柳枝稷體外誘導(dǎo)花器官逆轉(zhuǎn)與非逆轉(zhuǎn)穗芽生理特性差異研究

王勇鋒， 李 毛， 崔桂賓， 徐開(kāi)杰， 孫風(fēng)麗， 張 超， 劉曙東， 奚亞軍*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所， 河南 安陽(yáng) 455000)

開(kāi)花是一個(gè)復(fù)雜的生命進(jìn)程，其發(fā)生受到光周期、溫度、春化作用、植物激素等多因素的影響[1-5]。正常情況下，植物個(gè)體成熟以后即可進(jìn)行開(kāi)花、授粉、結(jié)實(shí)等一系列的生命過(guò)程，然而某些植物在進(jìn)入成熟期后遇到不利于開(kāi)花的外界環(huán)境，如持續(xù)降雨[6]、氣溫驟變[7]、人為改變光周期[8]等，部分已分化并發(fā)育的花器官組織將停止發(fā)育或逆向發(fā)育，最終再次形成營(yíng)養(yǎng)器官或類似營(yíng)養(yǎng)器官的組織，這種現(xiàn)象被稱為花器官逆轉(zhuǎn)?；ㄆ鞴倌孓D(zhuǎn)根據(jù)逆轉(zhuǎn)來(lái)源不同又被分為花逆轉(zhuǎn)(花的部分結(jié)構(gòu)發(fā)生逆轉(zhuǎn))和花序逆轉(zhuǎn)(花序上的小花發(fā)生逆轉(zhuǎn))[7,9]?；ㄆ鞴倌孓D(zhuǎn)現(xiàn)象最早在鳳仙花(Impatiensbalsamina)中有詳細(xì)報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)將開(kāi)花期的鳳仙花從短日照環(huán)境轉(zhuǎn)移到長(zhǎng)日照環(huán)境下，花序終端將由花轉(zhuǎn)變成葉[7,9]。模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)在短日照條件下也有部分小花逆向發(fā)育形成花序的現(xiàn)象，然而該現(xiàn)象只在其Landsberg erecta生態(tài)型中發(fā)現(xiàn)，且逆轉(zhuǎn)頻率不高，而其突變體lfy-6和ag-1在短日照條件下發(fā)生逆轉(zhuǎn)頻率升高[8,9]。在單子葉植物中同樣有花器官逆轉(zhuǎn)相關(guān)報(bào)道，Joseph等、Wang等分別研究發(fā)現(xiàn)，玉米(Zeamays)突變體id1無(wú)雄花發(fā)育[10]，水稻(Oryzasativa)突變體pho不能形成正常小花[6]，相應(yīng)的花器官均發(fā)育形成新生幼苗。

在影響花發(fā)育的眾多因素中，植物激素被認(rèn)為是一種至關(guān)重要的因子。在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)影響到花發(fā)育的環(huán)境條件(光周期、溫度等)在誘導(dǎo)花器官形成的過(guò)程中都會(huì)引起植物體內(nèi)激素水平變化[4,5,11]。Kesy等發(fā)現(xiàn)短日照植物矮牽牛(Pharbitisnil.)在開(kāi)花前人為打斷黑暗條件將會(huì)顯著抑制開(kāi)花，研究表明該過(guò)程中植物體內(nèi)生長(zhǎng)素(IAA)和乙烯(Eth)含量急劇升高，并且外源施加IAA和Eth同樣能起到抑制開(kāi)花的效果[1]；Sringarm等研究表明龍眼樹(shù)(Dimocarpuslongan, Lour.)在低溫誘導(dǎo)開(kāi)花的過(guò)程中內(nèi)源異戊烯基腺嘌呤/異戊烯基腺苷(iP/iPA)和吲哚乙酸(IAA)含量急劇升高，而玉米素(ZR)和赤霉素(GA)含量卻明顯降低[3]。細(xì)胞分裂素(CTK)在花發(fā)育過(guò)程中也起到重要的作用，多數(shù)研究者認(rèn)為CTK在植物開(kāi)花過(guò)程中起到促進(jìn)作用[5,12]，然而也有研究認(rèn)為，細(xì)胞分裂素含量過(guò)高時(shí)，不利于植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變[13]。

