飼料中黃曲霉毒素B1快速篩查膠體金免疫層析檢測方法應(yīng)用研究

劉曉侯亞楠，呂麗卿

（北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司，北京通州101105）

飼料中黃曲霉毒素B1快速篩查膠體金免疫層析檢測方法應(yīng)用研究

（北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司，北京通州101105）

本文介紹飼料行業(yè)中黃曲霉毒素B1目前檢測方法的整體情況，并對優(yōu)缺點進(jìn)行分析，通過用膠體金免疫層析法和酶聯(lián)免疫吸附法對飼料樣品的檢測進(jìn)行對比，結(jié)果表明：膠體金免疫層析試紙條法與酶聯(lián)免疫吸附法相符率可達(dá)95%以上，膠體金免疫層析試紙法操作簡單、快速、方便，可以應(yīng)用于谷物及飼料產(chǎn)品黃曲霉毒素B1現(xiàn)場快速檢測。

黃曲霉毒素B1；膠體金免疫層析法；試紙條；快速檢測

黃曲霉毒素（Aflatoxin,AFT）屬于真菌毒素（Mycotoxin），主要是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生，廣泛存在于土壤、灰塵、植物及其果實上，常見于花生及其制品、玉米及其玉米副產(chǎn)物、棉籽以及一些堅果類食物和飼料中（其中以花生和玉米污染最嚴(yán)重）。AFT包括B1、B2、G1、G2等10多種，其基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素，其中AFB1占80%～90%，毒性最強(qiáng)。1993年AFT被直接衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物，其作用的靶器官主要為肝臟。世界各國對黃曲霉毒素在食品和飼料中限量要求。對于飼料企業(yè)每年收購玉米均以千噸來計，故黃曲霉毒素B1的篩查就顯得尤為重要，它要求采用的檢測手段，快速、準(zhǔn)確、靈敏、易操作、設(shè)備投入小，通用型強(qiáng)等條件。

1 飼料檢測標(biāo)準(zhǔn)概述

縱觀有關(guān)黃曲霉毒素B1檢測國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法10余個之多，涉及到的行業(yè)有食品、乳制品、糧油、飼料行業(yè)，本文重點介紹飼料行業(yè)現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)共計6個，見表1。

根據(jù)試驗原理分為兩類：一類方法是對樣品進(jìn)行快速篩查的定性和半定量方法；另一類方法是對樣品進(jìn)行定量檢測的方法。

2 檢測方法優(yōu)缺點概述

2.1 薄層色譜法——半定量法（TLC）

該方法的特異性較差，樣品中的其他熒光物質(zhì)容易對檢測物質(zhì)產(chǎn)生干擾，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，重復(fù)性較差。

2.2 高效液相色譜法（免疫親和層析柱）（HPLC）

該方法由于抗體的專一性，黃曲霉毒素B1被交聯(lián)在層析介質(zhì)中，因此方法專一性較強(qiáng)，實驗過程繁瑣，容易產(chǎn)生各種影響因素，造成檢測物質(zhì)損失，儀器設(shè)備昂貴，要求操作人員具有專業(yè)高效液相色譜經(jīng)驗，降低了推廣性。

2.3 熒光光度儀

簡單快速，靈敏度高、具有特異性。安全，不需要直接接觸黃曲霉毒素，不用毒素標(biāo)樣，較少使用有機(jī)試劑。缺點：只能測出黃曲霉毒素的總量，不能分別測出其中B1、B2、G1、G2的含量；所用的水、試劑、儀器要求較高，水必須是高純水或重蒸水，試劑必須是分析純；需要專業(yè)儀器支持。

2.4 時間分辨熒光層析法

靈敏度高，原理同ELISA一致，靈敏度和測量范圍方面，均超越了市場上常用ELISA，有較好的分析穩(wěn)定性，具有很好的應(yīng)用前景，但同時檢測過程比較復(fù)雜，所用試劑較多，需要使用標(biāo)準(zhǔn)品，給操作者帶來風(fēng)險，同時需要有專業(yè)儀器支持，故設(shè)備投入需要較多資金。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

該方法靈敏度高，分析速度快，簡化了提取和純化的步驟，其作為液相色譜法的初篩工具，不需要大型設(shè)備，對操作人員要求也不高，成本也相對較低，被廣泛推廣采用。

2.6 膠體金免疫層析法（GICA）

該方法靈敏度高、分析速度快、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡單、無需任何專業(yè)儀器設(shè)備，無需接觸標(biāo)準(zhǔn)品，而且結(jié)果判斷直接可靠、容易被基層單位人掌握，最早廣泛應(yīng)用于臨床診斷及藥物檢測等領(lǐng)域，近年來在谷物中毒素檢測領(lǐng)域被廣泛使用，作為谷物快速毒素篩查工作起到了十分重要的作用。

