大菱鲆弧菌耐藥性初探

文/鄭懷東 李小進 黃萍萍 徐小雅 張勁松 石峰

大菱鲆弧菌耐藥性初探

文/鄭懷東1李小進1黃萍萍1徐小雅1張勁松2石峰2

抗菌藥在水生動物細菌性傳染病的控制中起到了非常重要的作用。但是，長期以來，由于人們關于水生動物致病菌對各種抗菌藥物敏感性的變化缺乏了解，在養(yǎng)殖過程中盲目的濫用抗菌藥，加重了水生動物越來越嚴重的耐藥性，使抗菌藥對水生動物細菌性疾病的控制效果越來越差。不但造成藥物浪費，還延誤病情，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的損失。 根據(jù)全國水產(chǎn)技術推廣總站部署，2016年4月～2016年10月，我站從葫蘆島市興城市人工養(yǎng)殖大菱鲆體內分離致病性菌株，測定了其對抗菌素類藥物的敏感性，初步研究情況如下。

一、材料與方法

1.供試藥物

諾氟沙星、鹽酸諾氟沙星、鹽酸多西環(huán)素、鹽酸土霉素、氟苯尼考、紅霉素、氨芐西林、甲砜霉素、硫酸新霉素、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶。

2.供試菌株

2016年4月～2016年10月，從葫蘆島市興城市2個定點養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的大菱鲆體中，選取有典型病癥的個體進行活體解剖，選取新鮮組織和病灶部位分別接種于選擇性培養(yǎng)基平板（弧菌的分離培養(yǎng)選用TCBS瓊脂平板），28℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，觀察菌落特征，挑取可疑的單個菌落，接種于TSA培養(yǎng)基或普通營養(yǎng)瓊脂平板上，28℃±1℃培養(yǎng)18h～24h以得到純培養(yǎng)物。

3.供試菌株最小抑菌濃度的測定

按照日本化學療法學會制定的標準法，將供試藥物采用適宜的預溶劑溶解后，用滅菌蒸餾水分別稀釋至1000.0μg/mL的濃度。按照倍比稀釋法，將抗菌藥物原液通過0.22μm微孔濾膜過濾除菌，在96孔板中用MH肉湯稀釋成10個梯度。首先，用移液器向第1孔～第11孔中分別加入100μL含有2%NaCl的MH肉湯。然后，向第1孔中加入100μL一定濃度的抗菌藥物，之后按照倍比稀釋法將抗菌藥物稀釋至第10孔，形成10個藥物梯度，依次向96孔細胞培養(yǎng)板的第1孔～第10孔和第12個孔中加入106CFU/mL的菌懸液（分光光度計測定），每孔100μL；第11孔和第12孔分別作為陰性對照和陽性對照，每種藥物做3個平行。28±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。觀察各孔培養(yǎng)液中細菌的生長情況，以抑制細菌生長的藥物最高稀釋度作為測試藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

二、結果與分析

1.弧菌監(jiān)測結果

（1）分離培養(yǎng)結果

2016年4月～2016年10月間，從葫蘆島市興城市2個定點養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的大菱鲆中共采集樣品286份，分離培養(yǎng)出菌株共325株，其中弧菌屬275株，采集率占總菌株數(shù)的84.6%。采集樣品的時間、水溫、大菱鲆數(shù)量、分離菌株數(shù)量見表1。

表1.菌株采集及分離情況

從表1可以看出，弧菌在遼寧省葫蘆島地區(qū)不同養(yǎng)殖場、不同月份都有檢出，表明弧菌在該地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆體內廣泛存在，常年均可分離得到病原菌，隨季節(jié)和月份的變化，7月份～10月份分離出的弧菌數(shù)量多于4月份～6月份。

（2）鑒定結果

將分離得到的275株弧菌屬菌株通過分子生物學（PCR）鑒定出12個種類，見表2。鑒定結果表明，大菱鲆弧菌的檢出率最高，占總數(shù)的42.27%；其次是魚腸道弧菌占到21.09%；燦爛弧菌、大西洋弧菌也占有一定數(shù)量，分別占到10.91%和9.82%；緩慢弧菌、嗜環(huán)弧菌、河口弧菌、魔鬼弧菌、溶藻弧菌、塔斯馬尼亞弧菌，這幾個種類的弧菌數(shù)量較少，所占比例在1.09%～2.91%之間；此外，某些月份還分離得到1株創(chuàng)傷弧菌和1株費氏弧菌，數(shù)量極少。通過對這275株弧菌屬的種類鑒定，提示葫蘆島地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆過程中應注意這些優(yōu)勢菌的防治。

