• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    桂野生山金柑的倍性分析和SSR分子鑒定

    2017-09-15 07:32:06李果果劉要鑫柴利軍葉俊麗麥彩勝歐智濤陳香玲
    西南農(nóng)業(yè)學(xué)報 2017年8期
    關(guān)鍵詞:柑橘種質(zhì)多態(tài)性

    李果果,劉要鑫,柴利軍,葉俊麗,麥彩勝,歐智濤,陳香玲*

    桂野生山金柑的倍性分析和SSR分子鑒定

    李果果1,劉要鑫1,柴利軍2,葉俊麗2,麥彩勝3,歐智濤1,陳香玲1*

    (1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/農(nóng)業(yè)部南寧南亞熱帶果樹科學(xué)觀測實驗站,廣西南寧 530007;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室,湖北武漢 430070;3.東興市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,廣西東興 538100)

    【目的】研究‘桂野生山金柑’的遺傳學(xué)特性,為柑橘種質(zhì)資源的鑒定及創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。【方法】采用倍性分析和SSR標(biāo)記相結(jié)合,對‘桂野生山金柑’進行遺傳鑒定分析。【結(jié)果】倍性分析結(jié)果表明‘桂野生山金柑’是二倍體;從24對SSR引物中篩選出6對重復(fù)性好、條帶清晰、多態(tài)性強的核基因組引物,在供試材料中獲得等位基因條帶共30條,其中具有多樣性差異條帶25條,多態(tài)性比例為79.17%。聚類分析的結(jié)果表明不同供試材料的遺傳相似系數(shù)在0.600~0.802。【結(jié)論】‘桂野生山金柑’具有遺傳特異性,不同于其他地區(qū)起源的山金柑或金柑,是一種新的柑橘種質(zhì)資源。

    桂野生山金柑;倍性分析;SSR分子標(biāo)記;聚類分析

    【研究意義】山金柑(Fortunella hindsii Swingle)為蕓香科金柑屬植物,別名山金豆、山金橘、山橘、香港金橘[1],植株一年多次開花結(jié)果,果實成熟時金黃色,掛果期長,觀賞性高[2]。近年來隨著人類活動的不斷擴大和生態(tài)環(huán)境的嚴重惡化,山金柑分布范圍、面積、數(shù)量、種類都銳減,部分地區(qū)物種已消失殆盡。山金柑資源中存在單胚性植株[1]、四倍體植株[2]和實生苗早花早果特性植株[3],是柑橘雜交育種和基因組學(xué)研究的良好材料。因此,收集山金柑資源并從分子水平上進行研究,對柑橘優(yōu)良品種的選育具有重要意義?!厩叭搜芯窟M展】隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,DNA分子標(biāo)記技術(shù)在許多果樹遺傳多樣性研究中得到了廣泛應(yīng)用[4-7]。SSR(simple sequence repeat)是一類由1~6個核苷酸為重復(fù)單位序列組成的串聯(lián)重復(fù)序列,其標(biāo)記需要的DNA量少,對DNA質(zhì)量要求不高,具有共顯性、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、重復(fù)性好和檢測簡單等優(yōu)點[8]。國內(nèi)外研究人員利用SSR標(biāo)記對柑橘屬及金柑屬植物的遺傳多樣性與親緣關(guān)系進行了分析,如:Ferrante等[9]通過SSR分子標(biāo)記精確檢測了8個柑橘四倍體雜種的等位基因并探討其起源問題;Amar等[10]用61對SSR引物對24個柑橘及其近緣屬植物的多態(tài)性和識別能力進行了評價;張連峰等[11]選取了22對柑橘屬SSR引物,其中有14對能在金柑屬植物中擴增出帶紋,表明柑橘屬SSR引物在金柑屬植物上具有一定的通用性;陳鵬等[12]對我國野生山金柑資源的形態(tài)特征和遺傳多樣性進行了系統(tǒng)分析,使用60對SSR引物分析了48份不同地區(qū)的樣品,研究表明所有的樣品遺傳距離在0.37以內(nèi),親緣關(guān)系都很近,為SSR分子標(biāo)記在柑橘品種改良上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)?!颈狙芯壳腥朦c】廣西被農(nóng)業(yè)部規(guī)劃為我國柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的優(yōu)勢區(qū)域[13],蘊含了豐富的柑橘種質(zhì)資源,但有關(guān)廣西柑橘地方種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究相對較少。目前為止,在分子水平對廣西野生山金柑資源的相關(guān)研究還處于空白?!緮M解決的關(guān)鍵問題】以‘桂野生山金柑'為試材,對其倍性進行分析,并以其他地區(qū)的6份山金柑材料為參照,利用已公開發(fā)表的柑橘屬及其近緣屬SSR引物,采用分子標(biāo)記技術(shù)研究供試材料的遺傳多樣性,以期了解廣西野生山金柑種質(zhì)資源并對其進行科學(xué)保護和創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    從2013年開始對廣西東興市發(fā)現(xiàn)的野生山金柑進行種質(zhì)資源調(diào)查和樣品采集,并將其嫁接保存于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所柑橘資源圃內(nèi)。通過3年的實地調(diào)查和研究,筆者發(fā)現(xiàn)該山金柑具有自己獨特的植物學(xué)和生物學(xué)特性,并將其命名為‘桂野生山金柑',于2015年通過了廣西壯族自治區(qū)種子管理局的品種登記認證(桂登【果】2015021號)。本研究取2株‘桂野生山金柑'為供試材料。

