高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)在飼料分析中的應(yīng)用和重要作用

呂麗卿，劉曉玥

（北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司，北京 101105）

高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)在飼料分析中的應(yīng)用和重要作用

呂麗卿，劉曉玥

（北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司，北京 101105）

高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)作為飼料成分檢測(cè)手段已被廣泛應(yīng)用和認(rèn)可，其涉及的檢測(cè)領(lǐng)域涉及飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、氨基酸、藥物殘留、真菌毒素和三聚氰胺等。在飼料國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中高效液相色譜法是應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)技術(shù)，可見此技術(shù)在儀器分析中發(fā)揮著重要的作用，具有很廣闊的應(yīng)用前景。

高效液相色譜；飼料；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；分析；應(yīng)用

高效液相色譜法目前是飼料檢測(cè)中應(yīng)用最廣泛的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)，隨著飼料行業(yè)在中國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈中的不斷提升，預(yù)混料生產(chǎn)企業(yè)也都要求具備此檢測(cè)設(shè)備，如何讓它的能力發(fā)揮出來，是全體飼料檢測(cè)工作者的責(zé)任和使命。

1 高效液相色譜技術(shù)介紹

1.1 高效液相色譜發(fā)展歷程

液相色譜定義是二十世紀(jì)早期由俄羅斯植物學(xué)家Mikhail S·茨維特提出的。他最先嘗試在裝滿顆粒的柱子上使用溶劑來分離從植物中提取的化合物。茨維特用顆粒填滿開口的玻璃柱。他發(fā)現(xiàn)兩種特殊的材料，粉筆末和氧化鋁很有用。他將樣品倒入柱中，并讓樣品流過顆粒床，隨后加入純?nèi)軇?，隨著樣品由于重力自上而下流過柱子，可看到不同顏色的譜帶被分開，因?yàn)橛行┙M分比另外一些移動(dòng)得快。他將這些分開的不同顏色的譜帶與樣品中原有的不同化合物相關(guān)聯(lián)。他還根據(jù)每一種化合物對(duì)填料的化學(xué)親和性強(qiáng)弱，提出了分析這些化合物的分離規(guī)律。與顆粒填料有較強(qiáng)親和性的化合物移動(dòng)慢，與溶劑有較強(qiáng)親和性的化合物移動(dòng)快。這個(gè)過程可這樣描述：樣品中的化合物在流動(dòng)的溶劑（流動(dòng)相）與固體顆粒（固定相）間的分布不一樣。這樣使每一種化合物以不同的速度移動(dòng)，從而產(chǎn)生了化合物之間的分離。高效液相色譜（HPLC）是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末期迅速發(fā)展起來的用于有機(jī)物定量分析的儀器分析方法。HPLC是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，采用全多孔或非多孔高效微粒（1.7～10μm）固定相制備的色譜柱，由高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，用高靈敏度檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了高柱效、高選擇性和高靈敏度的快速分析，已成為有機(jī)物定量分析的主要分析工具。

高效液相色譜對(duì)樣品的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來分析。

1.2 高效液相色譜分析原理

（1）高效液相色譜分析流程。由泵將儲(chǔ)液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測(cè)量之后，導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測(cè)物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)信號(hào)由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，而HPLC改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。

（2）高效液相色譜的分離過程。同其他色譜過程一樣，HPLC也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。

開始樣品加在柱頭上，假設(shè)樣品中含有3個(gè)組分，A、B和C，隨流動(dòng)相一起進(jìn)入色譜柱，開始在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行分配。分配系數(shù)小的組分A不易被固定相阻留，較早地流出色譜柱。分配系數(shù)大的組分C在固定相上滯留時(shí)間長(zhǎng)，較晚流出色譜柱。組分B的分配系數(shù)介于A、C之間，第二個(gè)流出色譜柱。若一個(gè)含有多個(gè)組分的混合物進(jìn)入系統(tǒng)，則混合物中各組分按其在兩相間分配系數(shù)的不同先后流出色譜柱，達(dá)到分離的目的。

（3）高效液相色譜的數(shù)據(jù)采集處理。當(dāng)分開的化合物譜帶離開色譜柱后，進(jìn)入檢測(cè)器。檢測(cè)器帶有可以在流動(dòng)相背景下檢測(cè)到每個(gè)分開的化合物譜帶的流通池。一個(gè)合適的檢測(cè)器有能力辨別化合物的存在，并發(fā)送相應(yīng)的信號(hào)到計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)站。

2 高效液相色譜在飼料分析與檢測(cè)中的應(yīng)用

飼料成分非常復(fù)雜。一般將飼料成分分為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)兩大類，高效液相色譜在分析這兩類物質(zhì)分子組成和含量上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

