅠ酶切3 h，產(chǎn)物主要集中在100～700 bp(圖2B)，即長(zhǎng)片段得到有效地消化，說(shuō)明酶切效果好。

2.3 差減文庫(kù)的構(gòu)建及鑒定結(jié)果

兩次差減雜交得到的差異片段進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增后，將第2次的產(chǎn)物與pMD18-T連接，構(gòu)建兩個(gè)抑制差減cDNA文庫(kù)。從每個(gè)差減cDNA文庫(kù)隨機(jī)挑取200個(gè)克隆，用引物Nested primer 1/Nested primer 2R進(jìn)行PCR鑒定后，分別篩選到145和136個(gè)陽(yáng)性克隆，插入片段長(zhǎng)度主要分布于150～500 bp(圖3)。

2.4 ESTs序列分析

對(duì)281個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，一共獲得209條高質(zhì)量ESTs序列。將得到的209條ETSs序列與GenBank的非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(kù)和非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果表明，其中66條序列無(wú)法比對(duì)到同源序列，可能是新基因；117條序列能夠在核酸和蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中有較高的同源性，其中，在大麥、小麥、山羊草、栗米、蒺藜狀苜蓿、二穗短柄草等物種中具有較高的同源性(圖4)。

圖2 雙鏈cDNA(A)及其酶解后(B)的電泳圖譜

M:Marker;A和B分別表示以常溫處理和低溫處理所得cDNA為tester。

根據(jù)在nr數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果，對(duì)成功注釋的117條ESTs序列進(jìn)行GO功能注釋。結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)，這些序列主要在生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成及分子功能這三大類功能中被注釋，如在生物學(xué)過(guò)程中主要在細(xì)胞生理生化、生物的代謝過(guò)程及組織信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮作用；在細(xì)胞組成這一大類中，主要參與構(gòu)成一些細(xì)胞、組織、器官等；同時(shí)，在分子功能中主要發(fā)揮著結(jié)合和催化等作用。

通過(guò)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)，可以分析被注釋的ESTs序列在青稞代謝途徑中的富集情況。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的分類，可以簡(jiǎn)單的將被注釋的117條ESTs序列中的101條序列歸類到全部的7大類代謝通路中，其中被注釋到新陳代謝和遺傳信息處理過(guò)程的ESTs序列最多，分別有53條(包括氨基酸代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、碳水化合物代謝、能量代謝、總覽和概述圖、脂質(zhì)代謝、輔酶和維生素代謝、其他氨基酸代謝、核苷酸代謝)和30條(包括折疊、排序和退化、DNA復(fù)制及損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻譯)，占總注釋ESTs的52.5%和29.7%(圖6)。對(duì)注釋到7大類代謝通路的序列作進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中參與蛋白翻譯、碳水化合物代謝、能量代謝、蛋白折疊修飾的ESTs序列占據(jù)主導(dǎo)地位，分別有11、10、11、14條，各占整個(gè)注釋的代謝通路的10.89%、9.90%、10.89%、13.86%。將這結(jié)果與GO功能注釋的結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，參與基礎(chǔ)代謝的這些序列在功能上具有一定相關(guān)性，并在此證明注釋結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)也可以表明植物對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程是一個(gè)由多系統(tǒng)調(diào)控的生物過(guò)程。

1：大麥；2：烏拉圖小麥；3：山羊草；4：小麥；5：粟米；6：蒺藜狀苜蓿；7：二穗短柄草；8：玉米；9：歐洲油菜；10：粳稻；11：?jiǎn)瘟Ｐ←湥?2：菜豆；13：煙草；14：霍爾斯單軸霉；15：大豆疫霉菌；16：野生二棱大麥；17：高粱；18：香瓜；19：秈稻；20：三蕊草；21：雷蒙德氏棉；22：直立雀麥；23：鷹嘴豆；24：其他。

1：生物調(diào)節(jié)；2：組織細(xì)胞組成或生物合成；3：細(xì)胞生理進(jìn)程；4：脫毒作用；5：生物發(fā)育過(guò)程；6：生長(zhǎng)進(jìn)程；7：定位；8：代謝進(jìn)程；9：多生物進(jìn)程；10：多細(xì)胞生物進(jìn)程；11：負(fù)調(diào)控生物進(jìn)程；12：正調(diào)控生物進(jìn)程；13：生物進(jìn)程調(diào)控；14：繁殖；15：生殖進(jìn)程；16：刺激反應(yīng)；17：信號(hào)通路；18：有機(jī)體信號(hào)進(jìn)程；19：細(xì)胞；20：細(xì)胞組成；21：胞外區(qū)；22：細(xì)胞外區(qū)域組成；23：大分子復(fù)合物；24：細(xì)胞膜；25：細(xì)胞膜組成；26：膜內(nèi)腔；27：細(xì)胞器；28：細(xì)胞器組成；29：病毒體；30：病毒粒子部分；31：抗氧化性；32：結(jié)合；33：催化作用；34：分子功能調(diào)節(jié)；35：核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；36：結(jié)構(gòu)分子活性；37：轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)綁定；38：轉(zhuǎn)運(yùn)活性。

