暖季型草坪草狗牙根對酸鋁脅迫的生理響應(yīng)

黃春瓊， 陳 振， 劉國道， 白昌軍

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海南 儋州 571737)

土壤酸化影響著全球30%～40%可耕地的作物生產(chǎn)，全世界約有40%的可耕地屬酸性土壤。在中國，酸性土壤的分布遍及14個(gè)省區(qū)，總面積達(dá)203萬hm2，約占全國耕地面積的21%，主要集中在南方地區(qū)[1]。鋁毒害被認(rèn)為是酸性土壤中限制植物生長發(fā)育的主要因素[2]。鋁在土壤溶液中的形態(tài)隨pH值的變化而有所不同：一般來說，當(dāng)土壤pH值高于5.5時(shí)，鋁被磷酸等化合物結(jié)合或被土壤膠體吸附，水溶性鋁很少；而當(dāng)土壤pH低于5.5時(shí)，原來在土壤中以難溶性的硅酸鹽或氧化鋁形式存在的鋁逐漸解離，將不同形態(tài)的鋁離子釋放到土壤溶液中，直接危害植物生長和發(fā)育，降低酸性土壤中的農(nóng)作物產(chǎn)量。隨著工業(yè)化的發(fā)展，酸雨沉降頻繁，酸性肥料投入增多，加劇了土壤的酸化，使得鋁對植物的毒害日益嚴(yán)重[3]。在世界很多地區(qū)，尤其是中國華南熱帶地區(qū)，土壤酸化是草坪建植養(yǎng)護(hù)及牧草生產(chǎn)過程中的一個(gè)重要問題。

已有很多研究報(bào)道了植物的耐鋁機(jī)理，關(guān)于草類植物的耐鋁機(jī)制報(bào)道較少。Rengel[4]發(fā)現(xiàn)一年生黑麥草(Loliummultiforum)不同基因型對鋁的敏感性與根系陽離子交換量呈顯著負(fù)相關(guān)，低陽離子交換量的基因型能選擇排斥 Al3+，減少 Al 在根系交換位點(diǎn)上的結(jié)合，特別是細(xì)胞壁的果膠上，從而減輕鋁對根系的傷害。Wenzl等[5-6]對臂形草(Brachiariaeruciformis)的耐鋁機(jī)理進(jìn)行了研究。他們認(rèn)為臂形草的耐鋁性主要和其在酸性土壤里獲得營養(yǎng)元素(N、P、Ca)的能力有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)臂形草的根尖受到鋁脅迫時(shí)內(nèi)部積累有機(jī)酸而不是分泌有機(jī)酸。植物遭受某種環(huán)境的脅迫時(shí)體內(nèi)自由基會增多，當(dāng)自由基的濃度超過了一定的閥值，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸、多糖和膜脂分子的氧化破壞，從而破壞細(xì)胞內(nèi)的代謝活動。在作物抗性機(jī)理研究中，過氧化物酶(Peroxidase，POD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)等酶活性的變化己廣泛作為指示植物抵御逆境傷害的指標(biāo)。鋁脅迫能誘導(dǎo)多種植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧相關(guān)酶類活性的表達(dá)，使細(xì)胞膜脂、核酸和蛋白質(zhì)等生物分子過氧化而受損害，從而破壞細(xì)胞內(nèi)的代謝活動。如大麥(Hordeumvulgare)[7-8]、大豆(Glycinemax)[9]和水稻(Oryzasativa)[10]等都有相關(guān)報(bào)道?？寡趸割?Ascorbic acid peroxidase，APX)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等的表達(dá)提高能緩解鋁對植物的毒害[11-12]，且不同植物在遭受鋁脅迫時(shí)相應(yīng)的活性氧清除系統(tǒng)不盡相同[13-14]。因此，鋁誘導(dǎo)的氧化脅迫及相關(guān)抗氧化酶活性的變化是鋁毒的一個(gè)重要特征。

狗牙根(Cynodondactylon)是禾本科狗牙根屬的多年生植物，主要生長于溫暖濕潤的熱帶及亞熱帶地區(qū)。廣泛分布在我國長江流域以南的地區(qū)，該草種耐干旱、耐踐踏、繁殖能力及再生能力強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于公路護(hù)坡、庭院綠化、足球場、高爾夫球場等各種草坪用草，并成為世界三大暖季型坪草中最重要的草種之一[15-16]。本研究以前期研究篩選出的5份耐鋁狗牙根種質(zhì)和5份鋁敏感狗牙根種質(zhì)為材料，研究其在酸性土壤上的生理響應(yīng)情況，對培育狗牙根耐酸鋁品種具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