表2.275株弧菌菌株分離及鑒定結果 （單位：株）

2.弧菌對抗菌藥物的感受性

弧菌病是世界水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)危害最大的病源之一，是引起水生動物細菌性敗血癥等疾病的致病細菌。其宿主范圍很廣，包括養(yǎng)殖和野生魚類，據(jù)報道，目前已有很多國家發(fā)生過弧菌病，侵染大約48種海水魚類。本次從分離得到的275株弧菌中選取有代表性的104株，用13種抗菌藥物對其進行藥物敏感性試驗，其對各種抗菌藥物感受性測定結果如表3所示。

3.弧菌對抗菌藥物的耐藥性

不同抗生素藥敏試驗的感受性結果判定標準有所不同，參照美國臨床實驗室標準研究所（CLSI）發(fā)布的標準文件，對藥物的敏感性及耐藥性判定范圍劃分如下：諾氟沙星類、鹽酸多西環(huán)素及鹽酸土霉素（S敏感：MIC≤4μg/mL，I中敏：MIC=8μg/ mL，R耐藥：MIC≥16μg/mL），氟苯尼考、甲砜霉素及硫酸新霉素（S敏感：MIC≤2μg/mL，I中敏：MIC=4μg/mL，R耐藥：MIC≥8μg/ mL），紅霉素（S敏感：MIC≤0.5μg/ mL，I中敏：MIC=1μg/mL～4μg/ mL，R耐藥：MIC≥8μg/mL），氨芐西林（S敏感：MIC≤8μg/mL，I中敏：MIC=16μg/mL，R耐藥：MIC≥32μg/mL），磺胺類（S敏感：MIC≤38μg/mL，R耐藥：MIC≥76μg/ mL）。依照這一劃分范圍，將各種抗菌藥物對各致病菌的MIC值測定結果進行判定，得出了各致病菌對各抗菌藥物的耐藥性結果。

（1）弧菌對抗菌藥物的耐藥性總體對比

藥物敏感性實驗結果詳見表4。結果表明在大菱鲆體內所分離的弧菌對不同抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度上的敏感性和耐藥性。鹽酸諾氟沙星、諾氟沙星耐藥率為5.77%，鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考耐藥率分別為12.50%和15.38%，保持了較高的敏感性，為預防和治療葫蘆島地區(qū)弧菌類細菌病的首選藥物。紅霉素、鹽酸土霉素耐藥率為25%～33.65%，這兩種藥物保持著中度敏感性。氨芐西林、甲砜 霉素耐藥率為40.38%～44.23%，具有較低水平的敏感性。而硫酸新霉素耐藥率為75.96%、磺胺類藥物耐藥率高達100%，是耐藥的抗菌藥。

表3.弧菌對各種抗菌藥物的感受性（n=104株）

表4.弧菌對各種抗菌藥物的敏感率和耐藥率總體對比結果 （單位：株）

（2）不同種類弧菌對抗菌藥物的耐藥性對比

由表5中的不同種類弧菌的耐藥率結果對比得出，在幾類敏感類藥物中，諾氟沙星類藥物對本年度所分離的多數(shù)弧菌株都有起到了有效的抑制作用，敏感率達到100%，其中溶藻弧菌僅對諾氟沙星類藥物敏感，而嗜環(huán)弧菌對其不敏感。鹽酸多西環(huán)素對該地區(qū)的魚腸道弧菌、燦爛弧菌、緩慢弧菌的生長抑制效果明顯，耐藥率分別為4.3%、6.7%、16.7%，若這三種病原菌引起疾病時，推薦優(yōu)先使用該藥物。氟苯尼考對大西洋弧菌的抑菌效果顯著，耐藥率為6.3%，可以對其引起的疾病起到控制作用。在幾類多數(shù)弧菌株敏感性不高的藥物中，甲砜霉素對魔鬼弧菌和費氏弧菌起到很好的抑制效果，體現(xiàn)了不同菌株對不同藥物的感受性并不是絕對的，而是相對的。

檢出率最高的大菱鲆弧菌，氟苯尼考和諾氟沙星類藥物對其抑制效果較好，成為治療該病原菌疾病的首選藥物。河口弧菌和魔鬼弧菌感受性較一致，對諾氟沙星、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考均敏感。塔斯馬尼亞弧菌、創(chuàng)傷弧菌、費氏弧菌對多數(shù)供試的抗菌藥物敏感性較高，對紅霉素、鹽酸土霉素、氨芐西林等幾類不敏感藥物的耐藥率也僅為0%，得到了有效抑制。與其他弧菌株相比，嗜環(huán)弧菌對本試驗的所有藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，耐藥率多在50%～75%以上，僅對紅霉素100%敏感，紅霉素是抑制嗜環(huán)弧菌的唯一有效藥物。此外，所有分離的弧菌株均對硫酸新霉素和磺胺類藥物嚴重耐藥。