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)是短日照開(kāi)花植物[14-15]，在陜西楊凌其抽穗期為每年7-8月，不同緯度間進(jìn)行引種會(huì)引起開(kāi)花期的改變。之前的研究中我們發(fā)現(xiàn)，將柳枝稷幼穗置于含有高水平外源細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上進(jìn)行體外培養(yǎng)時(shí)，部分已分化的花器官停止生殖生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)而逆向發(fā)育，經(jīng)花器官逆轉(zhuǎn)途徑形成逆轉(zhuǎn)穗芽[16]。人們對(duì)花器官逆轉(zhuǎn)的研究由來(lái)已久，然而之前的研究多集中在花器官逆轉(zhuǎn)的誘導(dǎo)方法以及現(xiàn)象描述等方面[17-18]，很少有人對(duì)花器官逆轉(zhuǎn)的生理特性進(jìn)行較為詳細(xì)的研究。柳枝稷體外花器官逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)穗芽與前人通過(guò)改變環(huán)境誘導(dǎo)花器官逆轉(zhuǎn)的方法相比具有易操作、效率更高、結(jié)果更穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)[9,19]。本文參照前人研究，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期柳枝稷人工穗芽誘導(dǎo)相關(guān)工作，從生理學(xué)方面對(duì)柳枝稷花器官逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象進(jìn)行探索，以期在一定程度上揭示柳枝稷花器官逆轉(zhuǎn)發(fā)生的機(jī)理，為柳枝稷及其他植物花器官逆轉(zhuǎn)研究和花發(fā)育研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

柳枝稷為異花授粉植物，同一品種不同植株間性狀存在一定差異[14,20]。為驗(yàn)證體外誘導(dǎo)花器官在不同類型柳枝稷材料中的一致性，試驗(yàn)以柳枝稷栽培品種“Alamo”兩個(gè)植株為材料，編號(hào)分別為“4-6”和“14-7”，其中“14-7”與“4-6”相比植株更高大且分蘗更集中。材料種植于溫室中，每天光照16 h，溫度為恒溫30℃。

1.2 柳枝稷穗芽誘導(dǎo)

當(dāng)柳枝稷發(fā)育至伸長(zhǎng)期第4期(E4期)時(shí)[21]，莖端發(fā)育出1～2 cm長(zhǎng)幼穗，取下莖端(保留幼穗上下各2 cm)，先用體積分?jǐn)?shù)70%的酒精消毒1 min，然后用體積分?jǐn)?shù)8%的次氯酸鈉(有效氯5.5%)再次消毒1～2 min，無(wú)菌水沖洗3～4次[16]。將處理后的材料在超凈工作臺(tái)中切去兩端各0.5 cm，并將其縱向切成兩半，接種到穗芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Shoot Induction Medium, SIM)或MS基本培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, MS)[22]上，之后置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為20 h白天/4 h黑暗。來(lái)自于兩棵柳枝稷單株的試驗(yàn)材料分別培養(yǎng)和研究。

MS培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)物 + 30 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1瓊脂粉，pH 5.8；

SIM培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)物 + 3 mg·L-16-BA + 30 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1瓊脂粉，pH 5.8。

1.3 穗芽繼代培養(yǎng)

穗芽誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d后，將材料在超凈工作臺(tái)中取出，切除芽塊上部葉片，留下基部1～1.5 cm，然后將其接種到新鮮培養(yǎng)基中。繼代培養(yǎng)所使用培養(yǎng)基與穗芽誘導(dǎo)培養(yǎng)一致，仍為SIM培養(yǎng)基或MS基本培養(yǎng)基。之后再次將材料置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期保持20 h白天/4 h黑暗不變。繼代培養(yǎng)30 d后(共培養(yǎng)60 d)，再次將材料取出并重復(fù)一次繼代培養(yǎng)。

