黃葵膠囊通過抑制缺氧誘導因子改善單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎纖維化的機制

鐘正霞 裘志成

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

黃葵膠囊通過抑制缺氧誘導因子改善單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎纖維化的機制

鐘正霞 裘志成

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，貴州 遵義 563000)

目的研究黃葵膠囊是否可以通過抑制缺氧誘導因子(HIF)-1α的表達改善單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型的腎間質(zhì)纖維化情況。方法將54只雄性成年Sprague-Dawley大鼠隨機分組，每組18只，分為對照組(即假手術組，Sham組)、單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立的腎纖維化模型組(UUO組)和模型+黃葵膠囊治療組(HK組)，UUO組及HK組大鼠進行左側(cè)輸尿管結(jié)扎建模，術后1 d起，HK組按照1 g/kg的劑量用黃葵膠囊進行灌胃，1次/d；Sham組及UUO組每天以等量生理鹽水進行灌胃。治療后第7、14天，分別處死各組中的9只大鼠，取左側(cè)腎臟組織，HE染色進行腎臟組織病理檢查及損傷評分，實時熒光定量PCR及蛋白免疫印跡法檢測腎臟組織中HIF-1α mRNA和蛋白的表達。結(jié)果UUO組與HK組術后均出現(xiàn)了腎臟局部的病理損害，但HK組腎損傷明顯較輕，各時間點HK組腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)與UUO組相比顯著降低；術后7 d與14 d，UUO組及HK組中的HIF-1α mRNA及蛋白表達水平均較Sham組顯著升高，而HK組中的HIF-1α mRNA及蛋白水平均顯著低于UUO組。結(jié)論黃葵膠囊可以通過降低腎纖維化模型中HIF-1α的水平緩解病情，修復腎損傷，是一種有效的抗腎間質(zhì)纖維化藥物。

黃葵膠囊；單側(cè)輸尿管梗阻；腎間質(zhì)纖維化;缺氧誘導因子-1α

慢性腎衰竭(CRF)是多種腎病晚期的轉(zhuǎn)歸。腎間質(zhì)纖維化(RIF)與CRF的發(fā)生與發(fā)展存在著緊密的關聯(lián)〔1〕。缺氧誘導因子(HIF)-1α是參與腎纖維化發(fā)生的重要分子〔2〕，腎臟損傷可能引起腎局部缺氧，造成HIF-1α上調(diào)，進而影響其下游靶基因的表達，而其中就包括了許多被異常激活的纖維化基因，最終引起RIF的發(fā)生〔3〕。黃葵膠囊是一種中藥制劑，多年來臨床研究已經(jīng)證實其具有腎臟保護、修復功能，對于多種腎臟疾病均有較好的療效〔4〕。本項研究建立由單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)引起的大鼠RIF模型，進而探討黃葵膠囊是否可以通過抑制HIF-1α的表達改善UUO大鼠模型的RIF情況，發(fā)揮其抗纖維化的功效。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重200～220 g)共54只購自南京君科生物工程有限公司，黃葵膠囊購自江蘇蘇中藥業(yè)有限公司，Trizol 試劑購自美國Thermo scientific 公司，SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ購自寶生物工程(大連)有限公司，兔抗大鼠HIF-1α抗體、GAPDH抗體，HRP 標記二抗購自美國Abcam公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，RIPA裂解液、BCA蛋白測定試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司，引物購自上海生工，序列：HIF-1α 上游引物5′-CAAGATCTCGGCGAAGCAA-3′，下游引物5′-GGTGAGCCTCATAACAGAAGCTTT-3′；GAPDH上游引物5′-TTCTAGAGACAGCCGCATCT-3′，下游引物5′-TGGTAACCAGGTGTCCGATA-3′。

1.2UUO模型的建立及實驗分組 將SD大鼠隨機分為對照組(即假手術組，Sham組)、單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立的腎纖維化模型組(UUO組)和模型+黃葵膠囊治療組(HK組)每組18只。UUO組及HK組大鼠進行建?！?〕：使用30 mg/kg巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉后，切開腹腔左側(cè)暴露左輸尿管，沿上端結(jié)扎兩道后縫合腹腔，而Sham組不結(jié)扎即進行縫合。于術后1 d起，HK組按照1 g/kg的劑量用黃葵膠囊灌胃，1次/d。Sham組及UUO組每天以等量的生理鹽水灌胃。在手術后的第7、14天，各組隨機選取9只大鼠處死，解剖后摘取左腎，分成2份，一份浸泡于10%甲醛液中固定后，用于蠟塊包埋和HE染色；其余組織于液氮中凍存，用于檢測組織中mRNA和蛋白的表達水平。

