肝脂肪變對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織學(xué)進展的影響及分子機制的研究

柳銀蘭 劉靜 陸璐 莊振杰 羅燕 施軍平?

肝脂肪變對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織學(xué)進展的影響及分子機制的研究

柳銀蘭 劉靜 陸璐 莊振杰 羅燕 施軍平?

目的 探討肝脂肪變對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織學(xué)進展的影響及肝臟脂質(zhì)代謝和纖維化相關(guān)的關(guān)鍵信號分子基因表達的變化。方法 用H&E染色、血生化檢測及熒光定量PCR的方法，比較高脂飲食和普通飲食喂養(yǎng)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟病理、生化指標(biāo)及脂質(zhì)代謝和纖維化相關(guān)基因的表達變化。結(jié)果 高脂飼料喂養(yǎng)使HBV-DNA下降（P＜0.05），肝組織NAS病理評分增加（P＜0.05），PPARα、SMAα、Coll-I、TGFβ1、SMAD3表達增高，PPARγ、SMAD7表達降低。結(jié)論 高脂飲食可影響HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織學(xué)進展，其影響可能與SMAα、Coll-I、核因子PPARα、TGFβ1/SMAD3基因表達上調(diào)及SMAD7、PPARγ下調(diào)有關(guān)。

高脂飲食 肝脂肪變 乙型肝炎病毒 轉(zhuǎn)基因

乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染系一進展性疾病，約15%～40%的慢性HBV感染者最終將進展為肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌（HCC）而致死［1］。非酒精性脂肪肝（NAFLD）是由各種致病因子所致的肝內(nèi)脂肪變，是一種與胰島素抵抗、脂代謝紊亂和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷，目前已成為全球重要的公共健康問題之一［2］。與慢性乙型肝炎（CHB）一起構(gòu)成慢性肝病的兩大主要病因。2011年4月至2012年10月作者通過實驗，探討肝脂肪變對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織學(xué)進展的影響及脂肪變關(guān)鍵信號分子基因表達的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 4周齡BALB/c HBV轉(zhuǎn)基因小鼠50只，體重18～22g，雌雄各半，由廣州空軍458醫(yī)院提供。高脂組小鼠30只予以高脂飼料喂養(yǎng)，正常組小鼠20只予以普通飼料喂養(yǎng)。24周末隨機處死高脂組、正常組小鼠各10只，經(jīng)肝組織及血清學(xué)檢測確認目標(biāo)模型建立。造模成功后將高脂組小鼠再隨機分為模型組和對照組，每組各10只，模型組小鼠繼以高脂飼料喂養(yǎng)，對照組改以普通飼料喂養(yǎng)，正常組小鼠維持原普通喂飼，連續(xù)72周（含造模24周）。

1.2 觀察標(biāo)本采集 分別于第24、72周末禁食不禁水12h后，眼球采血后處死小鼠，3000r/min離心10min分離血清，-20℃保存用于血清學(xué)指標(biāo)檢測。迅速分離整個肝臟稱重后，于肝右葉中部切取肝組織3mm×3mm×6mm，以4%多聚甲醛固定（以pH7.4的PBS配制），逐級酒精二甲苯脫水，常規(guī)石蠟包埋切片用于病理檢查及免疫組化染色。

