氧化亞氮-氧氣混合吸入口腔鎮(zhèn)靜效果及對老年口腔細胞DNA損傷和糖酵解的影響

張燕升 韓 博 胡曉敏 謝培培 王嘉欣

(北京市崇文口腔醫(yī)院綜合治療科，北京 100062)

氧化亞氮-氧氣混合吸入口腔鎮(zhèn)靜效果及對老年口腔細胞DNA損傷和糖酵解的影響

張燕升 韓 博 胡曉敏 謝培培 王嘉欣

(北京市崇文口腔醫(yī)院綜合治療科，北京 100062)

目的探討氧化亞氮-氧氣混合吸入對老年口腔鎮(zhèn)靜效果及其對口腔黏膜上皮細胞DNA損傷和糖酵解影響。方法擬行口腔頜面診治的老年患者792例，隨機分為氧化亞氮組392例和單純局麻組400例。術前和術中記錄患者心率和血氧飽和度；使用視覺模擬疼痛評分(VAS)和Ramsay法評估患者的疼痛和鎮(zhèn)靜情況。術中取牙齦黏膜，體外常規(guī)培養(yǎng)口腔黏膜上皮細胞，Western印跡法和細胞免疫熒光檢測氧化亞氮-氧氣處理不同時間細胞中γH2AX蛋白表達情況；RT-PCR檢測細胞糖酵解酶基因(GLUT1、GLUT3、HK2、PK-M2)表達情況。結果單純局麻組心率動幅較大，112例心率波動超出正常范圍；氧化亞氮組術前和術中心率均在正常范圍內；術中氧化亞氮組血氧飽和度高于術前和單純局麻組(P<0.05)。氧化亞氮組術中VAS低于單純局麻組，鎮(zhèn)靜評分高于單純局麻組(P<0.05)。氧化亞氮-氧氣處理口腔黏膜上皮細胞0.5 h后γH2AX蛋白表達明顯上調，1 h達到高峰，之后逐漸降低；細胞免疫熒光檢測γH2AX蛋白表達情況顯示，處理2 h時熒光強度高于處理前，說明氧化亞氮-氧氣誘導γH2AX表達上調，誘導細胞DNA損傷?？谇火つど掀ぜ毎墙徒饣蚪浹趸瘉喌?氧氣處理后表達均上調，其中GLUT1和GLUT3基因明顯上調，2 h后達到高峰，之后下降。結論氧化亞氮-氧氣混合吸入配合局麻對老年口腔頜面手術患者具有較好的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛效果；但氧化亞氮會誘導口腔黏膜上皮細胞DNA損傷，促進糖酵解，易引發(fā)術后口腔疾病，應加以預防。

氧化亞氮-氧氣；鎮(zhèn)靜；口腔黏膜上皮細胞；DNA損傷；糖酵解

疼痛是口腔頜面疾病治療中的常見問題，因口腔淺表腫物切除、復雜牙等手術時間長，損傷較大，單純局麻難以獲得理想效果〔1〕。近年來，氧化亞氮-氧氣混合吸入配合局麻進行上述復雜手術逐漸在臨床推廣。氧化亞氮是一種對呼吸道刺激小，不損傷心、肺等重要器官且不與血紅蛋白結合的安全麻醉劑。但有研究顯示，氧化亞氮會影響細胞的正常生理功能，引發(fā)口腔疾病〔2〕。細胞DNA損傷早期，損傷部位組蛋白H2AX迅速磷酸化，形成γH2AX蛋白，修復DNA，而在此過程中需通過糖酵解提供能量〔3〕。本研究旨在探討氧化亞氮-氧氣混合吸入配合局麻鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛的效果及對細胞DNA損傷和糖酵解的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1～12月在北京市崇文口腔醫(yī)院口腔頜面外科就診的老年患者792例，入選標準：美國麻醉師協會(ASA)分級Ⅰ～Ⅱ級，知情同意。隨機分為氧化亞氮組392例和單純局麻組400例。氧化亞氮組中男185例，女207例，年齡60～75〔平均(65.96±5.31)〕歲。單純局麻組男190例，女210例，年齡60～78〔平均(66.31±7.06)〕歲。兩組患者性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1麻醉和評分 一氧化亞氮組將雙層鼻罩置于氧化亞氮組鼻部，氧氣初始流量6～8 L/min，氧化亞氮初始流量1 L/min，根據患者感覺每次可增加0.5～1 L/min，同時減少氧氣流量，保持總通氣量不變，觀察患者意識模糊時為起效，之后使用2%利多卡因局麻后開始手術。單純局麻組直接使用2%利多卡因局部浸潤麻醉后進行手術。術中分別使用視覺模擬疼痛評分(VAS)和Ramsay法評估患者的疼痛和鎮(zhèn)靜情況。分別與術前和術中監(jiān)測并記錄患者心率和血氧飽和度。

