SOCS3在內(nèi)毒素誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞耐受模型中的變化

謝澤鋒 李蘋 辛崗 陳城 李康生 蘇蕓?

·論著·

SOCS3在內(nèi)毒素誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞耐受模型中的變化

謝澤鋒 李蘋 辛崗 陳城 李康生 蘇蕓?

目的 探討內(nèi)毒素（脂多糖，lipopolyssacride，LPS）體外誘導(dǎo)小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞耐受模型中細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（Suppressor of Cytokine Signaling 3，SOCS3）信號(hào)的變化。方法 分離純化新生小鼠大腦皮質(zhì)星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，采用LPS進(jìn)行預(yù)刺激（先采用0.01μg/ml LPS刺激18h后，再用1μg/ml LPS刺激24h）誘導(dǎo)LPS耐受，同時(shí)設(shè)置未刺激組、0.01μg/ml LPS和1μg/ml LPS單次刺激組對(duì)照。收獲細(xì)胞與上清液，采用ELISA法檢測(cè)星型膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6水平，Western blot 檢測(cè)SOCS3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 LPS預(yù)刺激組產(chǎn)生IL-6水平與未刺激對(duì)照組，0.01μg/ml單次刺激組、1μg/ml單次刺激組相比水平升高，其中星型膠質(zhì)細(xì)胞與1μg/ml單次刺激組比較升高明顯（P＜0.05）；星型膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞預(yù)激組SOCS3表達(dá)均有升高趨勢(shì)。結(jié)論 SOCS3-IL-6信號(hào)軸與中樞神經(jīng)細(xì)胞群LPS耐受效應(yīng)密切相關(guān)，參與中樞LPS耐受細(xì)胞負(fù)控信號(hào)的重新調(diào)整。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 內(nèi)毒素耐受 細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞耐受模型培養(yǎng)上清液中IL-6水平 星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的水平，0.01μg/ ml，1μg/ml單次刺激組及預(yù)刺激組水平明顯升高（P＜0.05）。其中預(yù)刺激組中與1μg/ml單次刺激組比較水平升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞，0.01μg/ml、 1μg/ml LPS單次刺激組、預(yù)刺激組IL-6水平比未刺激對(duì)照組亦有升高趨勢(shì)，其中預(yù)刺激組中比對(duì)照組水平升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖1）。

圖1 LPS誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞耐受模型中IL-6的水平

圖2 LPS誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞耐受模型中SOCS3蛋白的表達(dá)水平

2.2 LPS誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞耐受模型SOCS3蛋白表達(dá)水平的影響 星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)LPS預(yù)處理后SOCS3蛋白水平的表達(dá)比1μg/ml單次刺激組略增加（見圖2A，2B）。小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)LPS預(yù)處理后SOCS3蛋白水平的表達(dá)比1μg/ml單次刺激組有增加趨勢(shì)（圖2C，2D）。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞LPS耐受模型建立：接種于6孔板的星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞按照處理方式分為未刺激對(duì)照組、0.01μg/ml LPS單次刺激組、1μg/ml LPS單次刺激組、預(yù)刺激組。其中預(yù)刺激組先用10ng/ml LPS預(yù)處理18h，再用1μg/ml LPS刺激24h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，-30℃保存待用。（3）SOCS3表達(dá)的檢測(cè)：細(xì)胞收獲后采用Western blot檢測(cè)SOCS3的蛋白水平。裂解細(xì)胞蛋白，樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)移、封閉后加入抗SOCS3稀釋抗體4℃孵育過夜。加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫孵育后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，Image J軟件根系條帶信號(hào)強(qiáng)度獲取各條帶的吸光度值。計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量：SOCS3蛋白吸光度值/內(nèi)參照β-actin比值。（4）IL-6水平的檢測(cè)：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6 水平，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