1.4 生理指標(biāo)測(cè)定及方法

試驗(yàn)使用裂區(qū)設(shè)計(jì)，其中培養(yǎng)基類型(SIM和SM)和柳枝稷材料(4-6和14-7)為主處理，誘導(dǎo)時(shí)間(30 d,60 d,90 d)為副處理，試驗(yàn)材料每30 d繼代一次。取不同處理的柳枝稷穗芽分別進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定，并進(jìn)行主處理和副處理的差異性分析，每個(gè)處理重復(fù)3次。測(cè)定的生理指標(biāo)包括可溶性糖含量[23]、游離氨基酸含量[24]、可溶性蛋白含量、總氮含量、葉綠素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、多酚氧化酶(PPO)活性[25]。利用酶聯(lián)免疫法對(duì)不同處理3個(gè)培養(yǎng)時(shí)期的柳枝稷穗芽測(cè)定生長(zhǎng)素(IAA)、赤霉素(GAs)、細(xì)胞分裂素(ZRs)和脫落酸(ABA)含量，并進(jìn)行處理間和培養(yǎng)時(shí)期間的差異性分析，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)整理及圖表繪制使用Excel 2013，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用軟件DPS 7.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 柳枝稷穗芽誘導(dǎo)特點(diǎn)

當(dāng)柳枝稷4-6和14-7在SIM培養(yǎng)基和MS基本培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)30 d以后，不同處理的材料在形態(tài)上出現(xiàn)了明顯的差異。外植體在SIM培養(yǎng)基上(圖1c,1e)的生長(zhǎng)速率較MS基本培養(yǎng)基(圖1d,1f)更快，產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)穗芽數(shù)量大；與MS培養(yǎng)基上的非逆轉(zhuǎn)穗芽相比，逆轉(zhuǎn)穗芽長(zhǎng)度較短，但整體更粗壯，節(jié)間更密集；在MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，幼穗繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育，長(zhǎng)出小花(圖1d,1f)，與之相比， SIM培養(yǎng)基上幼穗的小花發(fā)育更為緩慢或出現(xiàn)花器官逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象(圖1c,1e)；柳枝稷4-6和14-7逆轉(zhuǎn)穗芽誘導(dǎo)也表現(xiàn)出一定的差異，14-7生長(zhǎng)速度較4-6更快，逆轉(zhuǎn)穗芽產(chǎn)生數(shù)量也較4-6更多，表明其具有更強(qiáng)的活性。

圖1 柳枝稷穗芽誘導(dǎo)Fig.1 Spike buds induction of switchgrass

2.2 柳枝稷穗芽發(fā)育中葉綠素含量的變化

培養(yǎng)30 d后，兩種柳枝稷材料的逆轉(zhuǎn)穗芽和非逆轉(zhuǎn)穗芽葉綠素含量并未發(fā)現(xiàn)明顯差異；60 d后，兩種柳枝稷逆轉(zhuǎn)穗芽均發(fā)生明顯的葉綠素含量降低的現(xiàn)象，而與此同時(shí)，非逆轉(zhuǎn)穗芽葉綠素含量并未發(fā)生明顯下降，方差分析結(jié)果顯示逆轉(zhuǎn)穗芽葉綠素含量極顯著低于非逆轉(zhuǎn)穗芽；與此類似，培養(yǎng)90 d的逆轉(zhuǎn)穗芽葉綠素含量極顯著低于非逆轉(zhuǎn)穗芽(表1)。兩種類型柳枝稷葉綠素含量差異不顯著(P= 0.5365)，但就不同時(shí)期而言，培養(yǎng)30 d的材料與培養(yǎng)60 d和90 d的材料差異極顯著(P< 0.01)，但后兩者差異不顯著(表1)。

表1 柳枝稷穗芽形成期間葉綠素含量變化Table 1 Chlorophyll content variation of different switchgrass spike buds

2.3 柳枝稷穗芽發(fā)育中總糖含量的變化

兩種類型柳枝稷的逆轉(zhuǎn)穗芽和非逆轉(zhuǎn)穗芽總糖含量在培養(yǎng)30 d、60 d和90 d時(shí)差異均未達(dá)到顯著水平，這表明外植體在各時(shí)期不同培養(yǎng)基上對(duì)糖的吸收、代謝差異不明顯(表2)。兩種柳枝稷之間比較總糖含量差異未達(dá)到顯著水平(P=0.5113)，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，總糖含量表現(xiàn)下降的趨勢(shì)，培養(yǎng)90 d的穗芽總糖含量極顯著低于培養(yǎng)30 d的穗芽(P< 0.01，表2)。這可能是因?yàn)槎啻卫^代的穗芽塊具有更多的穗芽，對(duì)培養(yǎng)基中糖的消耗更快，從而引起后期培養(yǎng)基碳源供應(yīng)不足。

表2 柳枝稷穗芽形成期間總糖含量變化Table 2 Total sugar content variation of different switchgrass spike buds