1.3腎臟組織病理檢查及損傷評分 蘇木精-伊紅(HE)染色后的切片在光鏡下觀察腎臟的病理損害程度，并以病變部分占染色總面積的百分比進行評分。評分共分為4級，其中0分表示正常，無病變發(fā)生，病變范圍<25%計為1分，表示輕度損傷，病變范圍25%～50%計為2分，表示中度損傷，病變范圍>50%計為3分，表示重度損傷。

1.4實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測HIF-1α在腎臟組織中的表達 使用Trizol試劑提取腎臟組織中的總RNA，然后使用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒，按照說明書進行RT-qPCR擴增。HIF-1α的表達以參照基因GAPDH的表達作為內(nèi)參，采用△△CT法進行計算，即△CT = HIF-1α基因 CT 值-GAPDH基因CT值，兩組表達倍數(shù)差異=2-△△Ct(△△CT =組1△CT -組2△CT)。

1.5蛋白免疫印跡法檢測腎臟組織中HIF-1α蛋白的表達 凍存的樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳進行蛋白分離，之后將SDS凝膠上的蛋白采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后加入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液(即封閉液)，在室溫條件下置于搖床上，進行2 h的封閉后，倒去封閉液，用TBST緩沖液洗膜后加入一抗(HIF-1α抗體及GAPDH抗體)4℃孵育過夜。第2天，用TBST緩沖液洗膜后，加入二抗孵育，再次洗膜后，加入ECL化學發(fā)光試劑進行發(fā)光顯色。

1.6統(tǒng)計學方法 使用SPSS19.0軟件，組間計量資料比較使用t檢驗，計數(shù)資料比較使用χ2檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析法(one-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1腎臟組織病理檢查及損傷評分 HE染色結(jié)果顯示Sham組術后7 d與14 d未見顯著異常病理改變，而UUO組與HK組術后7 d均出現(xiàn)了局部腎小管壞死、炎性細胞浸潤、膠原纖維增生及纖維化；而到了術后14 d時，這兩組中以上表現(xiàn)更顯著。而與同時間UUO組相比，HK組中大鼠腎損傷明顯較輕。在術后7 d與14 d，HK組腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)(TIDS)(1.11±0.56，1.44±0.50)與UUO組(1.77±0.62，2.11±0.57)相比均顯著降低，但與Sham組(0.33±0.47，0.22±0.42)相比仍顯著較高(P<0.05)。

2.2HIF-1α mRNA在各組大鼠腎臟組織中的表達 術后7 d，Sham組中HIF-1α mRNA表達(1.00±0.31)較低，UUO組(7.22±2.68)及HK組(5.51±2.65)中的HIF-1α mRNA水平均較Sham組顯著升高(均P<0.05)，而HK組中的HIF-1α mRNA水平則顯著低于UUO組(P<0.05)。術后14 d，UUO組(9.80±4.96)及HK組(6.46±2.46)中的HIF-1α mRNA水平仍顯著高于Sham組(1.00±0.32)(均P<0.05)，而HK組中的HIF-1α mRNA水平仍顯著低于UUO組(P<0.05)。

2.3各組大鼠腎臟組織中HIF-1α蛋白的表達 術后7 d及14 d，Sham組中HIF-1α蛋白表達均較低，UUO組及HK組中的HIF-1α蛋白水平均較Sham組顯著升高，而HK組中的HIF -1α的蛋白水平低于UUO組。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織中HIF-1α蛋白的表達

3 討 論

有研究表明，缺氧可能是造成梗阻性腎病發(fā)生發(fā)展的一個重要的獨立因素〔5〕，其機制可能是因為缺氧造成了腎臟局部氧氣及其他營養(yǎng)物質(zhì)的減少，進而引起了腎小管細胞的異常凋亡以及RIF，最終導致了腎小管病變并隨著其程度的不斷加深造成腎單位喪失〔6〕。HIF-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下，HIF-1可以與缺氧反應元件(HRE)進行結(jié)合，對其下游靶基因進行調(diào)控并產(chǎn)生效應〔7～9〕。HIF-1由α及β兩個亞單位組成，而其中的 HIF-1α 是其主要的活性亞基，可能參與RIF的發(fā)生，并在腎纖維化的發(fā)展中起到至關重要的作用〔10〕，本次研究說明，在UUO模型組的腎臟中的確產(chǎn)生了局部的缺氧狀況，而之前的觀點認為，這種局部缺氧的狀況很可能是因為對輸尿管結(jié)扎導致了腎臟局部組織內(nèi)的血液流動不暢，進而產(chǎn)生了血液循環(huán)方面的障礙。值得注意的是，在隨著輸尿管結(jié)扎時間的延長，其腎臟病變組織中HIF-1α的表達也呈現(xiàn)出增加的趨勢，這一點進一步證實隨著缺氧時間的增加，HIF-1α 的水平也逐漸升高，并且造成了腎臟的進一步損傷及纖維化。