1.2.2口腔黏膜上皮細胞培養(yǎng) 術中取牙齦黏膜，將組織塊洗凈后除去皮下結締組織，剪成邊長為1 mm的小塊，接種到25 mm培養(yǎng)瓶中，加1 ml MCDB153無血清培養(yǎng)基，放入二氧化碳(CO2)細胞培養(yǎng)箱中孵育，上皮細胞布滿培養(yǎng)皿底部時傳代。吸出培養(yǎng)液，胰蛋白酶消化成單細胞懸液，按1×105/ml的密度接種到含10%胎牛血清(BSA)的DMEM培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)。

1.2.3Western印跡檢測 取對數生長期的口腔黏膜上皮細胞消化，按1×106/ml密度接種到培養(yǎng)瓶，孵育過夜。氧化亞氮-氧氣(1∶1)混合氣體處理細胞，分別培養(yǎng)0、0.5、1、2、4 h，RIPA裂解液提蛋白，定量、變性后上樣，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳，濕法轉膜，室溫下5%BSA封閉液中處理1 h，滴加一抗γH2AX(1∶500)和內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，孵育12 h，加二抗，室溫孵育2 h，分析灰度值。

1.2.4細胞免疫熒光 按1×104/ml密度接種到12孔板中，設置3個復孔，常規(guī)孵育24 h。氧化亞氮-氧氣(1∶1)混合氣體處理細胞，培養(yǎng)2 h后棄去培養(yǎng)液，室溫下4%多聚甲醛固定40 min，0.3%Triton+5%BSA破膜并封閉1 h，滴加一抗γH2AX(1∶500)孵育過夜，滴加異肽酸己二烯(DAPI)工作液染核，室溫20 min，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5RT-PCR檢測 口腔黏膜上皮細胞按1×106/ml密度接種到6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)過夜，氧化亞氮-氧氣(1∶1)混合氣體處理細胞，分別培養(yǎng)0、0.5、1、2、3 h，Trizol提取細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA。反應體系20 μl(cDNA 2 μl、上游和下游引物各1 μl、SYBR Green熒光染料 10 μl、雙蒸水6 μl)，常規(guī)條件下反應40個循環(huán)。引物為糖酵解相關酶基因，包括GLUT1、GLUT3、HK2、PK-M2，由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組心率和血氧飽和度變化情況 單純局麻組心率動幅較大，112例心率波動超出正常范圍；氧化亞氮組術前和術中心率均在正常范圍內。氧化亞氮組、單純局麻組術前心率分別為(83.95±13.28)次/min、(84.86±13.21)次/min；術中分別為(75.92±11.05)次/min、(85.76±14.18)次/min。術中氧化亞氮組心率低于術前和單純局麻組(P<0.05)。氧化亞氮組、單純局麻組術前血氧飽和度分別為(99.18±2.73)ml/dl、(98.12±1.90)ml/dl；術中分別為(100.68±1.63)ml/dl、(99.49±1.85)ml/dl。術中氧化亞氮組高于術前和單純局麻組(P<0.05)。