前期利用水培法對65份狗牙根進(jìn)行鋁脅迫處理，通過測定地上部及根系干重對其耐鋁性進(jìn)行綜合評價(jià)，從中篩選出5份耐鋁種質(zhì)和5份鋁敏感種質(zhì)。本研究以這5份耐鋁種質(zhì)和5份鋁敏感種質(zhì)為研究材料，其來源及耐鋁評價(jià)結(jié)果如表1所示。

表1 供試狗牙根材料來源及前期耐鋁評價(jià)結(jié)果Table 1 The collection site and the results of culture solution evaluation from the previous expriment of Cynodon dactylon

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1處理方法 試驗(yàn)土壤為花崗巖發(fā)育的磚紅壤土，試驗(yàn)前土壤養(yǎng)分含量為：pH 4.6，有機(jī)質(zhì)1.73%，全氮0.48 g·kg-1，全磷0.13 g·kg-1，全鉀1.22 g·kg-1，堿解氮83.83 mg·kg-1，速效磷19.12 mg·kg-1，速效鉀51.23 mg·kg-1，交換性鋁12.3 cmol·kg-1。將風(fēng)干土壤裝入直徑14 cm、高16 cm的塑料花盆中，每盆3.5 Kg土壤。對照用石灰調(diào)土壤pH值為5.8，石灰用量為3.8 g·kg-1，取帶有一個(gè)芽的大小一致的匍匐莖段插入花盆中，每盆20個(gè)，每份種質(zhì)對照(施石灰調(diào)pH值為5.8)和處理(不施石灰)各種3盆，一周后根據(jù)生長情況，每盆留苗10株，再過28 d 后結(jié)束試驗(yàn)，試驗(yàn)期間視天氣情況用蒸餾水等量澆灌。

1.2.2測定項(xiàng)目 生長28天后，從狗牙根頂端向下取第2、3片完全展開葉進(jìn)行生理指標(biāo)測定。測定項(xiàng)目包括葉綠素、電導(dǎo)率、丙二醛、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、游離脯氨酸和可溶性總糖含量。葉綠素測定采用丙酮乙醇混合液法；電導(dǎo)率采用電導(dǎo)法[17]；丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸比色法；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法[18]，酶活性以每分鐘內(nèi)每克鮮重材料的吸光度值變化△A470表示；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用NBT法[19]，SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活力單位；游離脯氨酸(Pro)含量的測定采用磺基水楊酸法[17]，于分光光度計(jì)520 nm波長處測定吸光度值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出脯氨酸濃度；可溶性總糖含量采用強(qiáng)酸可使糖類脫水生成糖醛，其與蒽酮脫水縮合形成糖醛衍生物，呈現(xiàn)藍(lán)綠色，在620 nm處有最大吸收，在10～100 μg范圍內(nèi)其顏色深淺與可溶性總糖含量成正比這一原理來測定。

1.2.3綜合評價(jià) 綜合評價(jià)采用隸屬函數(shù)法進(jìn)行評價(jià)。Fi=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)，式中，F(xiàn)i為第i個(gè)材料該性狀的隸屬函數(shù)值。Xij為第i個(gè)材料第j個(gè)性狀的平均值，Xmax和Xmin分別為該性狀的最大值和最小值。如果某一指標(biāo)與綜合質(zhì)量成負(fù)相關(guān)，則利用反隸屬函數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，計(jì)算公式為：Fi=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)，最后按材料將各性狀的隸屬函數(shù)值進(jìn)行平均，得各材料的平均隸屬函數(shù)值。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft office Excel 2007計(jì)算葉綠素、電導(dǎo)率、丙二醛、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、游離脯氨酸和可溶性總糖含量并生成柱狀圖，用SAS9.0軟件對各指標(biāo)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸鋁脅迫對狗牙根葉綠素含量的影響

如圖1所示，對同一處理不同種質(zhì)進(jìn)行方差分析，在酸鋁脅迫處理下，對照間(F=13.43，Pr>F<0.0001)和處理間(F=8.57，Pr>F<0.0001)不同種質(zhì)差異均達(dá)到極顯著。與對照相比，狗牙根耐鋁種質(zhì)和鋁敏感種質(zhì)的葉綠素含量都有不同程度的降低，其中鋁敏感種質(zhì)A538和A172降低稍為明顯，分別降低了29.69%和22.86%；耐鋁種質(zhì)A22和A84分別降低了9.58%和11.83%。