1：運(yùn)輸和分解代謝；2：信號(hào)傳導(dǎo)；3：折疊、排序和退化；4：DNA復(fù)制及損傷修復(fù)；5：轉(zhuǎn)錄；6：翻譯；7：內(nèi)分泌代謝疾?。?：氨基酸代謝；9：其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成；10：碳水化合物代謝；11：能量代謝；12：總覽和概述圖；13：脂質(zhì)代謝；14：輔酶和維生素代謝；15：其他氨基酸代謝；16：核苷酸代謝；17：環(huán)境適應(yīng)性。

3 討 論

已有研究表明，植物對(duì)低溫、干旱等一些逆境脅迫環(huán)境的響應(yīng)都是通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)及基因調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，而在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，蛋白激酶及鋅指轉(zhuǎn)錄因子是這一過(guò)程的主要成分[6]。如核糖體蛋白激酶，位于促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路下游，參與植物對(duì)逆境響應(yīng)蛋白的合成過(guò)程[7]。2001年，Kim等[8]在大豆中研究發(fā)現(xiàn)，大豆的鋅指環(huán)蛋白SCOF-1定位在核內(nèi)，可以增強(qiáng)SGBF-1與DNA啟動(dòng)子區(qū)順勢(shì)作用元件的結(jié)合力，提高對(duì)冷調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)作物對(duì)低溫的抵御能力。除了通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程對(duì)植物逆境進(jìn)行調(diào)控外，植物體內(nèi)的一些活性氧自由基等也可以通過(guò)調(diào)控生物膜的構(gòu)成進(jìn)而對(duì)植物逆境調(diào)節(jié)起到重要作用，如過(guò)氧化氫酶(CAT)、金屬硫蛋白等[9-10]。還有研究表明，當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí)，質(zhì)膜會(huì)通過(guò)構(gòu)象的變化，改變細(xì)胞膜的通透性，抵御外界環(huán)境的變化，同時(shí)也會(huì)對(duì)植物的物質(zhì)運(yùn)輸造成一定的影響[11-15]。與此同時(shí)，植物對(duì)低溫適應(yīng)機(jī)理方面的酶分子多態(tài)性的研究成果表明，植物抗低溫水平的變化是與許多酶系統(tǒng)構(gòu)型變化、同工酶的改組及功能活力的改變有關(guān)，如光合作用過(guò)程中的關(guān)鍵酶丙酮酸磷酸雙激酶，在低溫環(huán)境下，其構(gòu)象會(huì)由四聚體結(jié)構(gòu)變?yōu)槎垠w結(jié)構(gòu)，影響酶的活性變化，從而對(duì)植物的碳水化合物代謝過(guò)程產(chǎn)生影響[16-20]。在前人研究基礎(chǔ)上，本研究對(duì)獲得的ESTs序列，通過(guò)NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)及Blast2GO功能分類注釋，根據(jù)細(xì)胞組成分析，發(fā)現(xiàn)其差異基因主要集中在細(xì)胞、細(xì)胞膜及細(xì)胞器中；根據(jù)分子功能分類，所占比例較多的為一些具有結(jié)合和催化功能的基因；而在生物學(xué)進(jìn)程中的分類，主要集中在一些基礎(chǔ)代謝及信號(hào)傳遞分類中。從以上分析結(jié)果可以初步確定，構(gòu)建的青稞cDNA差減文庫(kù)中的部分克隆序列所包含的基因與低溫或其他逆境相關(guān)，由此可以確定構(gòu)建的差減文庫(kù)為一個(gè)低溫差減cDNA文庫(kù)。但是，對(duì)所克隆得到的基因的分子功能仍不得而知，我們可以通過(guò)分子生物學(xué)手段，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行分子功能驗(yàn)證，以期闡明青稞在低溫環(huán)境下的分子調(diào)控機(jī)理。

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ConstructionandAnalysesofSSHLibraryofTibetanHullessBarley(HordeumvulgareL.var.nudumHK.f.)Ximalaya8underLowTemperatureTreatment

WANGYulin,XUQijun,YUANHongjun,ZENGXingquan,TASHINyima
(Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences/State Key Laboratory of Barley and Yak Germplasm Resources and Genetic Improvement,Lhasa,Tibet 850002,China)

In order to analyze the related genes response to low temperature in barley further,a barley cDNA library under low temperature treatment was constructed using suppression substractive hybridization(SSH),with Ximalaya 8 as research materal.From the cDNA library,we randomly selected 281 positive clones,and sequenced 209 high quality ETSs,of which 117 sequences had homologous genes or proteins when blasted in GenBank.These 117 genes were related to basic material,energy metabolism,photosynthesis and signal transduction by the analysis in nr and KEGG databases.It is indicated that these genes are likely to be involved in the cold tolerance of barley.

Hullless barely; Suppression subtractive hybridization (SSH); Low temperature treatment; EST

時(shí)間：2017-08-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170808.0911.008.html

2016-12-14

2017-06-18

西藏財(cái)政專項(xiàng)(2015CZZX001;Z2016B01N01);國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究專項(xiàng)(Z2016D03G01)

E-mail：wangyulin8609@126.com

尼瑪扎西(E-mail：nima_zhaxi@sina.com)

S512.3；S330

： A

：1009-1041(2017)08-1025-06