    SSR分子標(biāo)記所用的其它6份種質(zhì)資源材料分別是江西省贛州市多胚山金柑、浙江省臺州市多胚山金柑、湖南省郴州市多胚山金柑、福建省龍巖市單胚山金柑1、福建省龍巖市單胚山金柑2、重慶市北碚區(qū)瀏陽金柑;均采集于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘資源圃,通過資源搜集與保存獲得。供試材料嫁接成活后,選取健康幼嫩葉片提取DNA,保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 倍性分析

    參照張俊娥等[14]的檢測方法,采用流式細胞儀(型號:PA-I,Partec公司,德國)對‘桂野生山金柑'的倍性進行檢測,選取二倍體‘早花檸檬'的葉片作為對照,操作過程為:選取約0.5 cm2的幼嫩葉片于塑料皿中,加入400μl HR-A核裂解液,用刀片切碎葉片放置30 s,通過20~50μl的微孔濾膜將樣品過濾到小試管里,加入1.6 mL HR-B DAPI染色液,染色30~60 s,然后上樣品檢測。Partec倍性分析儀測定樣品中單個細胞核的DNA總量,DNA含量的分布曲線由儀器自動生成[15]。

    1.3 DNA提取與PCR擴增

    采用CTAB改良法提取柑橘葉片核基因組DNA[16],具體方法稍作改動。DNA提取后用超微量紫外分光光度計(Nanodrop 2000)檢測質(zhì)量及濃度,并以高濃度保存于-80℃超低溫冰箱。從24對引物中共篩選出6對多態(tài)性較好的引物,對7份山金柑材料(‘桂野生山金柑'重復(fù)2次)和1份金柑材料的DNA樣品進行分析,6對引物組合即F10、Ma3-1047、BES-36、M2-14、F78和Ma2-1825(表1)。引物委托上海生工生物工程公司合成。PCR擴增體系總體積為20μl,反應(yīng)液含有的組分和終濃度為:DNA模板100 ng,1×PCR buffer,dNTP 200μmol ·L-1,MgCl21.5 mmol·L-1,1 Uit Taq酶,正反向引物各0.1μmol·L-1,其余為滅菌超純水;擴增程序為:94℃預(yù)變性3 min,94℃變性1 min,55℃退火45 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán),最后72℃延伸7 min,4℃20 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測,染色,拍照,用銀染法得到被擴增的DNA譜帶[17]。

    表1 SSR分子標(biāo)記所采用的擴增引物序列Table 1 Sequences of amplification primers used in the SSRmolecularmakers

    1.4 聚類分析

    每對SSR引物視為1個位點,每條多態(tài)性條帶為1個等位基因。根據(jù)聚丙烯酰氨凝膠電泳后分子標(biāo)記擴增條帶的有無進行統(tǒng)計,有條帶的記為1,沒有條帶記為0,構(gòu)建(0,1)矩陣。構(gòu)建的矩陣應(yīng)用NTSYS-pc 2.10e軟件采用簡單匹配系數(shù)(Simplematching coefficient,SM)計算遺傳相似系數(shù),由此得到相似性系數(shù)矩陣,并根據(jù)SM相似性矩陣進一步進行UPGMA聚類分析,構(gòu)建親緣關(guān)系樹圖[18-19]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 倍性分析