LPS耐受效應(yīng)通常表現(xiàn)為面臨LPS再次刺激時(shí)，靶細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子減少，從而削弱全身性炎癥損傷。星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞是介導(dǎo)中樞內(nèi)免疫反應(yīng)的活性細(xì)胞，在多種腦部疾病中如某些神經(jīng)退行性疾病、腦缺血發(fā)生明顯炎癥反應(yīng)時(shí)，出現(xiàn)過度激活，多種分子表達(dá)上調(diào)及炎性因子的釋放增加［7-8］。有實(shí)驗(yàn)表明，先以小劑量LPS預(yù)處理，可降低再次腦卒中、腦創(chuàng)傷炎癥損傷，由此減輕腦組織功能障礙［3，9］；采用LPS預(yù)處理后亦可抑制某些免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)而延緩實(shí)驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的病程［10］。本資料結(jié)果顯示采用小劑量LPS預(yù)激時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α的水平降低［11］；而IL-6水平增加。表明通過LPS預(yù)處理誘導(dǎo)靶細(xì)胞耐受模型，在不同類型的細(xì)胞中不同免疫指標(biāo)其反應(yīng)性具有差異，表現(xiàn)為部分參數(shù)為激活反應(yīng)。在LPS耐受誘導(dǎo)過程中，某些負(fù)性調(diào)節(jié)因子如SOCS3蛋白成員參與了調(diào)節(jié)過程。SOCS3在多種細(xì)胞因子的激活（尤其是gp130細(xì)胞因子超家族成員如IL-6）的JAK/STAT途徑中起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用［5-6］，且能抑制某些細(xì)胞因子引發(fā)的STAT依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［12］。研究表明，SOCS1、SOCS3基因缺陷的小鼠無法誘導(dǎo)LPS耐受，而增加SOCS1的表達(dá)可明顯抑制NF-κB的激活［13］。本資料結(jié)果顯示SOCS3的水平在LPS預(yù)處理后表達(dá)有增加趨勢(shì)，這與其他具有LPS耐受效應(yīng)靶細(xì)胞的變化趨勢(shì)一致，表明其SOCS3確實(shí)參與LPS預(yù)激誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞耐受信號(hào)分子的再調(diào)整，從而抑制某些促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生后引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。雖然呈現(xiàn)LPS預(yù)激后星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6的水平增加，但靶細(xì)胞依然可以調(diào)動(dòng)相關(guān)的負(fù)反饋因子如上調(diào)SOCS的表達(dá)來限制其生物學(xué)效應(yīng)，這也進(jìn)一步證明LPS耐受不是某種特定細(xì)胞單一的抑制反應(yīng)，而是一系列復(fù)雜適應(yīng)性調(diào)節(jié)后產(chǎn)生的綜合效應(yīng)。另外，由于中樞尚存在其他分子或細(xì)胞群參與IL-6與SOCS3間的多點(diǎn)調(diào)控［14-15］。且考慮到不同種類細(xì)胞因子的產(chǎn)生是動(dòng)態(tài)變化，因此，SOCS3的誘導(dǎo)表達(dá)在時(shí)效上存在差異，即使在兩類細(xì)胞LPS耐受誘導(dǎo)中其上調(diào)幅度較低，但一定程度上還是能削減炎性因子的效應(yīng)，由此最終避免中樞細(xì)胞群的不可逆性損傷。

［1］ Fujita T．Molecular mechanism of endotoxin tolerance．Hepatology, 2009,50(4):1322．

［2］ Draisma A,Pickkers P,Bouw MP,et al．Development of endotoxin tolerance in humans in vivo．Crit Care Med,2009,37(4):1261-1267．

［3］ Leung PY, Packard AE, Stenzel-Poore MP． It's all in the family:multiple Toll-like receptors offer promise as novel therapeutic targets for stroke neuroprotection． Future Neurol, 2009, 4(2): 201-208．

［4］ Piao W,Song C,Chen H,et al．Endotoxin tolerance dysregulates MyD88- and Toll/IL-1R domain-containing adapter inducing IFN-beta-dependent pathways and increases expression of negative regulators of TLR signaling．J Leukoc Biol,2009,86(4):863-875．

［5］ Croker BA,Krebs DL,Zhang JG,et al．SOCS3 negatively regulates IL-6 signaling in vivo．Nat Immunol,2003,4(6):540-545．

［6］ Lang R,Pauleau AL,Parganas E,et al．SOCS3 regulates the plasticity of gp130 signaling．Nat Immunol,2003,4(6):546-550．

［7］ Lee SC, Liu W, Dickson DW, et al． Cytokine production by human fetal microglia and astrocytes． Differential induction by lipopolysaccharide and IL-1 beta． J Immunol, 1993,150(7):2659-2667．

［8］ Norden DM, Trojanowski PJ, Villanueva E, et al． Sequential activation of microglia and astrocyte cytokine expression precedes increased Iba-1 or GFAP immunoreactivity following systemic immune challenge．Glia,2016,64(2):300-316．

［9］ Stevens SL, Stenzel-Poore MP．Toll-like receptors and tolerance to ischaemic injury in the brain．Biochem Soc Trans,2006,34(Pt 6):1352-1355．

［10］ Buenafe AC, Bourdette DN．Lipopolysaccharide pretreatment modulates the disease course in experimental autoimmune encephalomyelitis．J Neuroimmunol,2007,182(1-2):32-40．

［11］ Xie ZF, Xin G, Xu YX, et al． LPS-Primed Release of HMGB-1 from Cortical Astrocytes is Modulated Through PI3K/AKT Pathway． Cell Mol Neurobiol,2016,36(1):93-102．

［12］ Baetz A, Frey M, Heeg K, et al． Suppressor of cytokine signaling(SOCS) proteins indirectly regulate toll-like receptor signaling in innate immune cells．J Biol Chem,2004,279(52):54708-54715．

［13］ Liu ZJ, Liu XL, Zhao J, et al． The effects of SOCS-1 on liver endotoxin tolerance development induced by a low dose of lipopolysaccharide are related to dampen NF-kappaB-mediated pathway． Dig Liver Dis,2008,40(7):568-577．