3 膠體金免疫層析法詳解（GICA）

3.1 方法原理

這是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和色譜層析技術(shù)相結(jié)合的快速檢測分析方法。該技術(shù)本質(zhì)是免疫檢測技術(shù)，但充分利用膠體金作為示蹤標(biāo)記物的優(yōu)點。通常為雙抗夾心法和競爭法兩大類，其中競爭法又分為比色法和消線法兩種檢測。由于真菌毒素均為化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單的小分子，通常只需要1個表面決定小分子檢測，如激素、真菌毒素、抗生素的檢測等。所以，目前市場上膠體金免疫層析檢測試紙條絕大多數(shù)采用競爭法的原理進(jìn)行檢測。

3.2 制備方法

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體并噴于玻璃纖維上，黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原和二抗鼠抗驢分別結(jié)合于硝酸纖維膜上，依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維膜和吸水紙組裝切割成膠體金試紙條并裝入檢測卡中。測試結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1快速檢測試紙條的靈敏度為5ng/ml，檢測時間為10分鐘，批內(nèi)和批間重復(fù)性為100%，假陽性率和假陰性率均為0。

3.3 適用范圍

玉米、小麥等谷物類樣本，玉米副產(chǎn)品、飼料樣本等。

3.4 技術(shù)指標(biāo)

玉米、小麥等谷物類樣本最低檢測限：10цg/kg（ppb）。玉米副產(chǎn)品、反芻飼料等樣本最低檢測限：20цg/kg（ppb）。

3.5 注意事項

試劑板一次性使用；不要使用過期試劑板，廢棄物應(yīng)妥善處理；請勿觸摸試劑板中央的白色膜面；切勿重復(fù)使用配備的滴管，以免交叉污染；切勿食用配備的試劑。

3.6 特異性

本產(chǎn)品與糧油中玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、赭曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇沒有交叉反應(yīng)。

3.7 精密度

同時使用本產(chǎn)品和黃曲霉毒素B1的ELISA檢測試劑盒對300份樣品包括161份陰性樣本和139份陽性樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，本產(chǎn)品與黃曲霉毒素B1的ELISA檢測試劑盒的結(jié)果符合率為98.8%。

4 數(shù)據(jù)對比

在實際工作中通過大量樣品對比，將膠體金免疫層析試紙檢測法和酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行對比，檢測數(shù)據(jù)見表2。

表2 谷物原料和飼料產(chǎn)品黃曲霉毒素B1檢測數(shù)據(jù)對比

通過上述數(shù)據(jù)對比，可以表明谷物原料和飼料產(chǎn)品使用膠體金免疫層析法檢測，結(jié)果具有很好的穩(wěn)定性，與酶聯(lián)免疫吸附法的檢測結(jié)果一致。

5 結(jié)論

膠體金免疫層析法優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附測定法，具有假陽性率低、操作步驟少、操作過程影響因素少、測定結(jié)果重復(fù)性較好的優(yōu)勢，因此提高了檢測效率，能滿足企業(yè)在現(xiàn)場快速篩查的需要。此外，高色素復(fù)雜基質(zhì)的谷物采用酶聯(lián)免疫吸附法時容易出現(xiàn)假陽性，受樣品基質(zhì)影響明顯，而樣品基質(zhì)對金標(biāo)免疫層析試紙法影響不明顯。雖然目前此方法還只能完成定性或半定量檢測任務(wù)，但作為一種快速篩查手段，可以有效地對谷物原料進(jìn)行進(jìn)廠后的初篩過程，其穩(wěn)定性、安全性完全可以滿足企業(yè)對原料毒素控制要求，具有很重要的實際應(yīng)用價值。

[1]杜兵耀,馬晨,于雄.膠體金免疫層析法檢測谷物中的黃曲霉毒素B1[J].飼料工業(yè),2016,37(09)：58-60.

[2]柳運(yùn)文,盧旺,等.谷物中黃曲霉毒素4種常見檢測方法的探討[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2015,8：61-63.

[3]鄧省亮,賴衛(wèi)華.膠體金免疫層析法快速檢測黃曲霉毒素B1的研究[J].食品科學(xué),2007,28(02)：232-236.

R155；TS264

A

10.14025/j.cnki.jlny.2017.18.018

劉曉，本科學(xué)歷，副高級工程師，研究方向：飼料品控管理；侯亞楠，化驗員，研究方向：飼料原料及產(chǎn)品毒素檢測；呂麗卿，本科學(xué)歷，化驗員，研究方向：飼料原料及產(chǎn)品毒素檢測。