圖1 酸鋁脅迫對狗牙根葉綠素含量的影響Fig.1 The effect of acidity and aluminum stress on the total chlorophyll content of Cynodon dactylon accessions

2.2 酸鋁脅迫對狗牙根相對電導(dǎo)率的影響

如圖2所示，對同一處理不同種質(zhì)間進(jìn)行方差分析，在酸鋁脅迫處理下，對照間(F=0.11，Pr>F=0.9992)和處理間(F=0.25，Pr>F=0.9817)不同種質(zhì)差異均不顯著。但與對照相比，狗牙根耐鋁及鋁敏感種質(zhì)的電導(dǎo)率都有不同程度的增加。鋁敏感種質(zhì)相對電導(dǎo)率增加的幅度略高于耐鋁種質(zhì)，其中鋁敏感種質(zhì)A172，A137和A256分別增加了10.51%，16.93%和17.72%；耐鋁種質(zhì)A556，A551和A84分別增加了2.85%，6.81%和3.81%。

圖2 酸鋁脅迫對狗牙根相對電導(dǎo)率的影響Fig.2 The effect of acidity and aluminum stress on the relative electrical conductivity of Cynodon dactylon accessions

2.3 酸鋁脅迫對狗牙根丙二醛含量的影響

如圖3所示，對同一處理不同種質(zhì)間進(jìn)行方差分析，在酸鋁脅迫處理?xiàng)l件下，對照間(F=1.22，Pr>F=0.3370)和處理間(F=1.91，Pr>F=0.1103)不同種質(zhì)差異均不顯著。但與對照相比，不同狗牙根種質(zhì)的丙二醛含量均有不同程度增加，鋁敏感種質(zhì)增加較為明顯，其中A172，A137，A256和A326分別增加了45.20%，56.62%，53.47%和52.30%；耐鋁種質(zhì)A551，A22和A84分別增加了15.38%，22.13%和1.77%。

圖3 酸鋁脅迫對狗牙根丙二醛含量的影響Fig.3 The effect of acidity and aluminum stress on the MDA content of Cynodon dactylon accessions

2.4 酸鋁脅迫對狗牙根游離脯氨酸含量的影響

如圖4所示，對同一處理不同種質(zhì)間進(jìn)行方差分析，在酸鋁脅迫處理下，對照間(F=1.13，Pr>F=0.3855)和處理間(F=0.64，Pr>F=0.7474)不同種質(zhì)差異均不顯著。但與對照相比，耐鋁種質(zhì)和鋁敏感種質(zhì)的游離脯氨酸含量均發(fā)生不同程度的增加，兩種類型狗牙根種質(zhì)增加幅度都比較輕微，耐鋁種質(zhì)A556，A22和A84分別增加了1.22%，4.43%和1.80%；鋁敏感種質(zhì)A538，A137和A326分別增加了0.08%，0.69%和0.63%。

圖4 酸鋁脅迫對狗牙根游離脯氨酸含量的影響Fig.4 The effect of acidity and aluminum stress on the proline content of Cynodon dactylon accessions

2.5 酸鋁脅迫對狗牙根過氧化物酶活性的影響

如圖5所示，對同一處理不同種質(zhì)間進(jìn)行方差分析，在酸鋁脅迫處理下，對照間(F=6.76，Pr>F=0.0002)差異極顯著，處理間(F=2.49，Pr>F<0.0432)差異顯著。與對照相比，酸鋁脅迫下不同狗牙根種質(zhì)的POD含量均上升，但耐鋁種質(zhì)增加的幅度略高于鋁敏感種質(zhì)，其中耐鋁種質(zhì)A75，A22和A84分別增加了31.47%，22.44%和31.95%，鋁敏感種質(zhì) A538，A256和A326分別增加了21.24%，16.17%和0.51%。

圖5 酸鋁脅迫對狗牙根過氧化物酶(POD) 活性的影響Fig.5 The effect of acidity and aluminum stress on the POD activity of Cynodon dactylon accessions

2.6 酸鋁脅迫對狗牙根超氧化物歧化酶活性的影響

如圖6所示，對同一處理不同種質(zhì)間進(jìn)行方差分析，在酸鋁脅迫處理下，對照間(F=6.06，Pr>F=0.0004)和處理間(F=7.85，Pr>F<0.0001)差異均呈極顯著。與對照相比，不同狗牙根種質(zhì)在鋁脅迫處理下超氧化物歧化酶活性都有所增加，但耐鋁種質(zhì)增加較為明顯，其中A75，A556，A551和A22分別增加了35.75%，31.32%，39.65%和31.43%；鋁敏感種質(zhì)增加幅度相對較小，其中A172，A137和A256分別增加了4.12%，5.57%和22.84%。

