MiR-126、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)與微血管密度在上皮性卵巢癌組織中的變化

秦巧紅，，

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科，河南 鄭州 450052)

MiR-126、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)與微血管密度在上皮性卵巢癌組織中的變化

秦巧紅，任琛琛，劉星爍

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科，河南 鄭州 450052)

目的探討miR-126、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)與微血管密度(MVD)在上皮性卵巢癌組織中的變化及意義。方法采用qRT-PCR檢測(cè)21例正常卵巢組織、23例良性卵巢腫瘤組織及45例上皮性卵巢癌組織中miR-126表達(dá)水平，采用免疫組化法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)及MVD。結(jié)果MiR-126在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)明顯低于正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織(P<0.05)；VEGF陽(yáng)性率和MVD在上皮性卵巢癌組織中明顯高于正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織(P<0.05)。上皮性卵巢癌組織中miR-126、VEGF及MVD與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論MiR-126、VEGF可能與上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤異常血管營(yíng)養(yǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

上皮性卵巢癌；微小核糖核酸；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；微血管密度

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)3大惡性腫瘤之一，惡性程度最高，病情發(fā)展快，且由于缺乏有效的早期診斷指標(biāo)，疾病發(fā)現(xiàn)時(shí)多已為中晚期。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miR)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)約21～25個(gè)核苷酸的小分子RNA，主要參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)分化、能量代謝、凋亡等各個(gè)重要而基本的細(xì)胞生理過(guò)程，并已經(jīng)被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、預(yù)后有著密切的關(guān)系[1-5]。MiR-126在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，可能在腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮抑癌基因的作用[6-7]，但其在卵巢癌中的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少且存在差異，miR-126可以靶向調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，通過(guò)與VEGF mRNA的3’非翻譯區(qū)中的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合，在翻譯水平抑制VEGF的表達(dá)。因此本課題針對(duì)miR-126在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)一步研究，并發(fā)現(xiàn)與之密切相關(guān)的VEGF及微血管密度(microvessel density，MVD)在上皮性卵巢癌組織中的變化情況。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源選取2010年3月至2016年8月鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科收治的病理科存檔的經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的89例組織標(biāo)本，包括正常卵巢上皮組織21例、良性卵巢腫瘤組織23例、上皮性卵巢癌組織45例。其中正常卵巢組織取材于因良性宮體疾病行附件切除患者；良性卵巢腫瘤組織取材于術(shù)前未經(jīng)化療、放療等輔助治療的良性卵巢腫瘤患者；上皮性卵巢癌組織取材于術(shù)前未行化療、放療等輔助治療的上皮性卵巢癌患者。45例上皮性卵巢癌患者年齡27～73(47.6±5.5)歲；按FIGO(2013)分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ、Ⅱ期12例，Ⅲ、Ⅳ期33例；組織學(xué)分級(jí)：低分化25例、中分化11例、高分化9例；病理類型：漿液性卵巢癌29例，黏液性卵巢癌8例，子宮內(nèi)膜樣癌4例，透明細(xì)胞癌4例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有34例，無(wú)11例。術(shù)中切取卵巢部分組織立即置液氮中速凍后移入-80 ℃冰箱中保存，用于qRT-PCR檢測(cè)；部分組織用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，用于免疫組化檢測(cè)。

1.2主要試劑TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Master Mix均購(gòu)自美國(guó)Tiangen公司；引物由南京金斯瑞生物有限公司合成。兔抗人VEGF一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京博奧森公司。

1.3免疫組化S-P法檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)及MVDVEGF主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜,細(xì)胞質(zhì)含有棕黃色顆粒的細(xì)胞計(jì)為陽(yáng)性，選擇5個(gè)高倍鏡下計(jì)數(shù)的卵巢上皮組織細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù),得出陽(yáng)性細(xì)胞百分率,采用半定量積分法判定結(jié)果，以其陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)，≤5%為陰性(-)，6%～25%為弱陽(yáng)性(+)，26%～50%為中等強(qiáng)度陽(yáng)性(++)，≥51%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，其中后三者均記為陽(yáng)性。CD34以血管內(nèi)皮細(xì)胞染為棕黃色作陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。腫瘤細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)孤立的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞或管腔面積<8個(gè)紅細(xì)胞，且管壁無(wú)肌層者代表1條單獨(dú)的微血管在低倍鏡(×200)下檢查微血管染色情況，取5個(gè)癌巢間質(zhì)血管最多的視野即血管熱點(diǎn)區(qū)，換高倍鏡(×400)計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的MVD,平均值即作為該例標(biāo)本的MVD值。

1.4qRT-PCR檢測(cè)miR-126表達(dá)1)RNA提取、檢測(cè)：使用miRNA提取試劑盒，在液氮下將卵巢組織研磨成粉狀，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA純度及濃度；2)miR-126反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增：取3 μL總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)體系為10 μL，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃孵育60 min；用qRT-PCR檢測(cè)，以U6 snRNA作為內(nèi)參，取cDNA 1 μL,總反應(yīng)體系為20 μL；反轉(zhuǎn)錄條件：95 ℃ 15 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 60 s,共40個(gè)循環(huán)。以2-△ct表示組織中目的基因表達(dá)量相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)倍數(shù)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 MiR-126相關(guān)引物序列

