糖尿病視網(wǎng)膜病變與MMP-7基因多態(tài)性的相關性

楊 潔，張鐵民，董微麗，馬英慧，賈淑君

（承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科，河北承德 067000）

糖尿病視網(wǎng)膜病變與MMP-7基因多態(tài)性的相關性

楊 潔，張鐵民，董微麗，馬英慧，賈淑君

（承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院眼科，河北承德 067000）

目的:探討基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）-181A/G基因多態(tài)性與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）發(fā)病風險的關系。方法：400例糖尿?。―M）患者根據(jù)是否合并DR分為DM組（205例）和DR組（195例），選取同期健康體檢者261例作為對照組。采用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)-聚合酶鏈反應(PCR)檢測三組受試者MMP-7-181A/G基因多態(tài)性。結果：三組受試者A、G等位基因頻率，A/A、A/G、G/G基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。并且，與A/G+A/A基因型相比，攜帶G/G基因型不會增加2型糖尿病DR的發(fā)病風險。結論：MMP-7-181A/G基因多態(tài)性與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病無關。

基質(zhì)金屬蛋白酶-7；基因多態(tài)性；糖尿病視網(wǎng)膜病變

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是2型糖尿病常見的并發(fā)癥之一，也是導致2型糖尿病患者視力喪失的最主要原因，嚴重影響了糖尿病患者的生活質(zhì)量，但發(fā)病機制至今尚未完全闡明[1]。在我國，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率已達3.2%，DR也相應地成為近十年來我國發(fā)病率急劇升高的主要疾患[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinases，MMP-7）可降解細胞外基質(zhì)和基底膜，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、凋亡、血管生成等過程。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-7-181A/G基因多態(tài)性與多種疾病有關[3-4]。本研究采用病例-對照的方法，探討了MMP-7-181A/G基因多態(tài)性與DR發(fā)病風險的相關性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2014年5月至2015年8月我院收治的2型糖尿病患者400例，均符合1999年WHO關于糖尿病的診斷標準[5]。其中單純糖尿病組（DM組）205例，男104例、女101例，平均年齡（48.05±11.28）歲；糖尿病視網(wǎng)膜病變組（DR組）195例，男100例、女95例，平均年齡（49.26±10.95）歲。選擇同期我院健康體檢者261例為對照組（Control組），男132例、女129例，平均年齡（47.25±11.78）歲。本研究經(jīng)承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均告知研究目的并簽署知情同意書。

所有受試者均為中國北方漢族人，均接受詳細的眼科檢查，包括：最佳矯正視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡、眼底鏡、眼底照相等。如眼底照相可疑為DR的受試者，行眼底血管造影檢查以確診DR，DR的診斷標準參照文獻[6]。記錄所有受試者的性別、年齡、身高、體重、體重指數(shù)、收縮壓、舒張壓等指標。

三組受試者一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1：

表1 三組受試者一般資料比較

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提?。菏占渴茉囌咄庵苎獦吮?ml，EDTA抗凝，-80℃保存，蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法提取基因組DNA[7]。

1.2.2 MMP-7基因分型：采用RFLP-PCR法對MMP-7基因A-181G多態(tài)位點進行基因分型。引物設計參考文獻[3]，上游引物5'-TGGTACCATAATGTCCTGAATG-3'，下游引物：5'-TCGTTATTGGCAGGAAGCACACAATG AATT- 3'。PCR反應體系為20μl，包括滅菌去離子水10.4μl，10×PCR緩沖液2.4μl，PCR染料2.4μl，DNA模板2.0μl，Taq DNA聚合酶0.4μl，三磷酸脫氧核糖核酸（dNTPs）0.4μl和上下游引物各1.0μl。PCR反應條件：預變性94℃5min，變性94℃ 30s，退火溫度55.5℃ 45s，延伸72℃ 30s，共35個循環(huán)，最后延伸7min。PCR擴增產(chǎn)物在限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ37℃消化過夜后，用2%瓊脂糖凝膠電泳分析MMP-7基因型。MMP-7-181A/G的G/G基因型為120bp和30bp，A/A基因型為150bp，A/G基因型為150bp、120bp和30bp。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)

