尪痹片對關節(jié)炎小鼠骨髓RhoA和ROCK1的影響*

劉益臻，馬武開，何 康，梁 江，孫李萍，陳斌斌，付坤飛

(1.貴陽中醫(yī)學院藥學院,貴陽 550001；2.貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院風濕免疫科,貴陽 550003)

·經驗交流·

尪痹片對關節(jié)炎小鼠骨髓RhoA和ROCK1的影響*

劉益臻1，馬武開2，何 康1，梁 江2，孫李萍2，陳斌斌1，付坤飛1

(1.貴陽中醫(yī)學院藥學院,貴陽 550001；2.貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院風濕免疫科,貴陽 550003)

目的 探討尪痹片對關節(jié)炎小鼠骨髓細胞懸液RhoA、ROCK1的影響。方法 雄性昆明小鼠50只，隨機分為5組，即空白組、模型組、尪痹片組、仙靈骨葆組、甲氨蝶呤組，每組10只。構建小鼠佐劑關節(jié)炎模型，給藥28 d后取小鼠骨髓細胞懸液，檢測RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、RhoA、ROCK1蛋白的表達。結果 模型組的RhoA mRNA(1.96±0.02)、ROCK1 mRNA(2.22±0.01)、RhoA蛋白(0.36±0.02)、ROCK1 蛋白(0.61±0.02)均較空白組有明顯升高;尪痹片組的RhoA mRNA(0.68±0.02)、ROCK1 mRNA(1.21±0.03)均低于模型組和仙靈骨葆組，同時RhoA蛋白(0.66±0.03)、ROCK1 蛋白(1.18±0.03)表達均高于其他各組。結論 尪痹片抑制關節(jié)炎癥的機制可能與下調骨髓中某些細胞的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA相關，增加骨密度的機制可能與上調骨髓中某些細胞RhoA蛋白、ROCK1 蛋白相關。

關節(jié)炎；小鼠；骨髓；尪痹片；RhoA；ROCK1

類風濕關節(jié)炎(RA)的主要病理變化包括關節(jié)炎性細胞浸潤、滑膜增生、關節(jié)軟骨及骨組織破壞。尪痹片為中華中醫(yī)藥學會風濕病分會協定處方，臨床用于治療RA療效顯著，病理研究和臨床研究均表明該藥可減輕骨破壞程度,促進骨形成[1-2]，但其作用分子機制尚不十分明確。本研究旨在探討尪痹片阻止炎癥,促進骨形成的可能分子靶點。

骨形成的重要細胞為成骨細胞，骨髓間充質干細胞可分化為成骨細胞[3]，細胞骨架的改變與細胞的分化密切相關[4]，RhoA/ROCK信號通路在細胞分化調控中發(fā)揮重要作用,阻斷該信號通路，可以抑制骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化[5]。因此推測尪痹片可能通過影響骨髓中細胞的RhoA/ROCK信號通路來促進成骨細胞的生成，故初步選取RhoA、ROCK蛋白及其mRNA的表達探討這一假設。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 尪痹片(遼寧上藥好護士藥業(yè)集團有限公司，批號:160101),仙靈骨葆膠囊(貴州同濟堂制藥有限公司，批號：1505023)，甲氨蝶呤片(上海信宜藥廠有限公司，批號：036151101),一步法快速WB(HRP)試劑盒(康為世紀 鼠CW2030，兔CW2029)，高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒(康為世紀CW0049C)，蛋白膜印跡再生液(康為世紀 CW0056)，TRNzol總RNA提取試劑[天根生化科技(北京)有限公司，批號：DP405-02]，PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，批號：RR047B)，SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ (Tli RNaseH Plus),ROX plus(TaKaRa，批號：RR82LR)，DL2 000 DNA Marker(TaKaRa，批號：3427Q)，康為世紀SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(CW0022)，弗氏完全佐劑(Sigma,批號：1001646446)。

1.2 動物及造模方法[6]清潔級雄性昆明小鼠50只，體質量(20±5)g，重慶騰鑫生物技術有限公司，許可證號：SCXK-(軍)2012-0011。動物飼養(yǎng)環(huán)境：貴陽中醫(yī)學院實驗中心動物實驗室。25 ℃恒溫條件下適應性飼養(yǎng)1周，自由取食、飲水。將50只小鼠隨機分為5組，即空白組、模型組、尪痹片組、仙靈骨葆組、甲氨蝶呤組，每組10只。將弗氏完全佐劑-蒸餾水體積比1∶1混合均勻并充分乳化后，用微量注射器于模型組、尪痹片組、仙靈骨葆膠囊組，甲氨蝶呤組小鼠右后足跖內注射0.02 mL。空白組小鼠右后足跖內注射等劑量生理鹽水。