    從圖1可以看出,流式細胞儀倍性分析結(jié)果表明‘桂野生山金柑'相同于對照‘早花檸檬',為二倍體樣本。

    2.2 SSR擴增的多態(tài)性分析

    從24條SSR引物中篩選出6條重復(fù)性好、條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物(表2),利用這6條引物擴增到30個位點,其中多態(tài)性位點25個,平均多態(tài)性比率為79.17%。不同引物擴增的多態(tài)性條帶數(shù)量為2~7條,平均每個引物產(chǎn)生的多態(tài)性條帶數(shù)量為4.17條,多態(tài)性比率較高,說明本研究中的樣品間存在的遺傳差異較大,且‘桂野生山金柑'在遺傳性上明顯有別于其他試驗材料,具有遺傳特異性。6條引物的擴增結(jié)果譜帶見圖2。

    2.3 聚類分析

    8份柑橘種質(zhì)的SSR聚類樹形圖3顯示,不同品種或資源材料遺傳相似系數(shù)在0.600~0.802。以遺傳相似系數(shù)0.600為閾值,供試材料可劃分為2組,其中‘桂野生山金柑'和江西省贛州市多胚山金柑材料為一個類群,浙江省臺州市多胚山金柑材料、湖南省郴州市多胚山金柑、福建省龍巖市的2

    圖1 ‘桂野生山金柑'的倍性分析Fig.1 Ploidy analysis of GuiWild Shanjingan

    份單胚山金柑材料和重慶市中柑所的瀏陽金柑為一個類群。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.802時,桂野生山金柑和江西省贛州市多胚山金柑材料即可分為不同的類別,浙江省臺州市多胚山金柑和湖南省郴州市多胚山金柑相似系數(shù)為0.802,福建省龍巖市的2個單胚山金柑材料的相似系數(shù)為0.702,瀏陽金柑和其他幾種材料的遺傳距離較遠。由此可知,‘桂野生山金柑'與其他地區(qū)的山金柑、金柑資源遺傳差異較大,具有自己的獨特性。

    3 討 論

    ‘桂野生山金柑'除了和江西省贛州市多胚山金柑在遺傳相似系數(shù)為0.802時可聚在一起,和其他地區(qū)山金柑及金柑材料的遺傳距離為0.600,表明桂野生山金柑和其他材料均有較大的遺傳差異,說明地理因素對親緣關(guān)系也有很大的影響,這與前人的研究結(jié)果相類似[18-19]。陳鵬等[12]在進行中國野生山金柑資源調(diào)查以及分析遺傳多樣性時共收集到江西、湖南、福建、廣東和浙江的野生山金柑樣品275份,采用SSR標(biāo)記后的聚類分析結(jié)果表明基本上各省的樣品都聚在一起,部分地理位置相距較近的樣品則聚在一起。本研究未能大范圍驗證桂野生山金柑的遺傳背景與地理因素的關(guān)系,但主要是為驗證‘桂野生山金柑'的遺傳特異性,SSR分析樣本的取樣地點數(shù)量有限,在柑橘眾多的類群中,枳屬、金柑屬、柑橘屬中的多數(shù)種類均原產(chǎn)中國,在中國有著悠久的栽培歷史[20],現(xiàn)已查明廣西擁有枳屬、金柑屬、柑橘屬3個屬的235個品種(系)[23]。柑橘童期長,多數(shù)品種為多胚,遺傳背景復(fù)雜,這些特性給柑橘育種及遺傳轉(zhuǎn)化等研究帶來了一定困難。前人研究表明,山金柑實生苗童期短,播種后一至兩年便可開花結(jié)果,能夠達到早開花、早結(jié)果、雜種后代品種早鑒定的目的[3,22]。筆者團隊經(jīng)過3年的實地調(diào)查和采樣觀察,明確在廣西東興收集的‘桂野生山金柑'材料為單胚性類型,一年內(nèi)可多次開花、結(jié)果。單胚類型的山金柑材料,可以克服珠心胚障礙,如果用組織培養(yǎng)等技術(shù)將其加以培養(yǎng),獲得純合系,不僅可為柑橘常規(guī)育種提供材料,還可用于功能基因組及遺傳圖譜構(gòu)建等方面的研究。除此之外,利用童期較短的山金柑作為遺傳轉(zhuǎn)化材料,建立并優(yōu)化其高效再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系,將使山金柑有望成為果樹中的模式植物。而‘桂野生山金柑'可較好的符合這些特性,有待進一步挖掘其在柑橘育種和基因組學(xué)研究中的潛在價值。

