慢病毒介導(dǎo)SIRT1基因表達(dá)降低的ATDC5細(xì)胞模型建立*

于斐 曾暉翁鑒 林健靜 解笑宸 孫軍營 肖德明

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨科，廣東深圳518036）

慢病毒介導(dǎo)SIRT1基因表達(dá)降低的ATDC5細(xì)胞模型建立*

于斐 曾暉**翁鑒 林健靜 解笑宸 孫軍營 肖德明

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨科，廣東深圳518036）

背景：沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1,SIRT1）基因是一個(gè)與衰老關(guān)系密切的基因，可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT、NF-κB等信號通路影響到組織及機(jī)體的衰老過程，并參與骨科相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。建立慢病毒介導(dǎo)的SIRT1基因表達(dá)降低的ATDC5細(xì)胞模型，可以為研究SIRT1基因相關(guān)的骨科系統(tǒng)疾病如骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目的：構(gòu)建攜帶小鼠SIRT1基因的RNAi慢病毒載體，將其轉(zhuǎn)染ATDC5細(xì)胞系，建立SIRT1基因表達(dá)降低的ATDC5細(xì)胞模型。方法：根據(jù)RNAi序列設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)并合成SIRT1基因的RNAi靶點(diǎn)序列，連接GV248（框架結(jié)構(gòu)：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin）載體，轉(zhuǎn)化后經(jīng)陽性克隆測序及PCR鑒定，質(zhì)粒抽提后導(dǎo)入293T細(xì)胞，包裝慢病毒，取上清檢測滴度。將含有小鼠SIRT1基因RNAi的病毒顆粒轉(zhuǎn)染ATDC5細(xì)胞系，并于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，行RT-PCR檢測ATDC5細(xì)胞中SIRT1 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果：經(jīng)測序、PCR檢測可知，SIRT1基因的RNAi靶點(diǎn)序列與GV248載體連接成功，并包裝成高滴度的慢病毒。攜帶小鼠SIRT1基因的RNAi慢病毒感染ATDC5細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察顯示感染率較高，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，攜帶SIRT1基因的慢病毒感染組SIRT1基因mRNA的相對表達(dá)量為0.386±0.117，與陰性對照病毒感染組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），敲減效率為61.4%。結(jié)論：成功建立SIRT1基因表達(dá)降低的ATDC5細(xì)胞模型，為研究SIRT1基因相關(guān)骨科系統(tǒng)疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

基因；細(xì)胞；細(xì)胞模型；慢病毒屬

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1,SIRT1）基因是一個(gè)與衰老關(guān)系密切的基因[1]，位于10號染色體，編碼的蛋白質(zhì)由500個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，通過去乙?；姆绞絽⑴c到下游基因及蛋白的調(diào)控過程中，并通過控制新陳代謝[2]、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[3]、預(yù)防病毒感染[4]等多種作用參與到機(jī)體衰老進(jìn)程。該基因具有高度保守的核心序列，可以通過多條信號通路，如AKT/PI3K[5]、NF-κB[6]等的作用參與到骨科系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中，在調(diào)節(jié)機(jī)體正常功能方面起到重要的作用。

ATDC5細(xì)胞是一種小鼠源性的細(xì)胞系，是由胚胎瘤細(xì)胞AT805衍生而來，與原代軟骨細(xì)胞的性狀相似，該細(xì)胞在受到相關(guān)因子的刺激后可以在增殖、分化等階段增強(qiáng)或加速特征性軟骨基質(zhì)的表達(dá)，從而分化為不同階段的軟骨細(xì)胞[7]。常用于骨科系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究，如骨關(guān)節(jié)炎[8]、骨質(zhì)疏松癥[9]等。

目前，SIRT1基因相關(guān)的ATDC5細(xì)胞模型鮮有報(bào)道，本研究利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)建立了SIRT1基因干擾后的ATDC5細(xì)胞模型，從而為基礎(chǔ)及臨床利用該細(xì)胞研究骨科系統(tǒng)相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