1.3 指標(biāo)檢測及方法 （1）一般情況：稱重1次/周，觀察體質(zhì)量、食欲行為、狀態(tài)、毛發(fā)、小鼠死亡情況；實驗結(jié)束后處死小鼠稱肝臟濕重，并計算肝指數(shù)（肝重/體質(zhì)量×100%）。（2）病理組織學(xué)檢查：常規(guī)HE染色，光鏡下觀察小鼠肝細胞脂肪變性程度、氣球樣變性、小葉內(nèi)及匯管區(qū)炎癥程度以評定NAFLD活動度計分（NAS），脂肪肝病理組織學(xué)診斷參考非酒精性脂肪性肝炎（NASH）臨床研究網(wǎng)絡(luò)病理委員會制定的NAFLD組織學(xué)評分系統(tǒng)［3］。見表1。（3）血清生化指標(biāo)檢測：采用BECKMAN 5400全自動生化儀測定血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、空腹血糖（FBG）的含量或活性；其中ALT、AST活性采用速率法；TC、TG含量采用雙試劑酶法；FBG含量采用過氧化物酶-氧化酶法進行檢測。（4）HBV-DNA 及各信號分子基因表達的檢測：Trizol法提取總RNA，應(yīng)用英俊MMLT-V逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取1μlcDNA 為模板，加入2×SYBR Super Mix 12.5μl，引物終濃度為400μM，加水使反應(yīng)終體積為25μl。引物序列見表2，由生工生物工程有限公司合成。以Actin 為內(nèi)參，mRNA 與內(nèi)參相對表達量用2-ΔΔCt值表示。

表1 NAFLD組織學(xué)評分系統(tǒng)

表2 熒光定量PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清生化指標(biāo) 高脂喂養(yǎng)24周后，BALB/c HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體質(zhì)量較正常組明顯升高，血清ALT、TC、TG水平較正常組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩組AST、FBG水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）見表3。喂養(yǎng)72周后，模型組、對照組及正常組小鼠血清ALT、AST、TC、TG、FPG水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表3 24周后各組實驗小鼠一般情況、體質(zhì)指標(biāo)和生化指標(biāo)比較（x±s）

表4 72周各組實驗小鼠一般情況、體質(zhì)指標(biāo)和生化指標(biāo)比較（x±s）

2.2 各組小鼠血清HBV-DNA水平 24周末模型組和正常組BALB/c HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBV-DNA均陽性，正常組HBV-DNA水平明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；72周末模型組、正常組及對照組小鼠血清HBV-DNA均陽性，模型組小鼠血清HBV-DNA水平明顯低于對照組及正常組（P＜0.05）。見表5。

表5 小鼠血清HBV-DNA水平比較［Log10 copies/mL，（x±s）］

2.3 小鼠肝臟病理學(xué)變化 高脂喂養(yǎng)24周后，小鼠肝組織HE染色示肝細胞無明顯脂肪變性和小葉內(nèi)淋巴細胞浸潤，模型組與對照組NAS積分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。72周末，模型組小鼠肝組織HE染色示肝細胞明顯大泡性脂肪變性和小葉內(nèi)淋巴細胞浸潤，NAS積分較對照組及正常組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 小鼠肝組織NAFLD活動度積分比較（x±s）

2.4 小鼠肝組織各基因mRNA 的表達 72周模型組PPARα、SMAα、Coll-I、TGFβ1、SMAD3 mRNA表達較正常組明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PPARγ、SMAD7表達較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各信號分子異常表達在對照組出現(xiàn)改善，其中PPARα、PPARγ、SMAD7表達接近于正常組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠72周時肝臟目標(biāo)基因表達

3 討論

CHB和NAFLD已逐漸成為威脅我國人民健康的兩大肝病。Fan［4］等研究報道CHB與NAFLD并存患者愈來愈多，已成為國人常見的慢性肝病。研究顯示，NAFLD和CHB之間可能存在復(fù)雜的相互作用，NAFLD合并CHB在危險因素、疾病進展和轉(zhuǎn)歸預(yù)后等方面不同于單純的NAFLD或CHB［5］。然而，目前尚無針對HBV慢性感染合并NAFLD建立的成熟動物模型，相關(guān)發(fā)病機制無法進一步深入研究。本資料結(jié)果顯示小鼠體質(zhì)量較初始明顯升高，各項生化指標(biāo)與正常組小鼠相比明顯升高，血清HBVDNA檢測陽性，光鏡下發(fā)現(xiàn)肝細胞明顯脂肪變性，肝小葉內(nèi)淋巴細胞浸潤明顯，纖維化不明顯，NAS評分接近NASH，故而認定高脂喂養(yǎng)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠可建立慢性HBV攜帶合并NAFLD小鼠模型。