    表2 SSR引物擴增結(jié)果Table 2 The amplification results of SSR primers

    圖2 不同材料的SSR擴增譜帶Fig.2 SSR profiles of different samples

    圖3 SSR標(biāo)記不同材料的UPGMA聚類分析Fig.3 UPGMA dendrogram of different samples based on SSRmarkers

    野生資源和地方種質(zhì)具有十分豐富的遺傳多樣性,對于評價品種資源間的關(guān)系具有重要意義[23-24]?!鹨吧浇鸶?是廣西為數(shù)不多的野生山金柑資源,是區(qū)域氣候條件下形成的特色柑橘資源,蘊含特異基因資源,對于研究廣西金柑屬植物的演化歷史及關(guān)系等具有重要意義。作者在實地調(diào)查采樣中了解到,當(dāng)?shù)厝杂幸恍┮吧Y源由于環(huán)境惡化和人為破壞而逐漸消失,因此必須進一步加強對野生資源和地方種質(zhì)的保護、研究和開發(fā)利用,為柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展做出貢獻。

    4 結(jié) 論

    ‘桂野生山金柑'為二倍體,通過對篩選出的6對條帶清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性強的SSR引物進行擴增,結(jié)果表明‘桂野生山金柑'具有遺傳特異性,明顯區(qū)別于其他地區(qū)起源的山金柑或金柑,是一種新的種質(zhì)資源。

    [1]鄧秀新.中國柑橘品種[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2008:190.

    [2]陳杰忠.果樹栽培學(xué)各論[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2003:4.

    [3]李懷福,胡小三.山金柑實生苗童期的研究[J].特產(chǎn)研究,2005 (1):23-25,39.

    [4]耿 攀,阮小鳳,楊 勇,等.柿屬植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2010,38 (12):190-196.

    [5]潘麗梅,朱建華,秦獻泉,等.廣西龍荔遺傳多樣性的ISSR分析[J].果樹學(xué)報,2011,28(5):814-819.

    [6]陳 嬌,王小蓉,楊浩茹,等.基于SSR標(biāo)記的四川野生中國櫻桃遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu)分析[J].園藝學(xué)報,2013,40 (2):333-340.

    [7]趙 爽,蘇淑釵,陳志鋼,等.基于SSR的遼寧鐵嶺地區(qū)平榛遺傳多樣性與居群遺傳結(jié)構(gòu)分析[J].果樹學(xué)報,2016,33(1):24 -33.

    [8]羅 兵,孫海燕,徐港明,等.SSR分子標(biāo)記研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(12):5210-5212,5246.

    [9]Ferrante SP,Lucretti S,Reale S,etal.Assessment of the origin of new citrus tetraploid hybrids(2n=4x)by means of SSR markers and PCR based dosage effects[J].Euphytica,2010,173(2):223 -233.

    [10]Amar M H,BiswasM K,Zhang ZW,et al.Exploitation of SSR,SRAP and CAPS-SNP markers for genetic diversity of Citrus germplasm collection[J].Scientia Horticulturae,2011,128(3):220-227.

    [11]張連峰,何 建,馮 焱,等.金柑屬及其近緣屬植物親緣關(guān)系的SSR分析[J].果樹學(xué)報,2006,23(3):335-338.

    [12]陳 鵬.中國野生山金柑種質(zhì)資源調(diào)查及遺傳多樣性研究[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2011:17-27.

    [13]鄧秀新.國內(nèi)外柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢與柑橘優(yōu)勢區(qū)域規(guī)劃[J].廣西園藝,2004(4):6-10.

    [14]張俊娥,劉繼紅,鄧秀新.采用倍性分析儀鑒定柑橘愈傷組織的遺傳變異[J].遺傳學(xué)報,2003,30(2):169-174.

    [15]謝宗周,鄧秀新,陳騰士,等.“桂橙一號”的遺傳鑒定[J].南方園藝,2010,21(3):3-6.

    [16]程運江,伊華林,龐曉明,等.幾種木本果樹DNA的有效提取[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2001,20(5):481-483.

    [17]Bassam B J,Caetano-Anollés G,Gresshoff PM.Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels[J].Analytical Biochemistry,1991,196:80-83.

    [18]劉 勇,吳 波,劉德春,等.江西柑橘地方品種資源及野生近緣種SSR分子標(biāo)記[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,27(4):486-490.

