用CRISPR/CAS9系統(tǒng)構(gòu)建原位表達(dá)dPit:GFP的果蠅品系

李博，胡君誠(chéng),金珊

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

用CRISPR/CAS9系統(tǒng)構(gòu)建原位表達(dá)dPit:GFP的果蠅品系

李博，胡君誠(chéng),金珊

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

SLC20A2基因是Ⅲ型納磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(PiT2)的編碼基因，PiT2可將無機(jī)磷從細(xì)胞外運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi).SLC20A2基因突變導(dǎo)致PiT2不能正常地將無機(jī)磷運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，血液中的無機(jī)磷含量升高,磷和鈣離子結(jié)合形成沉淀,堵塞血管.SLC20A2基因在果蠅中的同源基因是CG42575(dpit).本實(shí)驗(yàn)使用CRISPR/CAS9系統(tǒng)，構(gòu)建原位表達(dá)dPiT:GFP的果蠅品系，將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)編碼序列插入dpit基因末端，使果蠅表達(dá)dPiT:GFP融合蛋白.該融合蛋白可以被dPiT及GFP的抗體同時(shí)識(shí)別，通過熒光直接觀察dPiT:GFP的位置，從而準(zhǔn)確定位dpit，進(jìn)而為dpit基因的功能研究提供基礎(chǔ).

果蠅；CRISPR/CAS9系統(tǒng)；SLC20A2；dpit

0 引言

Ⅲ型納磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(PiT2)是SLC20A2基因的表達(dá)產(chǎn)物，其主要功能有兩個(gè)：從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)無機(jī)磷和作為逆轉(zhuǎn)錄病毒的受體.SLC20A2基因突變后，會(huì)導(dǎo)致PiT2合成受阻，血液中的無機(jī)磷酸鹽含量升高.多余的磷酸鹽可以和鈣離子結(jié)合，形成沉淀，該過程是人類家族性基底節(jié)鈣化發(fā)病的原因之一[1].目前，在哺乳動(dòng)物中，PiT2的分布未能精確認(rèn)知，這阻礙了PiT2的功能分析的進(jìn)展.哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，周期較長(zhǎng)，成本較高，不能快捷地獲取結(jié)果.根據(jù)序列比對(duì)，SLC20A2基因在果蠅體內(nèi)的同源基因?yàn)镃G42575(dpit)，該基因位于三號(hào)染色體右臂上的68A7到68A8區(qū)域，編碼 667個(gè)氨基酸，它編碼的氨基酸與SLC20A2的一致性與相似性分別為39%和55%，dpit的表達(dá)位置對(duì)該蛋白的功能研究具有重要意義.本實(shí)驗(yàn)用CRISPR/ CAS9技術(shù)構(gòu)建了內(nèi)源性表達(dá)的dPiT:GFP復(fù)合蛋白的果蠅，成功地對(duì)果蠅基因進(jìn)行高效快速編輯.該果蠅的獲得可以使我們精確定位dpit，為后續(xù)結(jié)構(gòu)及功能的研究提供基礎(chǔ).

CRISPR/CAS9(clustered regulary interspaced short palindromic repeat system)系統(tǒng)是一種定向的靶序列基因修飾技術(shù)，最初發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌的防御系統(tǒng)中，用來阻止病毒或外源質(zhì)粒的入侵[2-5].Cas9核酸內(nèi)切酶通過crRNA(CRISPR RNA)與外源DNA配對(duì)的20個(gè)堿基識(shí)別靶序列位點(diǎn)[6-8]，后與tracer RNA(trans-acting crRNA)結(jié)合共同引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶工作.后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，研究者將crRNA和tracrRNA融合成一條sgRNA(single guide RNA)[8-9]，簡(jiǎn)化后該系統(tǒng)設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)依賴于sgRNA5′端的20個(gè)堿基，唯一的限制是引導(dǎo)序列的3′端必須要有一個(gè)PAM(protospacer adjacent motif)序列.針對(duì)靶序列進(jìn)行切割后，會(huì)形成DSB(double strand break)，DSB的修復(fù)方式有兩種：NHEJ(nonhomologous end joining)和HDR(homology-directed).NHEJ是一種傾向錯(cuò)配的修復(fù)方式，修復(fù)后通常會(huì)產(chǎn)生堿基的插入或缺失，這種方式有利于構(gòu)建null突變體或氨基酸缺失的果蠅品系.HDR是一種精確的修復(fù)方式，修復(fù)過程依賴于同源臂的交換.通過這這種方式，在修復(fù)過程中提供供體序列(Donor)，可以用來構(gòu)建定點(diǎn)突變或?qū)蛑休^短的序列進(jìn)行編輯[8,10].作為一種新興的基因編輯技術(shù)，CRISPR/CAS9系統(tǒng)具有靶位點(diǎn)廣泛，突變效率高，操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn).相比于傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)如鋅指酶和TALEN等技術(shù)，雖然都是依賴切割DNA雙鏈產(chǎn)生DSB后，生物體內(nèi)自身的修復(fù)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，但CRISPR/CAS9系統(tǒng)只有兩個(gè)工作元件，卻更加準(zhǔn)確地識(shí)別靶位點(diǎn)，這就節(jié)省了大量的工作.相比于TALEN技術(shù)，CRISPR/CAS9系統(tǒng)識(shí)別位點(diǎn)更為廣泛，其使用范圍更廣，常見的PAM區(qū)域多為NGG，但也有研究表明NAG或GAA也可作為PAM區(qū)域[11-13].

