大腸桿菌生產(chǎn)莽草酸的基因工程菌構(gòu)建

韓 超，蔡靈芝，毛 倩，李燕軍，謝希賢

(1.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457)

大腸桿菌生產(chǎn)莽草酸的基因工程菌構(gòu)建

韓 超1,2，蔡靈芝1,2，毛 倩1,2，李燕軍1,2，謝希賢1,2

(1.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457)

莽草酸是芳香族氨基酸合成中的重要中間代謝物，可用于多種藥物的化學(xué)合成.在代謝工程理論的指導(dǎo)下，構(gòu)建積累莽草酸的高產(chǎn)菌株.通過構(gòu)建敲除編碼莽草酸激酶的基因aroL與aroK的菌株阻斷莽草酸的代謝；通過構(gòu)建敲除編碼奎尼酸/莽草酸脫氫酶的基因ydiB的菌株減少副產(chǎn)物的合成；同時(shí)通過構(gòu)建人工操縱子過表達(dá)編碼DAHP合酶、莽草酸脫氫酶、脫氫奎尼酸脫水酶和三脫氫奎尼酸合酶的基因aroG，aroE，aroD和aroB以強(qiáng)化莽草酸合成途徑.最終得到E.coliSHIKΔaroLΔydiB菌株，搖瓶發(fā)酵能夠積累莽草酸5.5 g/L.

莽草酸；莽草酸激酶；大腸桿菌；aroL；ydiB

莽草酸被廣泛應(yīng)用于生物堿、吲哚衍生物和手性藥物等物質(zhì)的化學(xué)合成.近年來，莽草酸因被用于合成抗禽流感藥物達(dá)菲而成為研究熱點(diǎn)[1-3].莽草酸市場價(jià)格高居不下，前景良好[4].目前，眾多的研究者投身于達(dá)菲合成路線的改良，旨在提高合成效率、緩解供求緊張.

莽草酸的生產(chǎn)方式可分為植物直接提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法.對(duì)于微生物發(fā)酵法來說，微生物體內(nèi)已經(jīng)存在天然的莽草酸合成途徑，只是產(chǎn)物積累較慢，且能積累莽草酸的物種有限，因而必須通過基因工程手段對(duì)微生物進(jìn)行改造，提高莽草酸的積累量.Knop等[5]針對(duì)大腸桿菌開展了持續(xù)多年的系統(tǒng)研究，首先將莽草酸激酶aroL和aroK全部失活，再將aroB基因整合替換基因組上的serA基因位點(diǎn)，最后過表達(dá)aroFFBR，tktA，aroE和serA基因，莽草酸質(zhì)量濃度可達(dá)52 g/L，轉(zhuǎn)化率為18%.2010年，Escalante等[6]采用aroL，aroK雙突變菌同時(shí)使PTS系統(tǒng)(phosphotransferase system)缺失，發(fā)酵產(chǎn)莽草酸的質(zhì)量濃度為7 g/L；2014年，肖夢榕等[7]敲除大腸桿菌W3110的aroL基因，改良PTS系統(tǒng)并以運(yùn)動(dòng)假單胞菌的glf，glk基因替代PTS系統(tǒng)，再強(qiáng)化表達(dá)了aroGfbr，aroB和aroE基因，使得菌株搖瓶生產(chǎn)莽草酸的質(zhì)量濃度為1 024 mg/L，6 L發(fā)酵罐中莽草酸的質(zhì)量濃度為15.12 g/L.莽草酸基因工程菌無論是產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率還是工藝研究遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意的水平，到目前為止，國內(nèi)尚無利用代謝工程菌大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)莽草酸的相關(guān)報(bào)道.筆者以具有積累莽草酸潛力的色氨酸生產(chǎn)菌EscherichiacoliSHIK為出發(fā)菌株，按照代謝工程改造思路分兩部分進(jìn)行改造：首先將與莽草酸代謝相關(guān)的基因敲除以阻斷莽草酸代謝途徑，同時(shí)敲除與副產(chǎn)物合成相關(guān)的基因，保證碳架主要流向莽草酸；其次通過構(gòu)建人工操縱子，強(qiáng)化莽草酸合成途徑，進(jìn)一步增加莽草酸的積累.

1 材料與方法

1.1 菌 種

以天津科技大學(xué)工業(yè)微生物菌種保藏室提供的色氨酸工程菌E.coliSHIK作為出發(fā)菌株.

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，NaCl 2.5 g/L，瓊脂粉30 g/L；pH 7.0，121 ℃滅菌20 min，37 ℃培養(yǎng)12 h為一代.