ATDC5細(xì)胞（南京科佰生物科技有限公司提供），293T細(xì)胞（上海細(xì)胞所提供），GeneRuler 1 kb DNA Ladder（Thermo Scientific公司提供），Normal-RunTM 250 bp-II DNA Ladder（GeneRay公司提供），限制性核酸內(nèi)切酶（NEB公司提供），Taq Plus DNA聚合酶（Vazyme公司提供），T4 DNA連接酶（Thermo Scientific公司提供），引物（GeneRay、上海吉凱基因科技有限公提供），TOP10感受態(tài)細(xì)胞（Genechem公司提供），質(zhì)粒提取試劑盒（TIANGEN公司提供），臺盼蘭（Sigma公司提供），胎牛血清（上海微科生化試劑有限公司、Ausbian公司提供），DMSO（上海試一化學(xué)試劑有限公司提供），DMEM培養(yǎng)基（Hyclone、Corning公司提供），吉凱轉(zhuǎn)染試劑（上海吉凱基因科技有限公司提供），嘌呤霉素（Sigma、Clontech公司提供），HIV-1 p24 AntigenELISA 2.0試劑盒（北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供），胰酶（生工生物工程（上海）股份有限公司提供），D-Hanks（上海吉凱基因科技有限公司提供），Trizol試劑盒（上海普飛公司提供），M-MLV試劑盒（Promega公司提供），三磷酸堿基脫氧核苷酸（Promega公司提供），RNA酶抑制劑（Promega公司提供），T重復(fù)寡核苷酸（上海生工提供），Bulge-LoopTM miRNA qPCR Primer Set（廣州銳博提供），SYBR Master Mixture（TAKARA公司提供），GV248載體（上海吉凱基因科技有限公司提供）。

1.2 RNA i i慢病毒載體構(gòu)建

針對目的基因序列，根據(jù)RNAi序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)SIRT1基因的RNAi靶點(diǎn)序列，其序列為5'-CCAACACCTCTTCATATTT-3'，GC含量36.84%，采用GV248載體（框架結(jié)構(gòu)：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin），構(gòu)建病毒載體GV248-Sirt1-RNAi-a和GV248-Sirt1-RNAi-b，構(gòu)建框架見表1。引入酶切位點(diǎn)AgeⅠ、EcoRⅠ酶切載體，合成單鏈引物，引物退火形成雙鏈DNA，通過T4 DNA連接酶將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈DNA連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆的菌落進(jìn)行PCR鑒定，引物見表2。測序后進(jìn)行質(zhì)粒抽提，抽提合格的質(zhì)粒進(jìn)入下游流程。

1.3 RNA i i慢病毒包裝

轉(zhuǎn)染前24 h處理293T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度約5× 106個(gè)/15 ml，接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%用于轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前2 h更換為無血清培養(yǎng)基；離心管中加入所制備的各DNA溶液（GV載體質(zhì)粒20μg、pHelper 1.0載體質(zhì)粒15μg、pHelper 2.0載體質(zhì)粒10μg），與相應(yīng)體積的吉凱轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，調(diào)整總體積為1 ml，在室溫下溫育15 min；滴加至293T細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)6 h；棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基；10 ml PBS清洗；加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基20 ml，培養(yǎng)48～72 h；收集轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞上清液；4℃、4000 g離心10 min；0.45μm濾器過濾40 ml超速離心管中上清液；4℃、25000 rpm離心2 h；棄去上清，加入病毒保存液（可用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)基），重懸；10000 rpm離心5 min，取上清分裝。293T細(xì)胞鋪96孔板（4×104個(gè)/孔，100μl）；將梯度稀釋后的病毒顆粒加入；培養(yǎng)24 h，加入完全培養(yǎng)基；4 d后觀察熒光表達(dá)情況，計(jì)算病毒滴度。