圖6 酸鋁脅迫對狗牙根超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響Fig.6 The effect of acidity and aluminum stress on the SOD activity of Cynodon dactylon accessions

2.7 酸鋁脅迫對不同狗牙根可溶性總糖含量的影響

由圖7可知，在酸鋁脅迫處理下，對照間(F=28.76，Pr>F==0.0001)差異極顯著，處理間(F=3.11，Pr>F=0.0165)差異顯著。與對照相比，狗牙根耐鋁及鋁敏感種質(zhì)的可溶性總糖含量都有所降低，但鋁敏感種質(zhì)降低較為明顯，其中鋁敏感種質(zhì)A538，A172和A256分別降低了27.41%，15.56%，24.71%；耐鋁種質(zhì)A556，A22和A84分別降低了18.91%，14.29%和8.71%。

圖7 酸鋁脅迫對不同狗牙根可溶性總糖含量的影響Fig.7 The effect of acidity and aluminum stress on the soluble sugar content of Cynodon dactylon accessions

2.8 各指標(biāo)綜合評價(jià)

植物的耐鋁性是一個(gè)復(fù)合性狀，難以用單一指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。隸屬函數(shù)分析法提供了一條在多指標(biāo)測定基礎(chǔ)上對材料特性進(jìn)行綜合評價(jià)的途徑，可以克服僅少數(shù)指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)的不足，使結(jié)果更客觀、準(zhǔn)確。因此，選取狗牙根的葉綠素、電導(dǎo)率、丙二醛、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、游離脯氨酸和可溶性總糖作為分析指標(biāo)，計(jì)算出各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，進(jìn)行綜合評價(jià)，其中只有電導(dǎo)率和丙二醛為反隸屬函數(shù)，其他均為正隸屬函數(shù)。隸屬函數(shù)均值越大，說明其綜合評價(jià)越高。綜合評價(jià)結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明：A75的平均隸屬函數(shù)值(0.7483)最大，表明其耐鋁性最強(qiáng)，其次為A22、A556，耐鋁性較強(qiáng)。耐鋁性最差的是A326。

表2 鋁脅迫下10份狗牙根種質(zhì)各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值Table 2 The average of membership function of 10 Cynodon dactylon accessions on aluminum soil stress

3 討論與結(jié)論

正常情況下，植株可以通過多條途徑不斷產(chǎn)生超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫等活性氧類(reactive oxygen species，ROS)物質(zhì)，這些ROS物質(zhì)的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，而逆境脅迫會打破植物體內(nèi)的動態(tài)平衡，過量積累活性氧物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過氧化反應(yīng)，影響植株的正常發(fā)育[20]。

大量研究表明鋁在引起氧化脅迫的同時(shí)也可以刺激ROS有關(guān)的酶活性提高，肖祥希等[24]研究發(fā)現(xiàn)鋁脅迫使龍眼(Euphorialongan)葉片中SOD、POD、CAT等活性升高；楊野等[25]也發(fā)現(xiàn)鋁脅迫提高了不同種類小麥(Triticumaestivuml)活性氧代謝活性；武孔煥等[26]研究發(fā)現(xiàn)，與酸敏感型的黑大豆(Glycinemax)相比，耐酸型黑大豆在鋁脅迫條件下具有較強(qiáng)的保護(hù)酶活性，其膜脂受氧化作用損傷的程度較低，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鋁脅迫能力。本研究結(jié)果顯示，鋁脅迫28 d 后狗牙根耐鋁種質(zhì)與鋁敏感種質(zhì)體內(nèi)的MDA含量上升了，表明鋁毒引起狗牙根體內(nèi)產(chǎn)生氧化脅迫，誘使體內(nèi)活性氧水平上升，膜脂發(fā)生過氧化，但耐鋁種質(zhì)受到的影響明顯小于鋁敏感種質(zhì)，同時(shí)狗牙根耐鋁種質(zhì)SOD、POD活性的上升幅度略高于鋁敏感種質(zhì)，SOD、POD是植物體內(nèi)清除活性氧的主要保護(hù)酶，在抵抗脅迫中承擔(dān)重要作用。由此可以說明在鋁脅迫下，狗牙根耐鋁性種質(zhì)體內(nèi)的某些基因的表達(dá)，促使其抗氧化物酶活性升高，清除較多的活性氧，使其免受氧化脅迫或者降低受害程度。