搖瓶種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母粉2 g/L，蛋白胨2 g/L，MgSO4·7H2O 1.6 g/L，K2HPO4·3H2O 5.6 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.8 mg/L，MnSO4·H2O 1.2 mg/L，VB11.3 mg/L，pH 7.0，115 ℃滅菌15 min，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)10 h.

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖8 g/L，酵母粉1.0 g/L，檸檬酸2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，K2HPO4·3H2O 7.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 1 mg/L，微量元素混合溶液(鉬酸銨0.28 mg/L，硼酸5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.4 mg/L，MnSO4·H2O 0.5 mg/L，CuSO4·7H2O 0.5 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.6 mg/L)1 mL/L，pH 7.0，115 ℃滅菌15 min，36 ℃，200 r/min培養(yǎng)26 h.

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建方法

采用限制性內(nèi)切酶分別對(duì)目的片段和目的載體進(jìn)行酶切處理，利用OMEGA公司的切膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收.用核酸分析儀檢測目的片段和目的載體的濃度，從而確定目的片段和目的載體的添加量，使摩爾比為3∶1～9∶1，一共5 μL體系.在體系中加入5 μL solution I，混勻.將其置于16 ℃水浴加熱1 h.將連接體系用CaCl2介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，然后將其涂布于含有相應(yīng)抗生素的抗性平板中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)14～16 h.挑取單菌落接種至含有相應(yīng)抗生素的LB搖管中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，從而獲得目的質(zhì)粒.

1.4 檢測方法

發(fā)酵液中葡萄糖濃度使用SBA-40C多功能葡萄糖-谷氨酸分析儀測定.菌體量通過測定波長600 nm下的OD值來確定.莽草酸、奎尼酸和乙酸等代謝物使用HPLC測定，色譜條件為：Shodex Asahipak NH2色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相V(乙腈)∶V(2% H3PO4)=80∶20；流速0.8 mL/min；測定波長213 nm，柱溫40 ℃.

2 結(jié) 果

2.1 敲除aroK和aroL基因?qū).coliSHIK積累莽草酸的影響

以E.coliSHIK作為出發(fā)菌株，利用RED重組[8]實(shí)現(xiàn)對(duì)aroK和aroL基因的敲除，將獲得的菌株分別命名為E.coliSHIKΔaroK和E.coliSHIKΔaroL.以缺失aroK基因的重組子E.coliSHIKΔaroK作為出發(fā)菌株，再次利用RED重組敲除aroL基因，得到的重組子即為同時(shí)缺失aroK和aroL基因的菌株，命名為E.coliSHIKΔaroKΔaroL.

搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明：基因aroK和aroL的缺失總體上有利于莽草酸的積累，但不同菌株的莽草酸積累量和菌體生長情況不同，結(jié)果見圖1.

首先，出發(fā)菌株E.coliSHIK也能積累一定量的莽草酸(33.6 mg/L)，且較野生型菌株高，適合作為本研究的出發(fā)菌.比較E.coliSHIKΔaroK和E.coliSHIKΔaroL兩株單敲除菌株，由于aroL所編碼的莽草酸激酶II擁有更好的底物親和力，在莽草酸激酶的催化過程中占有絕對(duì)的領(lǐng)導(dǎo)地位，敲除aroL基因，使得莽草酸的積累量達(dá)到所有菌株的最高值(475.1 mg/L)；另一方面，敲除aroK基因?qū)γР菟岱e累并無正面影響，質(zhì)量濃度僅16.4 mg/L，較出發(fā)菌株低.而E.coliSHIKΔaroKΔaroL雙基因敲除菌株，由于完全阻斷了莽草酸的下游代謝，嚴(yán)重影響到下游各代謝物的合成，尤其是菌體生長所必需的3種芳香族氨基酸的合成，導(dǎo)致菌體生長緩慢且最終菌體量較低，雖然保持了一定的莽草酸積累(98.9 mg/L)，且擁有較高的比生產(chǎn)速率，但由于不能實(shí)現(xiàn)菌體正常生長，所以并不能夠成為莽草酸生產(chǎn)菌的優(yōu)選菌株.

1—E. coli SHIKΔaroK；2—E. coli SHIKΔaroL；3—E. coli SHIKΔaroLΔaroK；4—E. coli SHIK圖1 aroL與aroK基因敲除對(duì)莽草酸發(fā)酵的影響 Fig.1 Effects of aroL and aroK gene knockout on shikimate fermentation

2.2 過表達(dá)DAHP合成酶對(duì)積累莽草酸的影響

為了獲得高效表達(dá)DAHP合成酶載體，利用擁有強(qiáng)啟動(dòng)子pTrc的常用質(zhì)粒pTrc99A過表達(dá)DAHP合成酶的同工酶基因aroG，將獲得的質(zhì)粒命名為pTrc99A-aroG.將質(zhì)粒pTrc99A-aroG轉(zhuǎn)化至E.coliSHIKΔaroK，E.coliSHIKΔaroL，E.coliSHIKΔaroLΔaroK和E.coliSHIK中，以未導(dǎo)入質(zhì)粒的菌株作為對(duì)照進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果見圖2.