1.4 細(xì)胞感染

將ATDC5細(xì)胞復(fù)蘇鋪6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右傳代培養(yǎng)；將細(xì)胞制成3×104～5×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液，鋪12孔板，每孔1 ml；待細(xì)胞達(dá)到20%左右密度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，分為空白組、陰性對照病毒感染組、攜帶SIRT1基因的慢病毒感染組。感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）為10，在感染增強(qiáng)液Eni.S和polybrene輔助下進(jìn)行感染，感染后16 h換液，感染后72 h進(jìn)行熒光拍照。收集細(xì)胞抽提RNA進(jìn)行RT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)。

表1 iRNAi構(gòu)建框架

表2 陽性克隆菌落PCR鑒定引物

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)檢測ATDC 5細(xì)胞中慢病毒轉(zhuǎn)染后SIRT 1基因mRNA的表達(dá)情況

SIRT1及GAPDH基因引物序列見表3?？俁NA提抽使用Trizol試劑盒，cDNA合成使用M-MLV試劑盒。按照各目的基因退火溫度選擇二步法完成擴(kuò)增，總共循環(huán)45次。根據(jù)熔解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，采用2-ΔΔCt法開展數(shù)據(jù)分析。

表3 SIRT 1及GAPDH基因引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組樣本之間進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 SIRT 1基因RNA i i慢病毒載體的制備及鑒定

SIRT1基因短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA,shRNA）核苷酸序列經(jīng)過退火形成雙鏈DNA，引入酶切位點(diǎn)AgeⅠ、EcoRⅠ酶切載體，通過T4 DNA連接酶將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈DNA連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆的菌落進(jìn)行PCR鑒定，電泳圖見圖1。連接入慢病毒短發(fā)夾狀RNA（vshRNA）片段的陽性克隆PCR片段大小為542 bp，沒有連接入vshRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為508 bp。測序結(jié)果表明合成的SIRT1 shRNA序列插入正確。

2.2 攜帶SIRT 1基因的慢病毒包裝及滴度鑒定

重組慢病毒質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，緩慢滴加至293T細(xì)胞中，正常培養(yǎng)24 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，觀察各孔中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，細(xì)胞生長狀態(tài)較好，無細(xì)菌及真菌生長，培養(yǎng)基澄清透明，證明病毒包裝成功（圖2）。病毒滴度=熒光細(xì)胞數(shù)/病毒原液量，可知該病毒的滴度為1E+9 TU/ml。

圖1 陽性克隆的PCR鑒定電泳圖

2.3 攜帶SIRT 1基因的慢病毒感染ATDC 5細(xì)胞

2.4 攜帶SIRT 1基因的慢病毒感染ATDC 5細(xì)胞后細(xì)胞中SIRT 1基因mRNA的表達(dá)情況

收集ATDC5細(xì)胞，抽提總RNA，通過RT-PCR反應(yīng)檢測ATDC5細(xì)胞中SIRT1基因mRNA的表達(dá)情況。分別感染3次，陰性對照病毒感染組SIRT1基因mRNA的表達(dá)情況為（1.002±0.083）、（1.000±0.015）、（1.001±0.040），攜帶SIRT1基因的慢病毒感染組SIRT1基因mRNA的表達(dá)情況為（0.255±0.012）、（0.482±0.025）、（0.420±0.009），3次感染均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01，圖4）。感染3次后，ATDC5細(xì)胞中SIRT1基因mRNA的相對表達(dá)量，陰性對照病毒感染組為（1.001±0.001），攜帶SIRT1基因的慢病毒感染組為（0.386±0.117），敲減效率為61.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此可知，該靶點(diǎn)是一個(gè)有效的靶點(diǎn)，SIRT1基因表達(dá)降低的ATDC5細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

將ATDC5細(xì)胞制成3×104～5×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液，鋪于12孔板中正常培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為20%時(shí)，用5E+8 TU/ml滴度的攜帶SIRT1基因的慢病毒及陰性對照病毒2.00 μl進(jìn)行感染，感染增強(qiáng)液Eni.S和polybrene輔助感染，MOI為10。感染后16 h換液，感染后72 h在倒置熒光顯微鏡下觀察各孔中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長狀態(tài)較好，未出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象，細(xì)胞感染效率高，無細(xì)菌及真菌生長，培養(yǎng)基澄清透明，可用于PCR鑒定（圖3）。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后圖片（200×）