肝脂肪變性常發(fā)生于慢性病毒性肝炎，即CHB和慢性丙型肝炎（CHC）。目前研究多認為感染丙型肝炎病毒（HCV）基因3 型的人肝臟脂肪變可直接歸因于丙型肝炎病毒，其機制與HCV 核心蛋白抑制微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運蛋白（MTP）活性，干擾極低密度脂蛋白（VLDL）在肝內(nèi)的裝配和分泌有關(guān)［6］。且HCV 核心蛋白與載脂蛋白AⅡ（Apo AⅡ）相互作用形成異二聚體，干擾破壞肝細胞中脂類代謝的正常通路，導(dǎo)致肝細胞脂肪變［7］。HCV Ⅰ型和Ⅳ型的感染，胰島素抵抗和氧化應(yīng)激可能促使脂肪酸重新生物合成，損傷線粒體β氧化作用，并干擾甘油三酯的組裝和合成［8］。本資料結(jié)果顯示24周末模型組與正常組小鼠各項血清生化指標(biāo)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而72周末三組小鼠血清生化指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示HBV病毒感染可能影響肝臟脂肪代謝，從而導(dǎo)致肝細胞脂肪變。本資料中，高脂飼料喂養(yǎng)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠72周后，模型組小鼠肝組織SMAα、Coll-I基因表達較正常組增高提示纖維化進程的啟動，核因子PPARα上調(diào)、PPARγ下調(diào)、TGFβ1/SMAD3上調(diào)及SMAD7下調(diào)參與其肝組織學(xué)病變的進展，提示高脂飲食會加重HBV慢性感染合并NAFLD的進展；對照組各信號分子基因表達較模型組有所改善，與正常組基本接近，提示調(diào)整飲食可減緩HBV慢性感染合并NAFLD的進展，也印證HBV慢性感染合并NAFLD的治療首要是改變生活方式，調(diào)整飲食結(jié)構(gòu)。

［1］ 劉萱,賈繼東．乙型肝炎病毒感染的自然病程．中華肝臟病雜志,2006,14(3):210-211．

［2］ Affo S,Morales-Ibanez O,Rodrigo-Torres D,et al． CCL20 mediates lipopolysaccharide induced liver injury and is a potential driver of inflammation and fibrosis inalcoholic hepatitis．Gut,2014,23(1):32-36．

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［4］ Fan JG．Farrell GC．Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in China．Hepamol,2009,50:204-210．

［5］ Yen SL,Chiu YT,Lin YC,et al．Obesity and hepatitis B infection are associated with increased risk of metabolic syndrome in university freshmen．Int Obes(Lond),2008,32:475-480．

［6］ Perlemuter G,Sabile A,Letteton P,et al． Hepatitis C virus core protein inhibits microsomal triglyceride transfer protein activity and very low density lipoprotein secretion:a model of viral-related steatosis．Faseb J,2002,16(2):185-194．

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［8］ Bjornsson E,Angulo P． Hepatitis C and steatosis．Arch Med Res,2007,38:621-627．

Objective To investigate how hepatic steatosis affects the pathologic progression of HBV transgenic mice and the alteration in expression of key molecule related to lipid metabolism and fibrosis. Method H&E staining，biochemistry test and realtime PCR were employed to study the changes caused by high fat diet in liver pathology，serum biochemistry，lipid metabolism and fibrosis related gene expression. Results High fat diet decreased HBV-DNA level and increased the NAS score（P＜0.05），the expression levels of PPARα、SMAα、Coll-I、TGFβ1、SMAD3 were upregulated and PPARγ、SMAD7 were downregulated. Conclusion The effect of liver steatosis on the pathology progression of HBV transgenic mice is related to the upregulation of SMAα、Coll-I、PPARα、TGFβ1/SMAD3 and downregulation of SMAD7、PPARγ.

High fat diet Liver steatosis HBV transgenic mouse

浙江省自然科學(xué)基金項目（LQ17H070002）；杭州市科技發(fā)展計劃基金項目（20140633B09）

300014 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院

*通信作者