2.4 柳枝稷穗芽發(fā)育中可溶性蛋白、游離氨基酸及總氮含量的變化

在培養(yǎng)30 d時(shí)，逆轉(zhuǎn)穗芽可溶性蛋白含量總體高于非逆轉(zhuǎn)穗芽，但只有柳枝稷14-7達(dá)到顯著水平(表3)；與之相反，同時(shí)期的逆轉(zhuǎn)穗芽游離氨基酸的含量總體低于非逆轉(zhuǎn)穗芽，且均達(dá)到顯著水平(表4)，而總氮含量差異不顯著(表5)，這表明逆轉(zhuǎn)穗芽和非逆轉(zhuǎn)穗芽在培養(yǎng)早期對(duì)氮的吸收速率差異不明顯，但逆轉(zhuǎn)穗芽氮的代謝效率更高。培養(yǎng)60 d時(shí)，逆轉(zhuǎn)穗芽可溶性蛋白含量總體低于非逆轉(zhuǎn)穗芽，柳枝稷14-7達(dá)到顯著水平(表3)，然而游離氨基酸和總氮含量差異不顯著(表3，4)，這可能是因?yàn)槔^代后逆轉(zhuǎn)穗芽數(shù)量和生長(zhǎng)速度更快，對(duì)氮的消耗更快，從而表現(xiàn)出培養(yǎng)基氮缺乏現(xiàn)象。培養(yǎng)90 d時(shí)，逆轉(zhuǎn)穗芽可溶性蛋白含量總體低于非逆轉(zhuǎn)穗芽，游離氨基酸和總氮含量表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)(表3，4)，這可能是因?yàn)槔^代培養(yǎng)對(duì)氮的消耗進(jìn)一步加快，從而表現(xiàn)出更嚴(yán)重的培養(yǎng)基氮缺乏現(xiàn)象。兩種柳枝稷之間的可溶性蛋白、游離氨基酸和總氮含量差異均不顯著(P=0.0608,P=0.0611,P=0.4494)，而逆轉(zhuǎn)穗芽與非逆轉(zhuǎn)穗芽之間均表現(xiàn)顯著或極顯著差異(P=0.0404,P=0.0048,P=0.0024)，各時(shí)期間相比較可溶性蛋白含量整體下降，而游離氨基酸和總氮含量均為先升后降的趨勢(shì)。綜合考慮可溶性蛋白、游離氨基酸和總氮含量的變化以及SIM培養(yǎng)基后期氮供應(yīng)不足可以推斷出逆轉(zhuǎn)穗芽具有更高的氮代謝效率。

表3 柳枝稷穗芽形成期間可溶性蛋白含量變化Table 3 Soluble protein content variation of different switchgrass spike buds

表4 柳枝稷穗芽形成期間游離氨基酸含量變化Table 4 Free amino acid content variation of different switchgrass spike buds

表5 柳枝稷穗芽形成期間總氮含量變化Table 5 Total nitrogen content variation of different switchgrass spike buds

2.5 柳枝稷穗芽發(fā)育中SOD、POD、CAT活性變化

在培養(yǎng)30 d后，兩種培養(yǎng)基上的逆轉(zhuǎn)穗芽和非逆轉(zhuǎn)穗芽SOD活性無(wú)顯著差異，但培養(yǎng)60 d和90 d后，逆轉(zhuǎn)穗芽SOD活性總體高于非逆轉(zhuǎn)穗芽(表6)。培養(yǎng)30 d后，柳枝稷4-6的逆轉(zhuǎn)穗芽POD活性顯著高于其他3組處理；培養(yǎng)至60 d時(shí)活性有所下降，與柳枝稷14-7逆轉(zhuǎn)穗芽總體低于非逆轉(zhuǎn)穗芽，但未達(dá)到顯著水平；培養(yǎng)90 d后，柳枝稷14-7的逆轉(zhuǎn)穗芽POD活性急劇上升，極顯著高于其他3組處理，并且逆轉(zhuǎn)穗芽POD酶活性總體高于非逆轉(zhuǎn)穗芽，這表明在繼代2次培養(yǎng)基碳源和氮源缺乏的情況下，POD酶產(chǎn)生響應(yīng)，以起到保護(hù)的作用(表7)。CAT活性在培養(yǎng)30 d后各處理間未表現(xiàn)出顯著差異，但培養(yǎng)60 d后逆轉(zhuǎn)穗芽酶活性顯著高于非逆轉(zhuǎn)穗芽，而培養(yǎng)90 d后，柳枝稷14-7的逆轉(zhuǎn)穗芽CAT活性卻急劇下降，與SOD和POD酶活性變化截然相反，這表明CAT活性并未因碳源和氮源缺乏而產(chǎn)生響應(yīng)，相反的是其活性受到明顯的抑制(表8)。兩種柳枝稷之間的SOD、POD和CAT差異均極顯著(P=0.0013,P=0.0003,P=0.0011)，然而SOD和POD均表現(xiàn)為柳枝稷14-7活性更高，而CAT表現(xiàn)為4-6活性更高，這可能是不同類型抗氧化酶對(duì)碳氮缺乏響應(yīng)的差異所引起；SOD各時(shí)期差異不顯著，而誘導(dǎo)90 d的穗芽POD和CAT活性與其他兩個(gè)時(shí)期差異均達(dá)到極顯著水平。