2 結(jié)果

2.13種卵巢組織中miR-126表達(dá)水平上皮性卵巢癌組中miR-126相對(duì)表達(dá)量(ln值)為-1.759(-3.506～-0.001)，低于正常卵巢組織[0.796(-0.578～2.810)]、良性卵巢腫瘤組織[-0.659(-1.194～0.001)](P<0.05)。上皮性卵巢癌組織中miR-126相對(duì)表達(dá)量(ln值)與上皮性卵巢癌的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 MiR-126表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.23種卵巢組織中VEGF表達(dá)水平3種卵巢組織中VEGF表達(dá)水平總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。上皮性卵巢癌組織中VEGF陽(yáng)性表達(dá)率[80.00%(36/45)]明顯高于正常卵巢腫瘤組織[23.81%(5/21)]和良性卵巢腫瘤組織[52.17%(12/23)](P<0.017)。見(jiàn)表3。

2.33種卵巢組織中MVD計(jì)數(shù)結(jié)果3種卵巢組織中MVD總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。MVD值在上皮性卵巢癌組織(22.013±3.329)中明顯高于正常卵巢組織(6.133±2.090)、良性卵巢腫瘤組織(11.478±2.337)(P<0.05)。上皮性卵巢癌組織中MVD與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.4上皮性卵巢癌組織中miR-126、VEGF、MVD之間的相關(guān)性MiR-126與VEGF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.532，P<0.05)；miR-126與MVD呈負(fù)相關(guān)(r=-0.589，P<0.05);VEGF與MVD呈正相關(guān)(r=0.703，P<0.05)。

表3 VEGF表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 n(%)

表4 MVD與上皮性卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

MiR是一類不編碼蛋白質(zhì)的單鏈小RNA[5]，在腫瘤疾病中miR可以作為癌基因或抑癌基因，在卵巢癌中miR也發(fā)揮重要作用，但miR-126在上皮性卵巢癌中的研究卻存在著差異。本研究結(jié)果顯示，miR-126在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)低于正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織，且miR-126表達(dá)與上皮性卵巢癌的FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示該指標(biāo)可能與上皮性卵巢癌預(yù)后相關(guān)，有作為上皮性卵巢癌的預(yù)后檢測(cè)指標(biāo)的潛能。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的促進(jìn)血管新生的因子，能夠促進(jìn)腫瘤血管新生，使腫瘤細(xì)胞更易于侵入和穿透血管，實(shí)現(xiàn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，研究[6]表明VEGF可能參與了上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，并在上皮性卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移中有著重要作用。MVD是評(píng)估血管生成情況的指標(biāo)之一[7]。本研究結(jié)果顯示，VEGF、MVD在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)高于正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織，且兩者均與上皮性卵巢癌的FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示VEGF、MVD可能參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展?？傊谏掀ば月殉舶┌l(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，可能由于miR-126表達(dá)的下降，對(duì)VEGF的表達(dá)抑制減弱，促進(jìn)腫瘤血管的生成，這為上皮性卵巢癌的治療提供新的靶點(diǎn)選擇。

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ChangesofMiR-126,VascularEndothelialGrowthFactorandMicrovesselDensityintheEpithelialOvarianCancer

QIN Qiaohong, REN Chenchen, LIU Xingshuo

(DepartmentofGynecology,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

ObjectiveTo investigate the expressions of miR-126 and vascular endothelial growth factor (VEGF), microvessel density (MVD) in the epithelial ovarian cancer.MethodsqRT-PCR was performed to detect the expressions of miR-126 in the 21 cases of normal epithelial ovarian tissues, 23 cases of benign epithelial ovarian neoplasm tissues, 45 case of epithelial ovarian cancer tissues; immunohistochemical staining S-P method was performed to detect VEGF and microvessle density.ResultsThe expression of miR-126 in the epithelial ovarian cancer was significantly lower than those in the normal epithelial ovarian tissues and the benign epithelial ovarian neoplasm tissues (P<0.05); VEGF and MVD in the epithelial ovarian cancer were significantly higher than those in the normal epithelial ovarian tissues and the benign epithelial ovarian neoplasm tissues (P<0.05)； miR-126, VEGF and MVD were related with the FIGO pathological types and lymph node metastases (P>0.05).ConclusionMiR-126 and VEGF play an important role in the occurrence, progression, angiogenesis, invasion and metastasis of epithelial ovarian cancer.

epithelial ovarian cancer; micro ribonucleic acid; vascular endothelial growth factor; microvessel density

秦巧紅(1983-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦科腫瘤方面的研究。E-mail：qin_qiaohong@126.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.04.001

R737.31;R730.23

A

1673-5412(2017)04-0277-04

2016-10-23)