3 討論

SIRT1基因是存在于哺乳動物中酵母染色質(zhì)Sir2的同源體，經(jīng)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸調(diào)控許多下游基因轉(zhuǎn)錄，主要通過催化蛋白質(zhì)賴氨酸s位去乙?；瞥摶鶊F(tuán)，以去乙?；姆绞皆诜g后水平中調(diào)節(jié)靶分子的活性和功能。從而影響到靶分子的表達(dá)，參與到機(jī)體功能及疾病發(fā)生發(fā)展的過程中，對于調(diào)控機(jī)體的物質(zhì)代謝[2]、DNA損傷修復(fù)[10]、衰老進(jìn)程[11]等作用較大。并可以通過AKT/PI3K[5]、NF-κB[6]、Wnt/β-catenin[12]等信號通路的作用調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的代謝，進(jìn)而參與到骨科疾病如骨關(guān)節(jié)炎[13]、骨質(zhì)疏松[14]等的發(fā)生發(fā)展中，在各種生理及病理過程中起到重要作用。本研究利用慢病毒轉(zhuǎn)染的技術(shù)對SIRT1基因的表達(dá)進(jìn)行干擾，從而降低細(xì)胞中SIRT1基因的表達(dá)，建立SIRT1基因表達(dá)降低的細(xì)胞模型。

ATDC5細(xì)胞的功能與軟骨細(xì)胞類似，為軟骨細(xì)胞的祖系，由于來源于胚胎瘤細(xì)胞，從而可以進(jìn)行多次傳代，避免了使用原代軟骨細(xì)胞進(jìn)行研究時(shí)傳代次數(shù)的限制以及慢病毒轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞成功率較低的不利影響。ATDC5細(xì)胞可以在胰島素等因子的誘導(dǎo)下模擬軟骨的形成過程[15]，為研究軟骨發(fā)育提供了良好的體外細(xì)胞模型[16]，并在軟骨相關(guān)的疾病中起到重要的作用。在本課題組研究中，軟骨缺損及修復(fù)是一個(gè)重要的領(lǐng)域，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，ATDC5細(xì)胞中SIRT1基因表達(dá)改變的細(xì)胞模型鮮有報(bào)道，而該模型在骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等疾病的研究中作用重大，建立ATDC5細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞模型十分必要，因此通過本研究建立SIRT1基因表達(dá)降低的ATDC5細(xì)胞模型。

RNAi技術(shù)是近些年來比較熱門的一種降低基因表達(dá)的技術(shù)[17]，該技術(shù)是一種在生物體細(xì)胞內(nèi)由雙鏈RNA引起同源mRNA的特異性降解，因而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過程，是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默[18]，在生物體內(nèi)普遍存在，同時(shí)是一種可以抵御外在感染的重要保護(hù)機(jī)制，常用于功能基因組學(xué)和細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路分析。慢病毒可以感染分裂期及非分裂期的細(xì)胞，宿主范圍廣泛，對于包括原代細(xì)胞在內(nèi)的難感染細(xì)胞的感染效率高，能將外源基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，使之在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在[19]，并且不對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性或激發(fā)免疫反應(yīng)，不容易發(fā)生突變，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的基因變化。慢病毒與腺病毒等其他病毒載體相比優(yōu)勢明顯[20]，被越來越多地應(yīng)用到相關(guān)的研究中[21]。小發(fā)卡狀RNA（shRNA）導(dǎo)入細(xì)胞后可以持久性的轉(zhuǎn)錄生成shRNA，從而發(fā)揮穩(wěn)定的抑制作用，比早期的小干擾RNA（siRNA）效果好[22]。本研究使用目前比較認(rèn)可的技術(shù)，采用慢病毒作為轉(zhuǎn)入載體，將shRNA導(dǎo)入細(xì)胞，因此，所獲得的結(jié)果可信度較高。