    [19]劉 通,鄧崇嶺,程玉芳,等.利用SSR和SRAP技術(shù)研究廣西柑橘種質(zhì)遺傳多樣性[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,35(2):23 -29.

    [20]廖振坤.湖南柑橘種質(zhì)資源評價及主要病害分子鑒定[D].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文,2007.

    [21]沈麗娟,高克義,李志宏,等.發(fā)揮廣西柑桔優(yōu)勢之淺見[J].廣西園藝,2007(1):8-10.

    [22]張建成.紅肉臍橙類胡蘿卜素合成酶基因(CsPYS、CsLCYB)功能分析與crtB轉(zhuǎn)基因?qū)Ω涕兕惡}卜素合成的影響[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文,2009:71-72

    [23]劉建軍,陳克玲,胡 強,等.特色地方柑橘資源“資陽香橙”的初步研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,21(6):1658-1660.

    [24]劉冰浩,鄧崇嶺,陳傳武,等.廣西地方柑橘資源的ISSR分析[J].果樹學(xué)報,2015,32(6):1001-1006.

    (責(zé)任編輯 汪羽寧)

    Ploidy Analysis and SSR M olecular Identification of GuiW ild Shanjingan

    LIGuo-guo1,LIU Yao-xin1,CHAILi-jun2,YE Jun-li2,MAICai-sheng3,OU Zhi-tao1,CHEN Xiang-ling1*
    (1.Horticulture Research Institute,Guangxi Academy of Agriculture Sciences/Nanning Investigation&Experiment Station of South Subtropical Fruit Trees,Ministry of Agriculture,Guangxi Nanning 530007,China;2.College of Horticulture&Forestry Sciences,Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology,Ministry of Education,Hubei Wuhan 430070,China;3.Agricultural Technology Extension Center of Dongxing City,Guangxi Dongxing 538100,China)

    【Objective】In order to provide a theoretical basis for the identification and utilization of GuiWild Shanjingan,its genetic characteristics was studied【Methods】Using ploidy analysis and SSR molecular marker to analyze the genetic diversity of GuiWild Shanjingan.【Results】The ploidy analysis result showed thatGuiWild Shanjingan was diploid.6 pairs of SSR primerswith good repeatability,high polymorphism and clear bands were screened from the 24 pairs of SSR primers.A total of 30 allele stripes were successfully observed,among them,25 bands were polymorphism.The polymorphic rate was 79.17%.Genetic similarities caculated by cluster analysis ranged from 0. 600-0.802.【Conclusion】GuiWild Shanjingan was significant different from Shanjingan or Jingan originated from other origions,itwas a new cultivar with genetic specificity.

    GuiWild Shanjingan;Ploidy analysis;SSR molecularmarker;Cluster analysis

    S666

    A

    1001-4829(2017)8-1872-05

    10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.030

    2017-04-21

    廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(桂農(nóng)科2016YM 44,桂農(nóng)科2015YT51,桂農(nóng)科2015JZ101);廣西農(nóng)業(yè)廳重點科技項目(201307);國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(柑橘)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項桂中南柑橘綜合試驗站(CARS-27)

    李果果(1987-),女,河南寶豐人,碩士,助理研究員,主要研究方向為柑橘品種選育和栽培技術(shù)推廣,*為通訊作者,E-mail:cxl@gxaas.net。