1—菌株E. coli SHIKΔaroK；2—菌株E. coli SHIKΔaroL；3—菌株E. coli SHIKΔaroLΔaroK；4—菌株E. coli SHIK 圖2 E. coli SHIKΔaroK/pTrc99A-aroG，E. coli SHIKΔaroL/pTrc99A-aroG，E. coli SHIKΔaroLΔaroK/pTrc99A-aroG和E. coli SHIK/pTrc99A-aroG的發(fā)酵結(jié)果 Fig.2 Fermentation results of E. coli SHIKΔaroK/pTrc99A-aroG, E. coli SHIKΔaroL/pTrc99A-aroG, E. coli SHIKΔaroLΔaroK/pTrc99A-aroG and E. coli SHIK/pTrc99A-aroG

圖2結(jié)果表明：過表達(dá)基因aroG，就生物量而言，除E.coliSHIKΔaroLΔaroK有所減少外，其他各菌株都有所提升或是保持穩(wěn)定，對(duì)生物量總體影響不大；在莽草酸積累上，E.coliSHIKΔaroK，E.coliSHIKΔaroL，E.coliSHIKΔaroLΔaroK和E.coliSHIK過表達(dá)DAHP合成酶之后的產(chǎn)量分別較之前提高了25.73，2.67，0.39，81.25倍.因?yàn)閍roG是編碼DAHP合酶的基因，而DAHP合酶是莽草酸合成的前體物磷酸烯醇式丙酮酸和赤蘚糖-4-磷酸合成DAHP的關(guān)鍵酶，所以過表達(dá)aroG基因，進(jìn)一步將碳流從中樞代謝拉向莽草酸途徑，所以莽草酸產(chǎn)量會(huì)有大幅度提高.而E.coliSHIKΔaroL/pTrc99A-aroG質(zhì)量濃度達(dá)到最大2.60 g/L.

2.3 敲除ydiB基因?qū)Ψe累莽草酸的影響

選擇敲除奎尼酸/莽草酸脫氫酶基因，是因?yàn)樗漠a(chǎn)物雖然同時(shí)具備奎尼酸脫氫酶和莽草酸脫氫酶的功能，但它對(duì)3-脫氫奎尼的親和力更強(qiáng)，導(dǎo)致代謝流被更多地分配到奎尼酸合成途徑，造成碳架的浪費(fèi).筆者在敲除aroL基因的基礎(chǔ)上繼續(xù)強(qiáng)化莽草酸途徑，阻斷支路途徑消耗.利用RED重組，以E.coliSHIKΔaroL為出發(fā)菌，敲除ydiB基因，將獲得的菌株命名為E.coliSHIKΔaroLΔydiB.將質(zhì)粒pTrc99A-aroG轉(zhuǎn)化至E.coliSHIKΔaroLΔydiB中，以E.coliSHIKΔaroL/pTrc99A-aroG和不含pTrc99A-aroG質(zhì)粒的兩株菌作為對(duì)照，搖瓶發(fā)酵結(jié)果見圖3.

從生物量來看，菌體生長并沒有受到y(tǒng)diB基因缺失的影響.從莽草酸產(chǎn)量上，缺失ydiB基因并沒有使莽草酸積累得到提高，但奎尼酸產(chǎn)量明顯下降，甚至消失.因?yàn)閥diB基因編碼的奎尼酸脫氫酶使三脫氫奎尼酸轉(zhuǎn)化成奎尼酸是一個(gè)雙向的過程，敲除了ydiB基因后阻斷了三脫氫奎尼酸到奎尼酸的流向，同時(shí)也阻斷了奎尼酸到三脫氫奎尼酸的流向，所以莽草酸產(chǎn)量并沒有提高.導(dǎo)入pTrc99A-aroG質(zhì)粒后，兩株菌株的奎尼酸積累明顯提高.