1.3 儀器 164-5050電泳儀(BIO-RAD)，Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System蛋白電泳槽(BIO-RAD)，Mini Trans-Blot 蛋白轉印系統(tǒng)(BIO-RAD)，TY-80脫色搖床(江蘇金壇)，ZS-2板式酶標儀(北京新風機電),202-2AB電熱恒溫箱(天津泰斯特),TGL-20M臺式高速冷凍離心機(湘儀貝克)，QL-902渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，Centrifuge 5415D離心機(Eppendorf)，NANODROP 2000分光光度計(Therno scientific)，Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.4 分組及給藥 將小鼠采用隨機數字表法隨機分為5組。按照文獻造模7 d后開始灌胃給藥，劑量為以上藥物的人臨床等效劑量的3倍，尪痹片組(120 mg/kg，1次/天)，仙靈骨葆膠囊組(90 mg/kg，1次/天)，甲氨蝶呤組(0.6 mg/kg，1次/周)，藥物均用生理鹽水稀釋后給予灌胃，空白組和模型組均給予相同體積的蒸餾水。給藥28 d后取材。

1.5 檢測指標及方法 頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡2～3 min，分離小鼠兩側股骨和脛骨及其所附肌肉，將分離好的股骨和脛骨放到一個裝有3～4 mL生理鹽水的培養(yǎng)皿中。將股骨和脛骨分別從中間剪斷(或者兩端剪掉)，露出骨髓腔，用1 mL注射器吸入生理鹽水反復沖洗骨髓腔，將沖洗后的細胞懸液移到離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，-80 ℃冰箱保存。

1.5.1 實時定量PCR方法檢測各組小鼠骨髓細胞中的RhoA、ROCK1的mRNA表達 采用TRNzol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取，紫外吸收測定法檢測RNA的濃度和純度，然后逆轉錄合成cDNA，GenBank中查找到小鼠 GAPDH 內參和RhoA、ROCK1的mRNA序列。引物由北京Invitrogen公司設計并合成(表1) 。PCR 按照試劑盒說明書進行操作，各樣品的目的基因和內參分別進行Realtime PCR反應，每個樣本檢測3個復孔。數據采用2-△△CT法進行分析。

1.5.2 Western blot法檢測各組小鼠骨髓細胞懸液中RhoA、ROCK1蛋白的表達 取5組小鼠鼠骨髓細胞，進行組織低溫勻漿、裂解，提取總蛋白，用BCA法粗略測定蛋白濃度后，然后轉移至 PVDF 膜上，加5%脫脂奶粉封閉液，室溫下平搖 1 h;洗膜，加一抗稀釋液，4 ℃ 過夜孵育;洗膜， 加二抗稀釋液室溫孵育 1 h，洗膜后，進行化學發(fā)光反應。曝光、顯影、定影，最后對結果進行光密度掃描分析。

表1 引物序列

2 結 果

2.1 各組骨髓組織RhoA mRNA、ROCK1 mRNA比較 與空白組比較，模型組的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA有明顯升高(P<0.01)，分別為空白組的1.96倍和2.22倍；與模型組比較，各組ROCK1 mRNA均有明顯降低(P<0.01)，其中以尪痹片組降低最為明顯；與模型組比較，各組RhoA mRNA均有明顯降低(P<0.01)，其中以甲氨蝶呤組最為明顯；尪痹片組與仙靈骨葆組相比，RhoA mRNA、ROCK1 mRNA差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，尪痹片組與甲氨蝶呤組相比，ROCK1 mRNA的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 各組骨髓細胞懸液RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表達比較

設空白組RhoA mRNA和ROCK1 mRNA表達均為1；a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c：P<0.01，與甲氨蝶呤組比較；d：P<0.01，與仙靈骨葆組比較

表3 各組骨髓細胞懸液的RhoA 、ROCK1蛋白表達比較

a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c：P<0.01，與甲氨蝶呤組比較；d：P<0.01，與仙靈骨葆組比較

2.2 各組骨髓細胞懸液RhoA、ROCK1蛋白比較 與空白組比較，模型組的RhoA、ROCK1蛋白有明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與模型組比較，僅有尪痹片組的ROCK1蛋白有明顯升高(P<0.01)，尪痹片組和仙靈骨葆組的RhoA蛋白均有明顯升高(P<0.01)。尪痹片組與仙靈骨葆組相比，RhoA、ROCK1蛋白差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，尪痹片組與甲氨蝶呤組相比，RhoA、ROCK1蛋白的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3和圖1。