2.2兩組疼痛和鎮(zhèn)靜評分情況 單純局麻組術中VAS 1～5分，平均(3.72±0.83)分；氧化亞氮組術中VAS 0～2分，平均(1.65±0.42)分；兩組VAS差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。單純局麻組術中鎮(zhèn)靜評分(1.16±0.33)分，氧化亞氮組(2.92±0.54)分；兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3氧化亞氮-氧氣誘導口腔黏膜上皮細胞DNA損傷 處理0.5 h后γH2AX蛋白表達明顯上調，1 h達到高峰，之后逐漸降低。見圖1。細胞免疫熒光檢測γH2AX蛋白表達情況顯示，處理2 h時熒光強度高于處理前，說明氧化亞氮-氧氣誘導γH2AX表達上調，誘導口腔黏膜上皮細胞DNA損傷。見圖2。

2.4氧化亞氮-氧氣上調口腔黏膜上皮細胞糖酵解相關酶mRNA表達 口腔黏膜上皮細胞糖酵解酶基因經氧化亞氮-氧氣處理后表達均上調，其中GLUT1和GLUT3基因明顯上調，2 h后達到高峰，之后下降。見表1。

表1 各時間點口腔黏膜上皮細胞糖酵解酶基因mRNA表達情況

3 討 論

氧化亞氮-氧氣混合氣體吸入為個性化陣痛鎮(zhèn)靜方案，有效提升口腔治療的舒適性，目前臨床中已逐漸推廣應用〔4〕。本研究結果也證實該鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜方案較單純局麻更適用于接受口腔頜面手術的老年患者，對患者心率和血氧飽和度影響小，鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛效果明顯。在細胞DNA損傷早期，損傷部位組蛋白H2AX迅速磷酸化，形成γH2AX蛋白，修復DNA。本研究說明早期細胞出現DNA損傷，隨著γH2AX蛋白表達水平上述，DNA損傷逐漸被修復，但難以恢復正常水平。同時DNA修復過程需消化能量，口腔上皮細胞需通過增加糖酵解來實現〔5〕。本研究也進一步證實了γH2AX蛋白DNA損傷修復過程，通過干預手段提升糖糖酵解作用有助于患者口腔黏膜上皮細胞DNA損傷的修復。因此，臨床給予老年口腔患者氧化亞氮-氧氣混合氣體鎮(zhèn)靜疼痛過程中應盡量避免氣體進入口腔，并在術后給予促進糖酵解的藥物來提升口腔黏膜上皮細胞DNA損傷的修復程度，預防術后口腔疾病的發(fā)生。

1張文文，葉保國，韓春瑩，等.兩種控制通氣模式對老年患者喉罩麻醉下行腹腔鏡手術時呼吸功能的影響〔J〕.中國老年學雜志，2012；32(2)：387-8.

2Stieglmeier M，Mooshammer M，Kitzler B,etal.Aerobic nitrous oxide production through N-nitrosating hybrid formation in ammonia-oxidizing archaea〔J〕.ISME J，2014；8(5)：1135-46.

3付建平，袁蘭所，牟麗娜，等.依折麥布對高遷移率族蛋白1誘導血管內皮細胞激活的影響機制研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2017；18(1)：46-9.

4高友光，林財珠，林獻忠，等.氧化亞氮復合七氟醚長時間吸入對腫瘤患者術后骨髓功能的影響〔J〕.臨床麻醉學雜志，2011；27(9)：841-3.

5孫黎生.戊乙奎醚對老年口腔手術患者呼吸及循環(huán)系統(tǒng)的影響〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(17)：3382-3.

〔2017-06-23修回〕

(編輯 袁左鳴)

張燕升(1975-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事口腔科研究。

R78

A

1005-9202(2017)17-4337-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.081