1—菌株E. coli SHIKΔaroL；2—菌株E. coli SHIKΔaroLΔydiB圖3 E. coli SHIKΔaroL和E. coli SHIKΔaroLΔydiB菌株的發(fā)酵對(duì)比Fig.3 Fermentation comparison of E. coli SHIKΔaroL and E. coli SHIKΔaroLΔydiB

2.4 強(qiáng)化莽草酸合成途徑對(duì)E.coliSHIKΔaroLΔydiB菌株積累莽草酸的影響

為了進(jìn)一步強(qiáng)化莽草酸合成途徑，筆者通過構(gòu)建人工操縱子，在編碼DAHP合酶的aroG基因后繼續(xù)串聯(lián)表達(dá)編碼莽草酸脫氫酶、三脫氫奎尼酸脫水酶和三脫氫奎尼酸合酶的aroE，aroD和aroB相關(guān)基因.以質(zhì)粒pTrc99A-aroG為基礎(chǔ)，依次串聯(lián)aroE，aroD和aroB基因，得到質(zhì)粒pTrc99A-aroGE，pTrc99A-aroGED和pTrc99A-aroGEDB.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliSHIKΔaroLΔydiB菌株，搖瓶發(fā)酵結(jié)果見圖4.

YG—E. coli SHIKΔaroLΔydiB菌株攜帶pTrc99A-aroG質(zhì)粒；YGE—E. coli SHIKΔaroLΔydiB菌株攜帶pTrc99A-aroGE質(zhì)粒；YGED—E. coli SHIKΔaroLΔydiB菌株攜帶pTrc99A-aroGED質(zhì)粒；YGEDB—E. coli SHIKΔaroLΔydiB菌株攜帶pTrc99A-aroGEDB質(zhì)粒 圖4 E. coli SHIKΔaroLΔydiB菌株表達(dá)重組質(zhì)粒的發(fā)酵結(jié)果 Fig.4 Fermentation results of E. coli SHIKΔaroLΔydiB strains express the recombinant plasmids

從生物量來看，質(zhì)粒負(fù)擔(dān)對(duì)菌體的影響并不大，各菌株生長情況沒有明顯差異.在莽草酸積累方面，產(chǎn)量隨著過表達(dá)基因數(shù)目的增加而增加，分別達(dá)到1.14，2.33，2.88，5.51 g/L.說明在阻斷支路代謝的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步強(qiáng)化莽草酸代謝途徑確實(shí)有利于莽草酸的積累.

3 結(jié) 論

根據(jù)代謝工程原理，初步構(gòu)建了L-莽草酸基因工程菌株，并具備一定的產(chǎn)酸能力.通過敲除莽草酸激酶編碼基因aroK，aroL與奎尼酸/莽草酸脫氫酶編碼基因ydiB，成功構(gòu)建重組菌株E.coliSHIKΔaroLΔydiB，一定程度上減少奎尼酸積累，但不能徹底解除奎尼酸的積累，菌體內(nèi)還存在其他酶能夠催化3-脫氫奎尼酸轉(zhuǎn)化成奎尼酸.筆者采用構(gòu)建人工操縱子的方式，對(duì)莽草酸合成途徑的4個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行組合，確定了最佳組合方案，證實(shí)強(qiáng)化莽草酸途徑代謝有助于莽草酸的積累.后續(xù)研究可嘗試進(jìn)一步對(duì)莽草酸途徑進(jìn)行強(qiáng)化，如穿插啟動(dòng)子進(jìn)行模塊化改造，避免操縱子結(jié)構(gòu)過長帶來的影響.

DAHP合成酶編碼基因無論是aroG還是aroF都可通過定點(diǎn)突變解除代謝反饋抑制，提高酶活.另外，將其他菌株的DAHP合成酶編碼基因進(jìn)行異源表達(dá)也是可行方案.

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Construction of genetic engineering strains for production of shikimic acid byEscherichiacoli

HAN Chao1,2, CAI Lingzhi1,2, MAO Qian1,2, LI Yanjun1,2, XIE Xixian1,2

(1.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China; 2.College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

Shikimic acid is an important intermediate for aromatic amino acids. It can be used as building block for the chemical synthesis of various drugs. In this study, a high-yield shikimic acid producing strain was constructed through metabolic engineering. The genesaroLandaroKencoding the shikimate kinase were knocked out to block the shikimic acid catabolism and the geneydiBencoding the quinic/shikimate dehydrogenase was deleted to reduce the synthesis of byproduct. ThearoG,aroE,aroDandaroBgenes encoding DAHP synthase, shikimic acid dehydrogenase, dehydroquinic acid dehydratase and dehydroquinic acid synthase were overexpressed with introduction of constructed operons, to strengthen the shikimic acid synthesis pathway. Finally, the obtainedE.coliSHIKΔaroLΔydiBengineering strain resulted in a yield of shikimic acid of 5.5 g/L by shake flask fermentation.

shikimate; shikimate kinase;Escherichiacoli;aroL;ydiB

2017-05-03

韓 超(1993—)，男，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向?yàn)橛霉劝彼岚魲U菌代謝改造莽草酸途徑，E-mail：871407470@qq.com.

Q78

A

1674-2214(2017)03-0143-04