黃葵膠囊是黃蜀葵花的提取物，其中的主要有效成分包括槲皮素、梅斗皮素、金絲桃苷、楊梅黃素等〔11〕。之前的多項研究已經(jīng)證實，黃蜀葵花及其提取物具有廣泛的殺菌、抗氧化、抗炎及抗血小板聚集作用。在腎病治療領域，其治療效果更為突出，黃葵膠囊可有效改善腎病患者的蛋白尿狀況，抑制腎小球的炎癥反應，從而修復腎小球損傷并改善其腎功能〔12〕。在本項研究中，我們發(fā)現(xiàn)使用黃葵膠囊對UUO大鼠進行治療后，其腎纖維化狀況得到了明顯改善，證實黃葵膠囊可能通過下調(diào)HIF-1α 的表達改善局部因缺氧造成的炎性反應，減少活性氧的累積，對局部的腎臟損傷起到修復和保護作用，進而延緩RIF的進一步發(fā)展。

1代明揚，王億平.腎間質(zhì)纖維化與氧化應激介導NF-κB關系及中醫(yī)藥防治〔J〕.中醫(yī)藥臨床雜志，2015；(7)：1028-31.

2Fang Y，Yu X，Liu Y，etal.miR-29c is downregulated in renal interstitial fibrosis in humans and rats and restored by HIF-α activation〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2013；304(10)：F1274-82.

3Menn-Josephy H，Lee CS，Nolin A，etal.Renal interstitial fibrosis：an imperfect predictor of kidney disease progression in some patient cohorts〔J〕.Am J Nephrol，2016；44(4)：289-99.

4唱云鳳，馬 進.黃葵膠囊治療原發(fā)性慢性腎小球腎炎蛋白尿的研究進展〔J〕.云南中醫(yī)中藥雜志，2015；36(12)：83-5.

5Shoji K，Tanaka T，Nangaku M.Role of hypoxia in progressive chronic kidney disease and implications for therapy〔J〕.Curr Opin Nephrol Hypertens，2014；23(2)：161-8.

6Du R，Xia L，Ning X，etal.Hypoxia-induced Bmi1 promotes renal tubular epithelial cell-mesenchymal transition and renal fibrosis via PI3K/Akt signal〔J〕.Mol Biol Cell，2014；25(17)：2650-9.

7Sch?rg A.Destruction of a distal hypoxia response element abolishes trans-activation of the PAG1 gene mediated by HIF-independent chromatin looping〔J〕.Nucleic Acids Res，2015；43(12)：5810-23.

8Slemc L，Kunej T.Transcription factor HIF1A：downstream targets，associated pathways，polymorphic hypoxia response element (HRE) sites，and initiative for standardization of reporting in scientific literature〔J〕.Tumour Biol，2016；37(11)：14851-61.

9Park J，Park SY，Shin E，etal.Hypoxia inducible factor-1α directly regulates nuclear clusterin transcription by interacting with hypoxia response elements in the clusterin promoter〔J〕.Mol Cells，2014；37(2)：178-86.

10Li X，Zhuang S.Recent advances in renal interstitial fibrosis and tubular atrophy after kidney transplantation〔J〕.Fibrogenesis Tissue Repair，2014；7：15.

11李 鑫，蔡蘭英，黨毓起.黃葵膠囊聯(lián)合用藥治療腎性蛋白尿的臨床研究進展〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2014；16(8)：109-12.

12焦 賀，邢夏囡，宋文剛.黃葵膠囊對大鼠腎小管間質(zhì)纖維化及PTEN的影響〔J〕.文摘版：醫(yī)藥衛(wèi)生，2015；(10)：299-300.

〔2016-12-07修回〕

(編輯 徐 杰)

遵義醫(yī)學院碩士啟動基金〔院字(2012)10號〕

鐘正霞(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腎病風濕病研究。

R692.3

A

1005-9202(2017)16-3952-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.019