本研究中首先設(shè)計(jì)了1條針對小鼠SIRT1基因的RNAi特異性序列，并將其構(gòu)建成表達(dá)SIRT1的shRNA的慢病毒載體。陽性克隆PCR鑒定及測序結(jié)果表明合成的SIRT1 shRNA序列與設(shè)計(jì)的序列一致，插入正確。與此同時(shí)，所選擇的慢病毒載體能夠表達(dá)綠色熒光蛋白，導(dǎo)入細(xì)胞后在熒光顯微鏡下可以激發(fā)綠色熒光，從而便于觀察。當(dāng)干擾載體感染293T細(xì)胞后，通過熒光顯微鏡的觀察計(jì)算出該病毒的滴度為1E+9 TU/ml。將其感染ATDC5細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)ATDC5細(xì)胞生長狀態(tài)良好，無大量死亡現(xiàn)象，細(xì)胞感染效率高。行RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，攜帶SIRT1基因的慢病毒感染組與陰性對照病毒感染組相比，SIRT1基因mRNA的表達(dá)量明顯降低，敲減效率達(dá)到61.4%，建立RNAi慢病毒穩(wěn)定感染的SIRT1基因表達(dá)量降低的ATDC5細(xì)胞模型。

綜上，本研究通過慢病毒干擾技術(shù)，降低了ATDC5細(xì)胞中SIRT1基因的表達(dá)，成功建立SIRT1基因表達(dá)降低的ATDC5細(xì)胞模型，為基礎(chǔ)及臨床研究SIRT1基因相關(guān)的骨科系統(tǒng)相關(guān)疾病及其分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖4 3次感染后不同組別ATDC5細(xì)胞SIRT1基因mRNA表達(dá)

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Establishment of an ATDC5 cell model with lentivirus-mediated SIRT1 gene knockdown*

YU Fei,ZENG Hui**,WENG Jian,LIN Jianjing,XIE Xiaochen,SUN Junying,XIAO Deming
(Department of Orthopedics,Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518036,Guangdong,China)

Background:Silent information regulator 1(SIRT1)gene has a close relationship with aging.It can affect the aging process of tissue and organism through regulating PI3K/AKT,NF-κB signaling pathways and participate in the development of orthopedic diseases.An ATDC5 cell model with lentivirus-mediated SIRT1 gene knockdown can provide experimental basis for the study of SIRT1 gene related orthopedic diseases such as osteoarthritis and osteoporosis.Objec:tive:To construct a lentiviral vector for RNA interference(RNAi)of mouse SIRT1 gene which was transfected into ATDC5 cell line to establish an ATDC5 cell model with SIRT1 gene knockdown.Methods:According to the design principle of the RNAi target sequence,RNAi target sequence of SIRT1 gene was designed and synthesized.And then the sequence was connected with GV248(hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)vector.After PCR identification and clone sequencing,the plasmid was extracted and transfected into 293T cells.The lentiviruses were packed and the supernatant was collected to detect titer.The lentiviruses containing mouse SIRT1 gene RNAi sequence were transfected into ATDC5 cell line which was observed under fluorescence microscope.RT-PCR was used to detect the expression of SIRT1 mRNA in ATDC5 cells.Res ults: SIRT1 gene RNAi sequence was successfully connected with GV248 vector through PCR and sequence analysis and packaged into high titer lentivirus.After the lentivirus containing mouse SIRT1 gene RNAi sequence were transfected into ATDC5 cells,the high infection rate was found under fluorescence microscope.RT-PCR showed that the expression of SIRT1 mRNA was 0.386±0.117,which was significantly different from the negative control group(P＜0.05).The knockdown efficiency was 61.4%.Conclusions:An ATDC5 cell model with lentivirus-mediated SIRT1 gene knockdown has been successfully established.It can provide experimental basis for the study of SIRT1 gene related orthopedics diseases.

Genes;Cells;Models;Lentivirus

2095-9958（2017）04-0154-05

10.3969/j.issn.2095-9958.2017.02-15

深圳市科創(chuàng)委資助項(xiàng)目（JCYJ20150403091443275）；廣東省自然科學(xué)基金-博士啟動項(xiàng)目（2016A030310070）**

曾暉，E-mail：zenghui_36@163.com