表6 柳枝稷穗芽形成期間SOD活性變化Table 6 SOD activity variation of different switchgrass spike buds

表7 柳枝稷穗芽形成期間POD活性變化Table 7 POD activity variation of different switchgrass spike buds

表8 柳枝稷穗芽形成期間CAT活性變化Table 8 CAT activity variation of different switchgrass spike buds

2.6 柳枝稷穗芽發(fā)育中PPO活性的變化

方差分析發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)30 d、60 d和90 d時(shí)，兩種柳枝稷材料的逆轉(zhuǎn)穗芽和非逆轉(zhuǎn)穗芽PPO活性差異均不顯著，但總體上逆轉(zhuǎn)穗芽酶活性比非逆轉(zhuǎn)穗芽略高(表9)。兩種柳枝稷之間PPO酶活性無(wú)顯著差異(P= 0.7645)；各培養(yǎng)時(shí)期間相比較發(fā)現(xiàn)PPO活性整體呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)。

表9 柳枝稷穗芽形成期間PPO活性變化Table 9 PPO activity variation of different switchgrass spike buds

2.7 柳枝稷穗芽發(fā)育中ZR、IAA含量的變化

對(duì)兩種類型柳枝稷逆轉(zhuǎn)和非逆轉(zhuǎn)穗芽的ZR含量分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)30 d和60 d后，逆轉(zhuǎn)和非逆轉(zhuǎn)穗芽間均未體現(xiàn)出顯著的差異；培養(yǎng)90 d后柳枝稷4-6的非逆轉(zhuǎn)穗芽ZR含量顯著高于其他處理但未達(dá)到極顯著水平(表10)。材料培養(yǎng)30 d后，非逆轉(zhuǎn)穗芽IAA含量顯著高于逆轉(zhuǎn)穗芽，培養(yǎng)60 d和90 d后穗芽IAA含量雖然也有差異，但兩種柳枝稷卻并未表現(xiàn)出一致的趨勢(shì)；此外該結(jié)果還表明外源6-BA的施加對(duì)IAA的合成體現(xiàn)出一定的抑制作用。通過(guò)對(duì)IAA/ZR分析，結(jié)果與IAA含量類似，整體而言，逆轉(zhuǎn)穗芽IAA/ZR高于非逆轉(zhuǎn)穗芽(表12)。兩種柳枝稷ZR含量差異不顯著(P=0.0757)，但I(xiàn)AA含量和IAA/ZR差異達(dá)到顯著或極顯著水平(P=0.0063,P=0.0148)；不同時(shí)期相比較發(fā)現(xiàn)，ZR含量、IAA含量和IAA/ZR均表現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，且時(shí)期間差異均達(dá)到極顯著水平(P<0.0601)。

表10 柳枝稷穗芽形成期間ZR含量變化Table 10 ZR content variation of different switchgrass spike buds

表11 柳枝稷穗芽形成期間IAA含量變化Table 11 IAA content variation of different switchgrass spike buds

表12 柳枝稷穗芽形成期間IAA/ZR變化Table 12 The value of IAA/ZR variation of different switchgrass spike buds