隨著CRISPR/CAS9系統(tǒng)的成熟，部分果蠅的研究者將該系統(tǒng)引入果蠅系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)果蠅的基因編輯.2013年，Gratz等第一次將表達(dá)Cas9酶的質(zhì)粒與表達(dá)sgRNA的質(zhì)粒注射到果蠅的卵中，實(shí)現(xiàn)了CRISPR/ CAS9系統(tǒng)在果蠅系統(tǒng)中的基因編輯[14].隨后，Bassett和Yu等將表達(dá)Cas9的mRNA和sgRNA同時(shí)注射，大大提高了突變的效率.但是，由于RNA的不穩(wěn)定性，該方法操作難度較高.還有一些研究者將兩種質(zhì)粒分別注射，得到能夠分別表達(dá)Cas9酶和sgRNA的果蠅，然后將二者雜交.該方法提高了突變的效率，但實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，且得到的目的果蠅必須經(jīng)過純化，去掉帶有Cas9和sgRNA的染色體[10,15].本實(shí)驗(yàn)參考了Ren等的方法，將sgRNA的表達(dá)載體注射到只在生殖腺表達(dá)Cas9的果蠅卵中，注射成功的果蠅后代為目的轉(zhuǎn)基因果蠅[16].該方法具有較高的突變效率，同時(shí)實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)周期較短.

本實(shí)驗(yàn)通過CRISPR/CAS9系統(tǒng)構(gòu)建出可以表達(dá)dPiT:GFP復(fù)合蛋白的果蠅，利用CRISPR/CAS9系統(tǒng)切割后，果蠅自身發(fā)生的HDR修復(fù).在Cas9核酸內(nèi)切酶切割后，提供外源Donor，將eGFP編碼序列整合到dpit基因終止子之前.相比傳統(tǒng)方法，該方法更為準(zhǔn)確，方便，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，且突變效率高，易于操作.

1 材料與方法

1.1 果蠅品系 購(gòu)自Bloomington果蠅中心，用于二號(hào)染色體定點(diǎn)插入的BL25709(attp40)、用于在果蠅生殖腺內(nèi)表達(dá)Cas9酶的BL54591(nos-Cas9)和BL51323(vasa-Cas9)及balancer的果蠅MKRS/TM6B、Sp/CyO(v-).

1.2 載體 本實(shí)驗(yàn)所用載體參見表1.

1.3 抗體 本實(shí)驗(yàn)所用抗體參見表2所示.

表1 本實(shí)驗(yàn)所用載體

表2 本實(shí)驗(yàn)所用抗體

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)預(yù)計(jì)將eGFP插入到dpit終止子TAA的前面，sgRNA序列在CRISPR optimal target finder(http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/)設(shè)計(jì)后交由生物公司合成兩條帶有BbsⅠ酶切位點(diǎn)的單鏈.通過PCR將兩條單鏈合成短片段雙鏈DNA后，連入事先酶切過的pCDF-3質(zhì)粒中.轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中擴(kuò)大培養(yǎng)，抽取質(zhì)粒.

1.4.2 donor載體的構(gòu)建 提取野生型果蠅的總DNA后，使用引物擴(kuò)增出用于同源重組修復(fù)的同源臂；以pUAST-GFP質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出沒有終止子的GFP片段.使用overlap PCR技術(shù)將3個(gè)片段連接在一起，使其成為左同源臂-GFP-右同源臂的一個(gè)片段.將所得片段與PMD18-T連接后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中擴(kuò)大培養(yǎng)，抽取質(zhì)粒.