（3）不同月份弧菌對抗菌藥物的耐藥性對比

不同月份弧菌對抗菌藥物的耐藥率對比結果見表6，除諾氟沙星類和氨芐西林外，各類藥物普遍表現(xiàn)為9月～10月的耐藥率低于4月～6月。結合本地區(qū)的實際生產(chǎn)和弧菌病流行情況，我們推測導致這一現(xiàn)象可能與當?shù)卮罅怫茵B(yǎng)殖過程中的用藥習慣有關?；【谌昃袡z出，養(yǎng)殖戶長期使用藥物進行預防，但7月份～8月份的水溫適宜大菱鲆生長，也是弧菌疾病發(fā)病率最低時期，養(yǎng)殖戶用藥較少，故使得9月份～10月份的耐藥率有所降低。

三、結論與建議

1.關于弧菌監(jiān)測和對抗菌藥物的感受性結論

弧菌在該地區(qū)的養(yǎng)殖 大菱鲆體內廣泛存在，不同養(yǎng)殖場、不同月份都有檢出，7月份～10月份分離數(shù)量較4月份～6月份有所增加。此次分離培養(yǎng)出弧菌屬275株，鑒定出12個種類，其中大菱鲆弧菌的檢出率最高；其次是魚腸道弧菌、燦爛弧菌、大西洋弧菌；少量的緩慢弧菌、嗜環(huán)弧菌、河口弧菌、魔鬼弧菌、溶藻弧菌、塔斯馬尼亞弧菌；極少量的創(chuàng)傷弧菌和費氏弧菌。

藥敏結果顯示，弧菌種屬總體表現(xiàn)為對磺胺類藥物和硫酸新霉素的耐藥性最強，其次為甲砜霉素、氨芐西林。而對諾氟沙星類藥物、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、紅霉素、鹽酸土霉素敏感。

不同種類弧菌株多數(shù)對諾氟沙星類藥物有極高的敏感性，其中溶藻弧菌僅對諾氟沙星敏感，而嗜環(huán)弧菌對其不敏感。魚腸道弧菌、燦爛弧菌、緩慢弧菌對鹽酸多西環(huán)素敏感性較高。大菱鲆弧菌、大西洋弧菌對氟苯尼考的敏感性較高。魔鬼弧菌和費氏弧菌對甲砜霉素有極高的敏感性。河口弧菌和魔鬼弧菌對諾氟沙星、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考均敏感。塔斯馬尼亞弧菌、創(chuàng)傷弧菌、費氏弧菌對多數(shù)供試的抗菌藥物敏感性較高，得到了有效抑制。而嗜環(huán)弧菌對多數(shù)供試的抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的耐藥，僅對紅霉素敏感。所有分離的弧菌株均對硫酸新霉素和磺胺類藥物嚴重耐藥。

2.關于目前選擇用藥的建議

弧菌對諾氟沙星類藥物、鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考表現(xiàn)出了較高的敏感性，具有明顯的抑制作用，建議可以作為抽樣企業(yè)今后治療和預防弧菌類疾病的首選藥物。而紅霉素、鹽酸土霉素也相對的表現(xiàn)出了中度敏感性，一定程度上也能抑制住菌株的生長，治療過程中，需要加大一定劑量。而氨芐西林、甲砜霉素敏感率較低，需要根據(jù)實際情況進行使用。而磺胺類藥物及硫酸新霉素表現(xiàn)出了嚴重的耐藥性，抽樣企業(yè)弧菌株已經(jīng)對這類藥物產(chǎn)生了抗藥性，在治療時盡量不要使用。建議今后在養(yǎng)殖生產(chǎn)中使用藥物時做到對癥下藥，根據(jù)MIC值選用有效治療濃度，做到科學用藥，合理減藥。

表5.不同種類弧菌對抗菌藥物的耐藥率對比結果 （單位：%）

表6.不同月份弧菌對抗菌藥物的耐藥率對比結果 （單位：%）

作者單位：1.遼寧省水產(chǎn)技術推廣總站 2.遼寧省葫蘆島市水產(chǎn)技術推廣站