    猜你喜歡
    柑橘種質(zhì)多態(tài)性
    華南地區(qū)最大農(nóng)作物種質(zhì)資源保護庫建成
    單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關(guān)性研究進展
    吃柑橘何來黃疸——認識橘黃病
    亞麻抗白粉病種質(zhì)資源的鑒定與篩選
    柑橘大實蠅綜合治理
    貴州玉米種質(zhì)資源遺傳多樣性及核心種質(zhì)庫構(gòu)建
    馬鈴薯cpDNA/mtDNA多態(tài)性的多重PCR檢測
    紅錐種質(zhì)早期生長表現(xiàn)
    “五及時”柑橘凍害恢復(fù)技術(shù)
    浙江柑橘(2016年4期)2016-03-11 20:12:59
    GlobalFiler~? PCR擴增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性
    午夜精品在线福利| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久香蕉精品热| videos熟女内射| 免费在线观看完整版高清| 在线看a的网站| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产精品久久电影中文字幕 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品久久视频播放| 高清av免费在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 女同久久另类99精品国产91| 精品国产美女av久久久久小说| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产亚洲欧美98| 国产99久久九九免费精品| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 黄色成人免费大全| 夜夜夜夜夜久久久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 天堂动漫精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 高清视频免费观看一区二区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品99久久99久久久不卡| 手机成人av网站| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 老司机深夜福利视频在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲五月天丁香| 老司机影院毛片| 色94色欧美一区二区| 国产野战对白在线观看| 麻豆成人av在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲全国av大片| 欧美在线黄色| 午夜免费观看网址| 久久久水蜜桃国产精品网| 中文字幕人妻丝袜制服| 两性夫妻黄色片| 国产区一区二久久| 国产精品免费大片| 久久久国产一区二区| av国产精品久久久久影院| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲五月色婷婷综合| 精品电影一区二区在线| 一区福利在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产一区在线观看成人免费| 久久精品国产a三级三级三级| 在线观看一区二区三区激情| 少妇被粗大的猛进出69影院| 黄色视频不卡| 天堂中文最新版在线下载| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| av网站在线播放免费| 国产成人免费观看mmmm| 在线看a的网站| 亚洲黑人精品在线| 女人久久www免费人成看片| 99精国产麻豆久久婷婷| 久久人妻熟女aⅴ| 国产91精品成人一区二区三区| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | xxxhd国产人妻xxx| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久精品国产清高在天天线| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 成年版毛片免费区| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品永久免费网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 看黄色毛片网站| 亚洲中文字幕日韩| 午夜福利,免费看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 香蕉丝袜av| av片东京热男人的天堂| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲全国av大片| 岛国毛片在线播放| 日本wwww免费看| 91精品国产国语对白视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品国产一区二区久久| 美女福利国产在线| 国产野战对白在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | av网站在线播放免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 18禁美女被吸乳视频| 首页视频小说图片口味搜索| 老司机亚洲免费影院| 亚洲欧美色中文字幕在线| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产1区2区3区精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 色尼玛亚洲综合影院| 又紧又爽又黄一区二区| 99精品欧美一区二区三区四区| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲一区二区三区不卡视频| 无遮挡黄片免费观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 十分钟在线观看高清视频www| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产亚洲一区二区精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美日韩一级在线毛片| 无限看片的www在线观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久99一区二区三区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 麻豆乱淫一区二区| 国产免费现黄频在线看| 国产成人啪精品午夜网站| 一级黄色大片毛片| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美色视频一区免费| 91大片在线观看| 无限看片的www在线观看| 久热爱精品视频在线9| 丝瓜视频免费看黄片| 午夜福利,免费看| 日韩视频一区二区在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲精品国产一区二区精华液| 韩国av一区二区三区四区| 成人特级黄色片久久久久久久| 手机成人av网站| 香蕉久久夜色| 免费观看精品视频网站| 伦理电影免费视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 我的亚洲天堂| 看免费av毛片| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| cao死你这个sao货| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美中文综合在线视频| 国产99白浆流出| 视频区欧美日本亚洲| e午夜精品久久久久久久| 成人永久免费在线观看视频| 在线永久观看黄色视频| 亚洲人成电影免费在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲精品国产区一区二| 成年人免费黄色播放视频| 久久性视频一级片| 精品第一国产精品| 