圖1 顯微注射流程圖

1.4.3 顯微注射 顯微注射方法參考Yu等[15].將sgRNA表達(dá)載體注射到attp40果蠅的卵中，獲得的sgRNA轉(zhuǎn)基因果蠅與表達(dá)Cas9酶的果蠅雜交，在雜交后代的卵中注射GFP-donor質(zhì)粒.將所得成蟲與MKRS/TM6B雜交，然后使用PCR鑒定后代，得到轉(zhuǎn)基因果蠅(見圖1).

1.4.5 免疫染色 將三齡幼蟲固定在解剖盤上，將幼蟲尾部橫向剪開，展開果蠅的表皮和肌肉層，保證大腦處于頭部中間.用4%的PFA固定1 h后用0.2%的PBST(tritonX-100)清洗幼蟲皮，室溫封閉0.5 h.4 ℃孵育一抗2 h，清洗后室溫孵育二抗2 h，清洗后封片.

2 結(jié)果

2.1 sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 為了保證sgRNA的效率，設(shè)計(jì)了3條sgRNA(來自CRISPR optimal target finder).將 sgRNA插入表達(dá)載體pCDF3中，測(cè)序(見圖2).

圖2 sgRNA的序列及表達(dá)載體的構(gòu)建 A)sgRNA的序列及靶位點(diǎn)； B)pCDF3-sgRNA表達(dá)載體與pCDF3載體瓊脂糖電泳圖示，由于使用BbsⅠ切割pCDF3質(zhì)粒，切下的片段與sgRNA大小一致，故sgRNA表達(dá)載體大小與原pCDF3載體大小一致；C)sgRNA表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果及峰圖.

2.2 獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)sgRNA的轉(zhuǎn)基因果蠅 將得到的sgRNA表達(dá)載體注射到attp40果蠅的卵中.由于attp40果蠅的眼色背景為w+,v-眼色為鮮紅色；sgRNA的表達(dá)載體中帶有vermilion基因，故轉(zhuǎn)基因成功的果蠅的眼色基因會(huì)成為w+,v+從鮮紅變成深紅.提取轉(zhuǎn)基因果蠅的基因組，以其為模板，引物為pCDF3載體上的一段，PCR鑒定測(cè)序.將所得的轉(zhuǎn)基因果蠅雜交后得到純合的后代(見圖3).

圖3 sgRNA的轉(zhuǎn)基因果蠅鑒定 A)轉(zhuǎn)基因果蠅與原始果蠅眼色對(duì)比. B)轉(zhuǎn)基因果蠅PCR結(jié)果電泳圖. C)PCR測(cè)序結(jié)果顯示8-5為sgRNA1的轉(zhuǎn)基因果蠅，8-6為sgRNA2的轉(zhuǎn)基因果蠅，8-8為sgRNA3的轉(zhuǎn)基因果蠅.

2.3 獲得帶有donor的載體 本實(shí)驗(yàn)同源臂長(zhǎng)度為1 kb.提取果蠅基因組DNA后，以其為模板擴(kuò)增出左右同源臂；以載體pUAST-GFP為模板擴(kuò)增出GFP片段；使用overlap PCR技術(shù)將3個(gè)片段連接在一起后，連入克隆載體PMD18-T中，測(cè)序(見圖4).

圖4 帶有donor載體的構(gòu)建 A)左右同源臂的位置示意圖.B)獲取的左右同源臂及GFP片段的電泳圖；C)overlap PCR后電泳圖.D)overlap PCR后膠回收的目的片段.

2.4 能夠穩(wěn)定遺傳dPiT:GFP果蠅品系的鑒定 將所得的sgRNA果蠅與Cas9果蠅雜交后收集后代的卵，注射donor載體.注射完畢共收集21只成蟲，與MKRS/TM6B雜交后取子代果蠅PCR鑒定，第13號(hào)果蠅中插入了GFP序列，后續(xù)中還有兩只成功鑒定到突變.對(duì)13號(hào)果蠅子代進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)，分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增左右同源臂及GFP序列，均得到目的片段(見圖5).

圖5 dPiT:GFP果蠅品系的鑒定 A)注射成功后雜交后代的檢測(cè).上游引物位于dPiT最后一個(gè)外顯子上，下游引物位于3′-UTR上，擴(kuò)增長(zhǎng)度為452 bp.當(dāng)GFP序列成功插入后，片斷長(zhǎng)度為1 166 bp.B)對(duì)13號(hào)果蠅子代單獨(dú)鑒定結(jié)果的電泳圖.