A：空白組；B：模型組；C：仙靈骨葆組；D：甲氨蝶呤組；E：尪痹片組

圖1 各組RhoA 、ROCK1蛋白灰度值比較

3 討 論

研究表明RA患者的骨髓細胞存在異常，如活動性RA患者的骨髓間充質干細胞(BMSCs)出現分化發(fā)育能力下降和凋亡加速[7-8]，BMSCs向成骨分化中細胞骨架系統(tǒng)將發(fā)生改變[9-10];有研究直接證明了細胞骨架張力和RhoA的表達能主導BMSCs的分化[11-12]。RhoA對干細胞的自我更新和成骨發(fā)育也起著“開關”作用，RhoA/ROCK信號通路被稱為肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)器，活化的RhoA依次與效應蛋白分子(ROCK1/2、mDia、PRK1 2、citron激酶)等結合，從而開啟下游的信號通路[13]。然而，大量研究顯示，RhoA/ROCK通路不僅對不同細胞發(fā)揮著不盡相同的調節(jié)能力，甚至在同一細胞的不同生理病理狀態(tài)下亦有不同的表達形式和功能，RhoA的表達和ROCK的表達存在著不平行現象[14]，這種重要性和異質性使得研究該通路具有非常重要的意義甚至帶有一定的趣味性。

有關尪痹片臨床療效的研究較多[2]，但是對其療效作用分子機制的研究尚處于起步階段。綜上所述，推測尪痹片療效的深層分子機制很有可能在于調節(jié)骨髓中的RhoA/ROCK通路。甲氨蝶呤作為RA的基石用藥，小劑量亦發(fā)生骨髓抑制[15]；仙靈骨葆膠囊在“腎主骨生髓”的理論基礎和“補肝腎”的治法上與尪痹片相似，某些藥物相同，如淫羊藿、續(xù)斷、知母、地黃。那么這些藥物是否都能影響關節(jié)炎小鼠骨髓細胞的RhoA/ROCK通路呢？

在這些問題的指引下，對這幾種藥物進行了初步研究,觀察是否能對RhoA、ROCK1 產生影響。本實驗結果顯示，模型組的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、RhoA蛋白、ROCK1 蛋白均較空白組有明顯升高，但是3個給藥組的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA均較模型組低，給藥組中仙靈骨葆組的表達量較其他兩組高。從RhoA蛋白、ROCK1 蛋白表達來看，尪痹片組的表達較其他各組高，甲氨蝶呤組組與模型組的表達沒有差異(P>0.05);仙靈骨葆組的RhoA蛋白表達較模型組低(P<0.01)，但是ROCK1蛋白與模型組沒有差異(P>0.05)。以上結果表明，在關節(jié)炎癥狀態(tài)下，關節(jié)炎小鼠的骨髓細胞的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA會發(fā)生高表達，在藥物的干預下，RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表達均降低，提示這兩個分子在關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，眾所周知，甲氨蝶呤和尪痹片在抑制關節(jié)炎癥方面療效顯著，本研究中甲氨蝶呤和尪痹片可顯著降低RhoA mRNA、ROCK1 mRNA，推測骨髓中某種細胞的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA可能參與了關節(jié)炎癥的某些信號通路。

從RhoA蛋白、ROCK1 蛋白的表達來看，其表達與mRNA的表達不平行，尪痹片對RhoA蛋白、ROCK1 蛋白的表達較其他組顯著升高。RA主要為炎癥性關節(jié)病，但是又以伴發(fā)骨代謝異常骨質疏松癥為特點，表現為關節(jié)周圍骨丟失及骨侵蝕、全身性骨質疏松癥,患者的骨折風險明顯增加[16]。骨質疏松的原因之一在于骨生成不足[17]。有報道稱尪痹片可以增加RA患者的骨密度以及骨鈣素、血清Ⅰ型膠原交聯 C 末端肽等血清成骨標志物。甲氨蝶呤并不能阻止骨質疏松的發(fā)生[18]，推測骨髓中某些細胞的RhoA蛋白、ROCK1 蛋白可能在關節(jié)炎小鼠的骨形成中起一定的作用。尪痹片很有可能通過上調骨髓中某些細胞的RhoA蛋白、ROCK1 蛋白來起到促進骨形成的作用。此外，尪痹片與仙靈骨葆膠囊雖然在立方依據、功效及藥物上有相似之處，但是在對ROCK1和RhoA的影響方面有較大區(qū)別，因而兩種藥物在治療關節(jié)炎方面的分子機制不同，還應進一步研究。

綜上所述，骨髓中具有不同類型的細胞，關節(jié)炎小鼠的不同骨髓細胞的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA、RhoA蛋白、ROCK1 蛋白在關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中的作用可能不相同，尪痹片抑制關節(jié)炎癥的機制可能與下調骨髓中某些細胞的RhoA mRNA、ROCK1 mRNA相關，增加骨密度的機制可能與上調骨髓中某些細胞RhoA蛋白、ROCK1 蛋白相關。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.22.033

貴州省科學技術廳課題(黔科合J字[2015]2024)。 作者簡介:劉益臻(1981-)，副教授,博士，主要從事中醫(yī)及民族醫(yī)藥治療風濕病的臨床及實驗研究。

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1671-8348(2017)22-3125-03

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2017-04-16)