資料用率表示，組間比較采用行×列表的卡方檢驗。不同基因型的相對風險度用優(yōu)勢比（odd ratio，OR）及95%可信區(qū)間（CI）表示。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MMP-7基因型頻率分布 符合Hardy-Weinberg定律，觀測值和理論值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明能夠達到遺傳平衡，具有很好的群體代表性。見表2：

表2 MMP-7基因型頻率的Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗

2.2 MMP-7啟動子區(qū)-181A/G基因多態(tài)性與DR的關系 三組受試者A、G等位基因頻率，A/A、A/G、G/G基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3：

表3 三組受試者MMP-7-181A/G 單核苷酸多態(tài)性的基因型及等位基因型頻率[n(%)]

2.3 MMP-7-181A/G單核苷酸多態(tài)性與DR發(fā)病風險的關系Control組與DR組比較，經(jīng)校正的OR=1.198(0.454-3.163)；DM組與DR組比較，經(jīng)校正的OR=1.210(0.430-3.403)（表4）。與A/G+A/A基因型相比，攜帶G/G基因型不會增加2型糖尿病DR的發(fā)病風險。

表4 MMP-7-181A/G單核苷酸多態(tài)性與DR發(fā)病風險的關系

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是高度保守的依賴于鋅離子的蛋白水解酶家族，可由多種細胞分泌，能降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中的多種成分，也可通過激活其它MMPs發(fā)揮作用。MMPs基因啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism，SNPs)可通過影響蛋白質(zhì)的表達和基因轉(zhuǎn)錄，從而影響多種疾病的發(fā)生、發(fā)展及預后[8]。MMP-7是MMPs家族的重要成員，可降解Ⅳ型膠原、彈力素、明膠、纖粘連蛋白和層粘連蛋白等基底膜和ECM的重要成分，其過度表達與口腔鱗癌、肺癌、食管癌、胃癌、結直腸癌、宮頸癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[9-11]。

基因多態(tài)性是指在一個生物群體中，同時和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因，也稱遺傳多態(tài)性。從本質(zhì)上講，多態(tài)性的產(chǎn)生在于基因水平上的變異，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白的區(qū)域和沒有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域。SNPs即散在的單個堿基的不同，基因組中單核苷酸的缺失、插入與重復序列不屬于SNP，更多的是單個堿基的置換。人類MMP-7基因位于染色體11q21-q22，包含6個外顯子，總長度約9.6kb。通過對MMP-7基因啟動子區(qū)掃描發(fā)現(xiàn)了多種SNPs，其中181A/G備受關注。MMP-7基因啟動子區(qū)-181bp處A→G突變(-181A/G)可通過產(chǎn)生熱驚厥轉(zhuǎn)錄因子(HSTF)的結合序列NGAAN而改變啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，使mRNA的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，影響MMP-7蛋白的表達，與多種疾病的遺傳易感性有關[12]。基因多態(tài)性與DR發(fā)病風險之間的關系比較復雜，受地域、種族，以及不同基因之間相互作用等因素的影響。本研究顯示，MMP-7基因啟動子區(qū)-181A/G的SNPs與DR的發(fā)病無關，提示MMP-7基因啟動子區(qū)-181A/G可能不參與DR的發(fā)生。但本組病例數(shù)相對較少，有待增加病例數(shù)進一步研究證實。

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CORRELATIONS BETWEEN DIABETIC RETINOPATHY AND POLYMORPHISM OF MMP-7 GENE

YANG Jie, ZHANG Tie-min, DONG Wei-li, et al

(Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the risk of diabetic retinopathy (DR) and polymorphism of matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) -181A/G gene.Methods:400 diabetes mellitus (DM) patients were divided into DM group (n=205) and DR group (n=195) according to whether combined DR; 261 cases of healthy controls were taken as control group. RFLP-PCR was used to detect the polymorphism of MMP-7-181A/G gene of subjects in 3 groups.Results:There was no statistical significance about A, G allele frequency, and A/A, A/G, G/G genotype frequency among 3 groups (P＞0.05). Moreover, compared with A/G+A/A genotype, carrying the G/G genotype didn’t increase the risk of DR.Conclusions:The MMP-7-181A/G gene polymorphism has no relations with retinopathy of type 2 diabetes mellitus.

Matrix metalloproteinases-7; Gene polymorphism; Diabetic retinopathy

R587.2

A

1004-6879（2017）05-0366-03

2016-11-09）