石蠟包埋組織DNA快速提取法應(yīng)用于分子病理檢測(cè)價(jià)值評(píng)價(jià)

楊秀媚

【摘要】 目的 探討分析石蠟包埋組織DNA快速提取法應(yīng)用于分子病理檢測(cè)的價(jià)值。方法 63份經(jīng)石蠟包埋的組織， 隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（32份）和對(duì)照組（31份）。實(shí)驗(yàn)組采用DNA快速提取法， 對(duì)照組采用試劑盒DNA提取法。分別對(duì)兩組提取出的DNA進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組在小組織標(biāo)本中提取DNA的濃度及純度均低于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組在大組織標(biāo)本中提取DNA的濃度及純度與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。對(duì)照組中提取的DNA擴(kuò)增后可達(dá)到500 bp以上， 實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增產(chǎn)物則在400 bp以上。結(jié)論 分子病理檢測(cè)中應(yīng)用石蠟包埋組織DNA快速提取法， 可在保證質(zhì)量的情況下， 大大縮短檢測(cè)時(shí)間， 提高檢測(cè)安全性， 臨床上值得應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 分子病理檢測(cè)；石蠟包埋組織；DNA快速提取法；價(jià)值

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.24.118

近年來(lái)， 隨著分子病理學(xué)的不斷發(fā)展， 人們對(duì)腫瘤疾病的認(rèn)識(shí)與研究不再局限于患者的器官、細(xì)胞， 而是延伸到了蛋白質(zhì)、DNA等水平。分子病理學(xué)使病理診斷變得更加準(zhǔn)確、客觀， 而且在腫瘤的治療及預(yù)后等方面也有著重要價(jià)值， 其中免疫檢測(cè)、基因檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)目前應(yīng)用較為廣范， 全面推動(dòng)著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展[1]。提取DNA是分子病理檢測(cè)的重要內(nèi)容， 本研究通過(guò)對(duì)石蠟包埋組織進(jìn)行DNA提取、分析， 旨在評(píng)價(jià)石蠟包埋組織DNA快速提取法應(yīng)用于分子病理檢測(cè)中的價(jià)值， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取2016年3～12月經(jīng)石蠟包埋的組織63份， 將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（32份）和對(duì)照組（31份）。所有標(biāo)本均使用中性甲醛固定， 其中淋巴結(jié)、腫瘤、宮頸組織各21份。

1. 2 方法

1. 2. 1 實(shí)驗(yàn)組 采用DNA快速提取法， 對(duì)每例標(biāo)本制作4張蠟片， 首先將蠟片置入離心管中并加入裂解液， 采用金屬浴方法將石蠟溶解， 并將溫度控制在95℃， 持續(xù)時(shí)間在10 min左右， 然后以14000 r/min對(duì)其進(jìn)行離心操作， 離心過(guò)程持續(xù)5 min， 最后將蠟層下出現(xiàn)的清涼溶液置于-20℃環(huán)境下保存。

1. 2. 2 對(duì)照組 采用試劑盒DNA提取法， 與實(shí)驗(yàn)組相同方法制作4張蠟片， 將其置入離心管中并加入二甲苯1 ml， 14000 r/min對(duì)其進(jìn)行離心操作， 3 min后拋除上層清亮液體， 重復(fù)操作1次；1 ml無(wú)水乙醇加入離心管中， 混勻后重復(fù)上述離心操作， 并再次進(jìn)行乙醇去苯， 完成后開(kāi)蓋蒸發(fā)乙醇；將Buffer ALT及蛋白酶K混入離心管， 混勻后進(jìn)行消化、孵育；使用離心柱9000 r/min對(duì)其進(jìn)行離心， 2 min后將廢液丟棄；加500 μl緩沖液AW1， 9000 r/min對(duì)其進(jìn)行離心， 2 min后將廢液丟棄；加500 μl緩沖液AW2， 9000 r/min對(duì)其進(jìn)行離心， 2 min后將廢液丟棄；加入ATE靜置2 min， 再離心處理；處理完畢后管內(nèi)剩余液體置于-20℃環(huán)境下保存[2]。

1. 3 DNA產(chǎn)物評(píng)價(jià)