2.1 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分析中的應(yīng)用

（1）檢測(cè)飼料中維生素。維生素是一種維持動(dòng)物正常生理功能所必需的低分子有機(jī)化合物。與其他營(yíng)養(yǎng)素相比，動(dòng)物所需維生素的量很少，通常以微克（ug）或毫克（mg）計(jì)。但維生素又不同于微量元素，因?yàn)橛袡C(jī)化合物，也與構(gòu)成動(dòng)物生長(zhǎng)的身體物質(zhì)和貯存物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)素不同。缺乏維生素可引起動(dòng)物代謝紊亂，影響動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能。動(dòng)物獲得維生素最主要的途徑是飼料。目前情況下添加人工合成的維生素類飼料添加劑是補(bǔ)充飼料維生素含量不足的最主要途徑。按照溶解性，維生素可分為脂溶性維生素和水溶性維生素。除了氯化膽堿外，全部單一維生素均可運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定，如VA、VD3、VE、VK3、VC、VB2、VB12等。

表1 維生素單體高效液相色譜法檢測(cè)方法匯總

（2）檢測(cè)飼料中氨基酸。動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)的需求本質(zhì)上是對(duì)氨基酸的需求。因此飼料中氨基酸的種類和含量是衡量其質(zhì)量高低的一項(xiàng)重要指標(biāo)。氨基酸的測(cè)定方法很多，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18246-2000）對(duì)飼料中氨基酸測(cè)定采用柱后衍生、用茚三酮作為衍生劑試劑的離子交換色譜法。而色氨酸的測(cè)定，目前多采用不同濃度、不同種類強(qiáng)堿水解樣品，再用比色法或高效液相色譜法（HPLC）等定量。安捷倫公司分析方法推薦用鄰苯二甲醛、9-芴甲基氯甲酸酯（OPA-FMOC）柱前衍生反相高效液相色譜法，以C18氨基酸分析柱，紫外檢測(cè)器，30min內(nèi) 17種氨基酸得到了分離。氨基酸濃度在 10～1000 pmol/μL范圍內(nèi)，其峰面積與氨基酸濃度的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.996。17種氨基酸的加標(biāo)回收率在83.9%～109.8%范圍內(nèi)。

（3）檢測(cè)飼料中有機(jī)酸。飼料添加劑中有酸化劑的使用已被廣泛認(rèn)可，但隨著價(jià)格的差異，也會(huì)存在一些摻假問題，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的滴定方法無法區(qū)分酸性物質(zhì)的種類，故高效液相色譜法的應(yīng)用，解決了這個(gè)問題，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)有機(jī)酸的檢測(cè)進(jìn)行了規(guī)定：飼料中丙酸和丙酸鹽的測(cè)定GB/T 17815-1999；飼料中酸化劑檸檬酸、富馬酸和乳酸的測(cè)定GB/T 23877-2009。在實(shí)際的檢測(cè)工作中有很好的指導(dǎo)意義。

2.2 非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分析中的應(yīng)用

（1）檢測(cè)飼料中多種β-興奮劑。β-興奮劑是從天然兒茶酚胺衍生合成的一類化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇類衍生物，大體分為苯胺型（如克倫特羅等）、苯酚型（如沙丁胺醇、萊克多巴胺等）、苯二酚型（如特布他林、鹽酸多巴胺等）三大類。大量研究表明，在動(dòng)物日糧中β-興奮劑可以提高飼料轉(zhuǎn)化率和增加瘦肉率，長(zhǎng)期使用該類化合物會(huì)嚴(yán)重危害動(dòng)物的肝臟、腎臟等內(nèi)臟器官，且在動(dòng)物內(nèi)臟器官中的存留時(shí)間較長(zhǎng)，一般烹飪過程很難使其失活，所以β-興奮劑可通過食物鏈進(jìn)入體內(nèi)，嚴(yán)重危害人類健康。除了美國(guó)食品與藥物管理局（FDA，2004）批準(zhǔn)僅萊克多巴胺可應(yīng)用于豬和牛飼料外，其它歐美國(guó)家均禁用該類藥物。我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)（2002）規(guī)定嚴(yán)禁在畜牧生產(chǎn)上使用各種β-興奮劑類藥物。飼料中β-興奮劑的相關(guān)檢測(cè)方法較多，對(duì)鹽酸克倫特羅HPLC及GC-MS測(cè)定方法進(jìn)行了比較，表明HPLC可作為一般定量測(cè)定方法，與GC-MS一起作為仲裁法，現(xiàn)兩種方法均已作為農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)頒布實(shí)施。