［14］ Biswas SK, Lopez-Collazo E． Endotoxin tolerance: new mechanisms, molecules and clinical significance． Trends Immunol, 2009, 30(10):475-487．

［15］ Morris M, Li L． Molecular mechanisms and pathological consequences of endotoxin tolerance and priming． Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2012,60(1):13-18．

Objective To study the changes of SOCS3 expression in LPS-induced mice glia cell tolerant（majorly referring to astrocytes and microglia）. Methods Mice astrocytes and microglia were purified in vitro. Then the astrocytes and microglia were pretreated with 0.01ug /ml of LPS for 18 hours，and

the second times of treatment with 1ug/ml of LPS for 24 hours to induce LPS tolerance. Non-treated group，0.01ug/ml of LPS treated group，1ug/ml of LPS treated-group were also designed as control. After the treatment，the cells and cultured supernatants were harvested for determination of IL-6 by ELISA，SOCS3 expression by western blot. Results IL-6 levels were increased with LPS treatment（P＜0.05）. In astrocytes，IL-6 level was higher in LPS-pretreated group than that in lug/ml of LPS-treated group（P＜0.05）. LPS pretreatment tended to enhance the expression of SOCS3 protein. Conclusion SOCS3 pathway can involve in the re-adaption LPS tolerance in the neuroglia，which is one of the negative modulator of cellular signal in LPS tolerance of central nervous system.

Neural glia Endotoxin tolerance SOCS3

1 材料與方法

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81001340，81471622）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目（A2015211）；廣東省優(yōu)秀青年教師培訓(xùn)計(jì)劃（Yq2013079）；廣東省高水平大學(xué)建設(shè)項(xiàng)目子項(xiàng)目（2015013），汕頭大學(xué)創(chuàng)新強(qiáng)校青年教師人才培育項(xiàng)目

515041 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（謝澤鋒）

515041汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室（李蘋 辛崗 陳城 李康生 蘇蕓）

*通信作者

內(nèi)毒素（LPS）耐受，是機(jī)體或細(xì)胞的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制，可通過不同劑量LPS或LPS類似物處理誘導(dǎo)產(chǎn)生［1-2］。LPS耐受情況下，促炎介質(zhì)及其他的損傷因子受到重新調(diào)節(jié)，由此防止過度炎癥損傷效應(yīng)［3］。研究表明，LPS預(yù)處理誘導(dǎo)免疫耐受，可減輕腦部炎性損傷，這可能是外周或中樞免疫細(xì)胞通過重新調(diào)節(jié)其功能和信號(hào)所致［4］。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子（Suppressor of Cytokine Signaling，SOCS）是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)控通路中的重要分子，參與尤其是gp130細(xì)胞因子超家族成員如IL-6多種細(xì)胞因子的激活［5-6］。2014年1月至2016年12月作者在體外星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞中建立LPS耐受模型，檢測(cè)兩類細(xì)胞中SOCS3與IL-6的表達(dá)水平，探討中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞群LPS耐受誘導(dǎo)機(jī)制。

1.1 材料 包括購自GIBCO公司的DMEM/F12、0.25%Trypsin-0.02%EDTA、抗生素；四季青公司的胎牛血清；Sigma公司的內(nèi)毒素（LPS，Escherichia coli，O111：B4）；星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物抗體（Abcam公司）：抗GFAP抗體，抗CD11b抗體；SOCS3抗體（Santa Cruz公司），辣根過氧化酶標(biāo)記二抗、細(xì)胞裂解液購自碧云天；IL-6 ELISA 試劑盒（達(dá)科為）。1.2 方法 （1）小鼠大腦皮層神經(jīng)膠質(zhì)的培養(yǎng)與分離純化：無菌分離新生C57BL/6小鼠（出生24h內(nèi)）大腦皮質(zhì)，去除成纖維細(xì)胞后放置培養(yǎng)。培養(yǎng)第2天，第4天，之后再按1次/5～7d更換培養(yǎng)基，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶。長(zhǎng)成單層的膠質(zhì)細(xì)胞用0.05%胰酶37℃消化約10min，胰酶液經(jīng)終止、離心后培養(yǎng)1d。再將細(xì)胞培養(yǎng)瓶固定于定軌搖床中進(jìn)行水平震蕩（37℃、200r/min、振幅30 mm，60min），棄懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1d后，按上述方法再次進(jìn)行震蕩分離，得到純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。而原瓶細(xì)胞在加入0.1%胰酶37℃消化約15min，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞脫落后，棄去消化液，經(jīng)清洗后加入胰酶消化液37℃消化5～10min得到小膠質(zhì)細(xì)胞組分。兩類細(xì)胞分別使用抗GFAP抗體，抗CD11b抗體檢測(cè)純度，其中星型膠質(zhì)細(xì)胞占97%，小膠質(zhì)細(xì)胞占＞95%。兩類細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞密度接種6孔板繼續(xù)培養(yǎng)24h，用于后續(xù)處理。（2）