2.8 柳枝稷穗芽發(fā)育中ABA含量的變化

培養(yǎng)30 d后，柳枝稷4-6的逆轉(zhuǎn)穗芽ABA含量顯著或極顯著高于其他3組處理，但其他3組處理間差異不顯著；培養(yǎng)至60 d時(shí)， 柳枝稷14-7的逆轉(zhuǎn)穗芽ABA含量有所上升，但4-6的逆轉(zhuǎn)穗芽ABA含量仍高于其他3組處理，且差異均達(dá)到極顯著；培養(yǎng)到90 d時(shí)，柳枝稷14-7的逆轉(zhuǎn)穗芽ABA含量有顯著上升，與4-6的逆轉(zhuǎn)穗芽ABA含量水平一致，并且均顯著高于MS培養(yǎng)基(表13)。兩種類型柳枝稷所形成的穗芽ABA含量差異極顯著(P= 0.0002)，表明兩種柳枝稷的ABA響應(yīng)存在一定的差異；3個(gè)培養(yǎng)時(shí)期相比較，差異雖未達(dá)到顯著水平，但整體呈上升趨勢(shì)，結(jié)合逆轉(zhuǎn)穗芽ABA含量更高的結(jié)果可推斷，ABA可能在穗芽發(fā)育的后期起到重要的作用。

表13 柳枝稷穗芽形成期間ABA含量變化Table 13 ABA content variation of different switchgrass spike buds

2.9 柳枝稷穗芽發(fā)育中GAs含量的變化

當(dāng)培養(yǎng)至30 d時(shí)，兩種類型柳枝稷逆轉(zhuǎn)穗芽GAs含量均高于非逆轉(zhuǎn)，差異達(dá)到顯著或極顯著水平(表14)，表明早期穗芽起始誘導(dǎo)的過(guò)程中GAs發(fā)揮著重要的作用；培養(yǎng)至60 d和90 d時(shí)，兩種類型柳枝稷逆轉(zhuǎn)穗芽GAs含量仍顯著或極顯著高于非逆轉(zhuǎn)穗芽，表明在后期逆轉(zhuǎn)穗芽發(fā)育過(guò)程中，GAs同樣行使著重要的功能(表14)。就兩種類型柳枝稷而言，14-7的GAs水平整體極顯著高于4-6，結(jié)合柳枝稷14-7穗芽生長(zhǎng)速度較4-6快，而SIM培養(yǎng)基上的穗芽生長(zhǎng)速度較MS培養(yǎng)基快，我們可以推斷GAs對(duì)穗芽形成時(shí)的快速生長(zhǎng)起到重要的作用；3個(gè)培養(yǎng)時(shí)期比較分析表明，GAs含量隨著培養(yǎng)時(shí)間總體呈上升趨勢(shì)，并且培養(yǎng)至90 d時(shí)其水平極顯著高于前兩個(gè)時(shí)期，表明GAs在逆轉(zhuǎn)穗芽形成初期及發(fā)育后期均起到重要的作用。

表14 柳枝稷穗芽形成期間GAs含量變化Table 14 GAs content variation of different switchgrass spike buds

3 討論與結(jié)論

在花發(fā)育的研究進(jìn)程中，人們往往更關(guān)注植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，而對(duì)花器官逆向發(fā)育的關(guān)注較少[26]。本試驗(yàn)利用體外花器官逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)方法，通過(guò)比較SIM培養(yǎng)基上逆轉(zhuǎn)穗芽和MS基本培養(yǎng)基上非逆轉(zhuǎn)穗芽的部分生理指標(biāo)和激素水平，發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)穗芽具有較低的葉綠素水平，但具有更高的糖含量(前兩個(gè)時(shí)期30 d、60 d)，這可能是因?yàn)轶w外培養(yǎng)過(guò)程中的碳源更多來(lái)自培養(yǎng)基，而逆轉(zhuǎn)穗芽葉綠素含量低并非導(dǎo)致其發(fā)育速度快的原因。綜合考慮兩種培養(yǎng)基上的穗芽可溶性蛋白、游離氨基酸和總氮含量的變化以及SIM培養(yǎng)基后期氮供應(yīng)不足可以推斷出，與非逆轉(zhuǎn)穗芽相比，逆轉(zhuǎn)穗芽具有更高的氮代謝效率。逆轉(zhuǎn)穗芽和非逆轉(zhuǎn)穗芽抗氧化酶活性比較發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)穗芽整體抗氧化酶系統(tǒng)具有更高的活性。外源施加6-BA對(duì)柳枝稷內(nèi)源ZR的合成無(wú)顯著影響，但對(duì)IAA的合成可能起到一定的抑制作用，這對(duì)穗芽起始誘導(dǎo)起到關(guān)鍵的作用。ABA可能在穗芽發(fā)育的后期階段起到重要的作用，而GAs可能在穗芽發(fā)育的整個(gè)時(shí)期都有行使重要的功能。