嫩草影视91久久| 天天添夜夜摸| 人妻久久中文字幕网| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 一夜夜www| 欧美黄色淫秽网站| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 免费在线观看亚洲国产| 动漫黄色视频在线观看| 成在线人永久免费视频| 我的亚洲天堂| 99re在线观看精品视频| 久99久视频精品免费| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品国产av在线观看| 99热国产这里只有精品6| 国产精品久久久久成人av| 国产欧美日韩一区二区三| 中文字幕人妻熟女乱码| 九色亚洲精品在线播放| 一个人免费在线观看的高清视频| 色尼玛亚洲综合影院| 自线自在国产av| 天天操日日干夜夜撸| 淫妇啪啪啪对白视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 91字幕亚洲| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产精品1区2区在线观看. | 国产高清国产精品国产三级| 纯流量卡能插随身wifi吗| 一夜夜www| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| xxxhd国产人妻xxx| 久久ye,这里只有精品| www.自偷自拍.com| 视频在线观看一区二区三区| 精品国产国语对白av| 国产免费av片在线观看野外av| 日本wwww免费看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产精品永久免费网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美色视频一区免费| √禁漫天堂资源中文www| av不卡在线播放| 久久狼人影院| 国产成人精品久久二区二区91| 国产97色在线日韩免费| 在线观看免费高清a一片| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 777米奇影视久久| 中文亚洲av片在线观看爽 | 亚洲色图av天堂| 国产欧美亚洲国产| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品.久久久| 精品国产一区二区三区四区第35| 在线观看www视频免费| 黄片小视频在线播放| 精品国产一区二区久久| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 两个人免费观看高清视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 午夜福利一区二区在线看| 99热国产这里只有精品6| 男男h啪啪无遮挡| 自线自在国产av| 新久久久久国产一级毛片| а√天堂www在线а√下载 | 精品电影一区二区在线| 国产三级黄色录像| 极品人妻少妇av视频| 男男h啪啪无遮挡| 悠悠久久av| 久久久精品免费免费高清| 国产av一区二区精品久久| 精品乱码久久久久久99久播| 男女下面插进去视频免费观看| 精品国产一区二区久久| aaaaa片日本免费| 国产成人影院久久av| 久久九九热精品免费| 久久久久国产一级毛片高清牌| 一级毛片高清免费大全| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产深夜福利视频在线观看| 成年动漫av网址| 国产有黄有色有爽视频| 欧美精品一区二区免费开放| 极品人妻少妇av视频| 窝窝影院91人妻| 亚洲一区中文字幕在线| 悠悠久久av| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 视频区欧美日本亚洲| 99热网站在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 人妻一区二区av| 久久久久久久精品吃奶| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 91成人精品电影| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久精品91无色码中文字幕| 热99国产精品久久久久久7| 国产主播在线观看一区二区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品免费一区二区三区在线 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲专区字幕在线| 久久亚洲精品不卡| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 91九色精品人成在线观看| 99re在线观看精品视频| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日韩欧美免费精品| 精品一区二区三区av网在线观看| 18禁国产床啪视频网站| aaaaa片日本免费| 国产乱人伦免费视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 制服人妻中文乱码| 国产日韩欧美亚洲二区| 男女下面插进去视频免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| 在线观看舔阴道视频| 午夜精品国产一区二区电影| 两个人免费观看高清视频| 91av网站免费观看| 日韩大码丰满熟妇| 99久久精品国产亚洲精品| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 下体分泌物呈黄色| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲精品自拍成人| 99久久综合精品五月天人人| 精品国产亚洲在线| 国产又爽黄色视频| 极品人妻少妇av视频| 亚洲五月色婷婷综合| 国产伦人伦偷精品视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 9热在线视频观看99| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 母亲3免费完整高清在线观看| 色综合婷婷激情| 精品国产一区二区三区四区第35| 操出白浆在线播放| 中文字幕精品免费在线观看视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 精品久久蜜臀av无| 国产成人欧美| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产激情欧美一区二区| 久久久国产欧美日韩av| a在线观看视频网站| 国产精品久久久久成人av| 日韩欧美一区视频在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品久久久久久久毛片微露脸| 多毛熟女@视频| 免费少妇av软件| 大香蕉久久成人网| 超碰成人久久| 满18在线观看网站| 色综合婷婷激情| 亚洲片人在线观看| 多毛熟女@视频| av线在线观看网站| 大香蕉久久成人网| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | av天堂久久9| 国产野战对白在线观看| 亚洲九九香蕉| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美丝袜亚洲另类 | 无遮挡黄片免费观看| 欧美日韩成人在线一区二区| xxx96com| 老汉色av国产亚洲站长工具| 人妻久久中文字幕网| 亚洲国产精品sss在线观看 | 女人被狂操c到高潮| av国产精品久久久久影院| 看黄色毛片网站| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲av成人av| 麻豆av在线久日| 国产成人影院久久av| 国产人伦9x9x在线观看| 国产野战对白在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 午夜两性在线视频| av欧美777| 老司机午夜十八禁免费视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 成年动漫av网址| 校园春色视频在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 