（2）檢測(cè)飼料中的真菌毒素。①飼料中的真菌毒素——黃曲霉毒素，它是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的，主要包括B1、B2、G1和G2這4種毒素，其中，B1是毒性最強(qiáng)和危害最大的一種，B2和G2分別是B1和G1的雙羥基衍生物。當(dāng)前，飼料中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法主要采用薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、免疫親和柱法以及熒光光度法等，隨著HPLC技術(shù)應(yīng)用的日益普及，選用免疫親和層析柱凈化、高效液相色譜熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)的方法對(duì)飼料中黃曲霉毒素 B1、B2、G1和G2進(jìn)行檢測(cè)研究。②飼料中的真菌毒素——T-2毒素，主要由鐮孢菌屬產(chǎn)生，其檢測(cè)方法較多。目前，免疫親和柱凈化結(jié)合高效液相色譜法應(yīng)用效果較好。③飼料中的真菌毒素——玉米赤霉烯酮（ZEN），又稱F2毒素，由鐮刀菌屬產(chǎn)生的一種真菌毒素，可引起人和動(dòng)物雌激素過多綜合癥，具有生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、基因毒性及可疑致癌性等。ZEN主要污染玉米、小麥等谷物類作物及其產(chǎn)品，由于其毒性，我國(guó)規(guī)定人用的小麥、玉米中ZEN含量不超過60μg/kg，飼料中ZEN含量不超過500μg/kg。國(guó)標(biāo)GB/T 1954-2004規(guī)定，玉米赤霉烯酮的測(cè)定方法有薄層色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法，但這些方法的樣品提取操作繁瑣耗時(shí)，需消耗大量的有機(jī)溶劑。近年來樣品處理方法不斷得到改進(jìn)，同時(shí)結(jié)合高效液相色譜法的測(cè)定方法得到廣泛應(yīng)用。

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)在真菌毒素中檢測(cè)方法匯總?cè)绫?所示。

表2 真菌毒素檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)匯總

（3）檢測(cè)飼料中的抗生素。飼料產(chǎn)品中抗生素藥物殘留問題一直是飼料執(zhí)法部門抽查的核心內(nèi)容，生產(chǎn)過程中的交叉污染、配方中使用過量等情況，都會(huì)造成飼料產(chǎn)品中存在不符合規(guī)定的藥物添加問題。液相色譜法是最佳的檢測(cè)手段，它為藥物含量及藥物殘留的檢出提供了儀器保障。也為飼料產(chǎn)品質(zhì)量安全提供了保障，企業(yè)可以自行完成各環(huán)節(jié)監(jiān)察工作。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中在藥物檢測(cè)方法的規(guī)定最為全面，包括四環(huán)素類、氯霉素類、聚醚類、多肽類及化學(xué)合成類藥物，高效液相色譜可以在此領(lǐng)域的檢測(cè)發(fā)揮到極致。

（4）檢測(cè)飼料中的三聚氰胺。三聚氰胺（melamine）簡(jiǎn)稱三胺，又名蜜胺，學(xué)名三聚酰胺，是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，由于其分子中含有大量氮元素，而普通的全氮測(cè)定法不能排除這類偽蛋白氮的干擾，因而一些廠商為了降低成本而添加這種化工原料，以提高產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量。作為飼料中的非法添加，已得到廣泛關(guān)注，國(guó)家法律規(guī)定飼料中三聚氰胺含量小于2.5ppm，并制定了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2071-2011飼料中三聚氰胺的測(cè)定，為飼料檢測(cè)工作中起到了很好的指導(dǎo)作用。

隨著飼料業(yè)的不斷發(fā)展、現(xiàn)代儀器的不斷進(jìn)步和在飼料企業(yè)中的廣泛應(yīng)用，高效液相色譜技術(shù)發(fā)揮著非常重要的作用，它應(yīng)用廣泛，適用領(lǐng)域?qū)?，改進(jìn)和提升的空間較大，越來越被檢測(cè)人員所重視和推崇，液相色譜檢測(cè)技術(shù)已不再高深和無法駕馭，它也在隨著時(shí)代的步伐慢慢靠近人們?nèi)粘５臋z測(cè)工作中，成為最可信任的檢測(cè)工作，為產(chǎn)品安全提供最有效地保障，在飼料分析檢測(cè)中發(fā)揮更加廣泛的作用，做出更加卓越的貢獻(xiàn)。

［1］王傳蓉.高效液相色譜技術(shù)在飼料分析中的應(yīng)用［J］.中國(guó)乳業(yè)，2012，130（10）：46-48.

［2］王玲，楊璐玲，孫國(guó)強(qiáng).高效液相色譜技術(shù)在飼料分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)飼料，2016，（6）：31-39.

呂麗卿，主要研究方向：飼料。