1. 3. 1 DNA濃度及純度 利用紫外分光光度計(jì)評(píng)價(jià)提取物DNA濃度及其純度。

1. 3. 2 PCR可行性 對(duì)提取出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（實(shí)驗(yàn)組使用DNA原液， 對(duì)照組DNA濃度65 ng/μl）；反應(yīng)溫度：預(yù)變性95℃， 變性95℃， 退火60℃；反應(yīng)時(shí)間：預(yù)變性7 min， 變性45 s， 退火45 s；經(jīng)循環(huán)35次后對(duì)其進(jìn)行電泳處理， 并經(jīng)BIO-RAD系統(tǒng)對(duì)兩組DNA質(zhì)量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2. 1 提取物DNA濃度及純度評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)組在小組織標(biāo)本中提取DNA的濃度及純度均低于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組在大組織標(biāo)本中提取DNA的濃度及純度與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。

2. 2 PCR可行性對(duì)比分析 對(duì)照組中提取的DNA擴(kuò)增后可達(dá)到500 bP以上，實(shí)驗(yàn)組中不同組織提取的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小不同，其中宮頸組織可達(dá)300 bp，其余組織則在400 bp以上。見(jiàn)圖1。

3 討論

隨著科學(xué)技術(shù)的持續(xù)發(fā)展及醫(yī)療水平的不斷進(jìn)步， 石蠟包埋組織因其具有便于運(yùn)輸儲(chǔ)存、交叉污染少等優(yōu)點(diǎn)， 被廣泛應(yīng)用于臨床病理工作中[3-6]。在進(jìn)行分子病理檢測(cè)時(shí)提取DNA的方法中， 酚-氯仿法應(yīng)用較早， 但因其操作過(guò)程復(fù)雜， 且對(duì)人體有損害等缺點(diǎn)， 目前已逐漸被離心柱法所代替[3]。離心柱法對(duì)操作者要求相對(duì)較低， 且得到的DNA質(zhì)量較高， 但檢測(cè)過(guò)程中因?yàn)樾枰獙?duì)組織進(jìn)行消化， 操作步驟較多， 所以檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)， 且在操作過(guò)程中換管頻繁， 增加了標(biāo)本污染的可能性[4]。如何能夠在保證DNA提取質(zhì)量的情況下縮短操作時(shí)間， 成為了研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。

石蠟包埋組織DNA快速提取法無(wú)需應(yīng)用有毒試劑， 如二甲苯、氯仿等， 能夠更好地保障檢測(cè)人員的身體健康及生命安全[7-11]；采用離心管， 不但較通常所應(yīng)用的PCR管方便許多， 而且可有效降低交叉污染的可能性， 從而提高DNA提取質(zhì)量；將加熱溫度設(shè)置為95℃， 可有效避免過(guò)高的溫度所造成的試管爆炸， 大大提高操作安全性[12-14]。石蠟包埋組織在處理過(guò)程當(dāng)中， 會(huì)經(jīng)過(guò)甲醛固定以及脫水等步驟， 在進(jìn)行分子病理檢測(cè)之前已放置了一定的時(shí)間， 所以DNA斷裂情況較為常見(jiàn)。有研究結(jié)果表明， DNA快速提取法所得到的DNA完全可用于PCR擴(kuò)增[5]。為進(jìn)一步探討分析石蠟包埋組織DNA快速提取法應(yīng)用于分子病理檢測(cè)價(jià)值， 本實(shí)驗(yàn)對(duì)石蠟包埋組織進(jìn)行了分組實(shí)驗(yàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示， 實(shí)驗(yàn)組在小組織標(biāo)本中提取DNA的濃度及純度均低于對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組在大組織標(biāo)本中提取DNA的濃度及純度與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。對(duì)照組中提取的DNA擴(kuò)增后可達(dá)到500 bp以上， 實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增產(chǎn)物則在400 bp以上。endprint

綜上所述， 使用石蠟包埋組織DNA快速提取法所提取的DNA， 雖然在小組織中DNA濃度及純度相對(duì)較低， 但完全可滿(mǎn)足分子病理檢測(cè)所需的條件， 而且該方法擁有方便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)， 具有顯著的優(yōu)勢(shì)， 可在臨床上推薦與應(yīng)用。

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[收稿日期：2017-06-02]endprint