18在线观看网站| 久久国产亚洲av麻豆专区| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久狼人影院| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲伊人色综图| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲av电影在线进入| 久久精品国产综合久久久| 91精品三级在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 大型黄色视频在线免费观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 美女国产高潮福利片在线看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 涩涩av久久男人的天堂| 久久久国产成人精品二区 | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| aaaaa片日本免费| 婷婷成人精品国产| 日韩有码中文字幕| 欧美精品啪啪一区二区三区| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 99国产精品一区二区蜜桃av | 新久久久久国产一级毛片| 首页视频小说图片口味搜索| 中文字幕制服av| 美女 人体艺术 gogo| 日本黄色视频三级网站网址 | 99国产精品一区二区三区| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产1区2区3区精品| 久久国产精品大桥未久av| 精品少妇久久久久久888优播| 国产一区二区激情短视频| 最新美女视频免费是黄的| 午夜福利,免费看| 国产成人啪精品午夜网站| 国产不卡av网站在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| av欧美777| 十分钟在线观看高清视频www| 天天影视国产精品| 极品人妻少妇av视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品国产一区二区久久| 午夜福利视频在线观看免费| 热99re8久久精品国产| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 99久久人妻综合| 亚洲人成电影观看| 久久久久久久国产电影| 国产欧美日韩一区二区精品| e午夜精品久久久久久久| 精品亚洲成国产av| 国产国语露脸激情在线看| 乱人伦中国视频| 亚洲人成电影观看| 少妇粗大呻吟视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品综合久久久久久久免费 | 下体分泌物呈黄色| av超薄肉色丝袜交足视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产精品九九99| www.熟女人妻精品国产| 男女午夜视频在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 涩涩av久久男人的天堂| 中文字幕色久视频| 国产野战对白在线观看| 久久草成人影院| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久99久视频精品免费| 欧美性长视频在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 中文欧美无线码| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 一级毛片女人18水好多| 高清视频免费观看一区二区| 精品高清国产在线一区| 成人免费观看视频高清| 免费在线观看日本一区| 香蕉丝袜av| 久久精品国产综合久久久| 男女下面插进去视频免费观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品 国内视频| av电影中文网址| 成年动漫av网址| 精品一区二区三区av网在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日日爽夜夜爽网站| 国产一区二区三区视频了| 交换朋友夫妻互换小说| 不卡一级毛片| 波多野结衣一区麻豆| 自线自在国产av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | www.999成人在线观看| 色播在线永久视频| 在线天堂中文资源库| 又黄又粗又硬又大视频| 丝袜人妻中文字幕| 麻豆成人av在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 中文字幕制服av| 99久久综合精品五月天人人| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久人妻av系列| 国产主播在线观看一区二区| 91精品国产国语对白视频| av欧美777| 国产极品粉嫩免费观看在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产亚洲精品第一综合不卡| 在线看a的网站| 一本综合久久免费| 国产91精品成人一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲五月色婷婷综合| 热99久久久久精品小说推荐| 大码成人一级视频| 在线观看免费视频日本深夜| 满18在线观看网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美日本中文国产一区发布| 精品一区二区三区四区五区乱码| 又黄又爽又免费观看的视频| 精品亚洲成国产av| 女人精品久久久久毛片| ponron亚洲| 免费人成视频x8x8入口观看| 精品久久久久久久久久免费视频 | 我的亚洲天堂| 亚洲少妇的诱惑av| 人人妻人人澡人人看| 亚洲专区中文字幕在线| 操出白浆在线播放| 亚洲片人在线观看| 99久久国产精品久久久| av在线播放免费不卡| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 激情在线观看视频在线高清 | 国产视频一区二区在线看| 女警被强在线播放| 嫩草影视91久久| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久亚洲精品不卡| 免费av中文字幕在线| 国产主播在线观看一区二区| 窝窝影院91人妻| 在线天堂中文资源库| 超碰成人久久| 亚洲性夜色夜夜综合| 黄色成人免费大全| 成人亚洲精品一区在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美丝袜亚洲另类 | 最近最新免费中文字幕在线| 九色亚洲精品在线播放| 啪啪无遮挡十八禁网站| 又紧又爽又黄一区二区| 性少妇av在线| 丁香欧美五月| 国产激情欧美一区二区| 视频区欧美日本亚洲| 多毛熟女@视频| 亚洲成国产人片在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久精品国产清高在天天线| 男女免费视频国产| 亚洲一区中文字幕在线| 国产精品九九99| 午夜久久久在线观看| 身体一侧抽搐| 大陆偷拍与自拍| 国产亚洲精品一区二区www | 五月开心婷婷网| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲色图综合在线观看| 另类亚洲欧美激情| 人人澡人人妻人| 国产又色又爽无遮挡免费看| 操出白浆在线播放| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 18禁美女被吸乳视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 欧美日本中文国产一区发布| √禁漫天堂资源中文www| 国产在线一区二区三区精| 中文字幕色久视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 少妇 在线观看| 亚洲九九香蕉| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 久久精品国产综合久久久| 国产主播在线观看一区二区| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲少妇的诱惑av| 搡老乐熟女国产|