激素是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要物質(zhì)，在花發(fā)育和花器官逆轉(zhuǎn)過(guò)程中也起到至關(guān)重要的作用。Gaudinová等在研究病毒引起的黑醋栗(Ribesnigrum)花器官逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)，被病毒感染的花器官與正常組織相比細(xì)胞分裂素含量異常升高[13]。Young等研究表明細(xì)胞分裂素在玉米雌蕊發(fā)育以及雌蕊發(fā)育方向決定中起到重要的作用[27]。這些結(jié)果都與本試驗(yàn)相一致。Jack等在研究中指出赤霉素是花器官形成過(guò)程中傳遞光周期信號(hào)的重要物質(zhì)，對(duì)花芽的形成起到促進(jìn)作用，花器官逆轉(zhuǎn)可能通過(guò)降低植物體內(nèi)赤霉素水平而發(fā)生[8]。然而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)穗芽形成過(guò)程中具有較高的赤霉素水平，這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)中高濃度的外源6-BA主導(dǎo)柳枝稷花器官逆轉(zhuǎn)的發(fā)生，而赤霉素可能起到加快發(fā)育進(jìn)程的作用。此外，Cai等和Yuan等的研究表明，茉莉酸甲酯在花發(fā)育中起到促進(jìn)的作用[11,28]。

在花器官逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)條件研究中，光周期和溫度被認(rèn)為是啟始花器官逆轉(zhuǎn)的重要因素[7,9]。Okamuro等通過(guò)研究光周期和激素對(duì)擬南芥花器官逆轉(zhuǎn)的影響試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LFY和AG在花分生組織保持中起到重要作用，而其突變體發(fā)生的花器官逆轉(zhuǎn)可能與光敏色素和赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)[8]。本試驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中，外植體培養(yǎng)光周期為20 h白天/4 h黑暗，該條件是不利于短日照植物柳枝稷正?；ㄆ鞴侔l(fā)育的[14]。然而在相同光周期條件的MS基本培養(yǎng)基上無(wú)花器官逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象發(fā)生，表明在柳枝稷幼穗體外培養(yǎng)過(guò)程中，單獨(dú)改變光周期無(wú)法誘導(dǎo)其花器官逆向發(fā)育，外源施加高濃度細(xì)胞分裂素是柳枝稷花器官逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)的必要條件。光周期在誘導(dǎo)柳枝稷花器官逆轉(zhuǎn)中是否起到一定的作用仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

植物花器官逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象能夠使我們從反方向研究花發(fā)育，為花發(fā)育研究和基因功能驗(yàn)證提供新的思路。Wang等通過(guò)對(duì)水稻花器官逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象的研究發(fā)現(xiàn)DEP和AFO基因在決定花的形成中起到重要的作用[6]。Ampomah-Dwamena等通過(guò)對(duì)西紅柿中的SEP同源基因TM29共抑制和RNA干擾研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株在一定程度上表現(xiàn)出花器官逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，甚至在部分畸形果實(shí)上能夠長(zhǎng)出新的葉子或芽[29]。本試驗(yàn)采用體外誘導(dǎo)方法獲得柳枝稷花器官逆轉(zhuǎn)，通過(guò)對(duì)逆轉(zhuǎn)穗芽和非逆轉(zhuǎn)穗芽的比較研究，在一定程度上揭示了柳枝稷穗芽形成過(guò)程中的生理生化特性。同時(shí)本試驗(yàn)存一定的不足之處，為確保結(jié)果一致性，所選柳枝稷材料只有栽培種Alamo的兩個(gè)單株，試驗(yàn)結(jié)果具有一定的局限性，但二者結(jié)果整體表現(xiàn)一致，對(duì)研究花發(fā)育以及花器官逆轉(zhuǎn)能夠提供一定的參考作用。