2.5 獲得的dPiT:GFP果蠅的鑒定 得到目的果蠅后，需確定插入的GFP是否能夠正常工作.通過Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)的分子量，結(jié)果顯示，融合蛋白與預(yù)期一致，融合蛋白可以被dPiT及GFP的抗體同時(shí)識(shí)別.通過共聚焦顯微鏡觀察dPiT:GFP果蠅的三齡幼蟲大腦，能夠看到GFP受激發(fā)產(chǎn)生的熒光，相比于抗體染色，直接觀察時(shí)背景較少.同時(shí)使用dPiT的抗體N3-2對(duì)野生型果蠅大腦免疫染色，結(jié)果與直接觀察結(jié)果一致(見圖6).

圖6 融合蛋白的檢測(cè) A)dPiT:GFP的Western blot結(jié)果.分別使用dPiT和GFP抗體，二者均能和融合蛋白結(jié)合，且分子量大小和預(yù)期一致.但是在對(duì)照的泳道中只有N3-1能夠與dPiT結(jié)合.B)使用N3-2抗體對(duì)野生型果蠅三齡幼蟲的大腦進(jìn)行免疫組織染色及共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)使用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前廣泛應(yīng)用于基因編輯的一種技術(shù)，近年來被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域.實(shí)驗(yàn)中，我們將sgRNA注射到只有生殖腺表達(dá)Cas9酶的果蠅卵中，提高突變效率，同時(shí)降低了工作量.本實(shí)驗(yàn)注射了500個(gè)左右的卵，最終成活的18只幼蟲中有4只為轉(zhuǎn)基因果蠅，大大降低了實(shí)驗(yàn)耗時(shí)和工作量，操作更加簡(jiǎn)便快捷.基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的這些優(yōu)點(diǎn)，產(chǎn)生了更多的改進(jìn)與優(yōu)化技術(shù)，這些技術(shù)的出現(xiàn)和成熟為我們的后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了幫助，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，但仍舊有更多的新技術(shù)和新方法等待我們?nèi)ヌ剿骱桶l(fā)現(xiàn).

PiT2作為參與生物體磷酸鹽代謝的重要組成部分，在哺乳動(dòng)物的腎臟、大腦和小腸中都有分布.然而，到目前為止，PiT2的在生物體內(nèi)的完整分布尚未明確.確定PiT2的表達(dá)位置，對(duì)于該蛋白功能相關(guān)信號(hào)通路的研究具有重要意義.SLC20A2基因與dpit的高度相似性和一致性，使得在果蠅體內(nèi)模擬研究PiT2成為可能.在果蠅體內(nèi)，PiT2分布相對(duì)簡(jiǎn)單，且果蠅生活周期短，后代多，易培養(yǎng).在初步的觀察和統(tǒng)計(jì)中，果蠅體內(nèi)PiT2的表達(dá)位置能夠與哺乳動(dòng)物對(duì)照參考.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的能夠原位表達(dá)的dPiT:GFP融合蛋白，可以直觀地顯示PiT2的分布.

通過對(duì)果蠅三齡幼蟲大腦的觀察，dPiT:GFP融合蛋白在果蠅大腦中的分布與Karsai等研究中所示區(qū)域相似[17]，主要存在于大腦中.相比于抗體染色，直接觀察時(shí)背景較少，減少了實(shí)驗(yàn)背景的干擾因素，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確.dpit基因功能的相關(guān)研究還在進(jìn)行，能夠原位表達(dá)dPiT:GFP融合蛋白的果蠅品系是后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需要的工具果蠅之一，后續(xù)研究我們將繼續(xù)探索.

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(責(zé)任編輯 游俊)

Generate a dPit:GFP fly stock with the CRISPR/ Cas9 system

LI Bo, HU Juncheng，JIN Shan

(College of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, China)

Phosphate can be transported to intracellular by type Ⅲ Na+/Pi co-transporters (PiT2), which is coded bySLC20A2. In theSLC20A2 mutants, phosphate precipitates with Ca2+in the blood and block blood vessels. The homologous gene of humanSLC20A2 is theCG42575 (dpit) in Drosophila. In our study, we used CRISPR/CAS9 system to insert the green fluorescent protein (GFP) in the carbon end ofdpitto get aDrosophila, which expresses the dPiT:GFP fusion protein. The dPiT:GFP fusion protein could be observed by GFP fluorescence directly and stained by the antibody of dPiTor GFP. It is a useful tool to locate thedpitexactly and to investigate thedpitfunction.

Drosophila; CRISPR/CAS9;SLC20A2;dpit

2016-11-16

國(guó)家自然科學(xué)基金(31230045、81471154)資助

李博(1991-)，男，碩士生；金珊，通信作者，教授，E-mail: jinshan@hubu.edu.cn

1000-2375(2017)05-0462-06

Q789

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2017.05.005