外源性心鈉素對小鼠過敏性哮喘氣道炎癥的影響及其機制分析*

劉振寬，邢曉莉，李 娜

(天津市第五中心醫(yī)院呼吸內科 300450)

論著·基礎研究

外源性心鈉素對小鼠過敏性哮喘氣道炎癥的影響及其機制分析*

劉振寬，邢曉莉，李 娜

(天津市第五中心醫(yī)院呼吸內科 300450)

目的 探討外源性心鈉素對過敏性哮喘小鼠模型氣道炎癥的影響作用及其作用機制。方法 選取SPF級BALBc小鼠48只，采用隨機數(shù)字表法分為對照組(等量生理鹽水干預)、模型組(等量生理鹽水干預)、實驗組A(外源性心鈉素0.5 μg/g)、實驗組B(外源性心鈉素0.5 μg/g+A71915)。模型組、實驗組A、實驗組B建模成功后給予對應處理措施，在最后一次激發(fā)實驗后24 h，采集各組血清、支氣管肺泡灌洗液檢查炎癥因子，采用HE染色觀察肺組織病理變化，采用Western blot技術檢測肺組織中鋅指轉錄因子(GATA3)蛋白的表達水平。結果 模型組小鼠的血液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞所占比例均高于對照組(P<0.05)，實驗組A的血液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞所占比例均高于模型組、實驗組B(P<0.05)；模型組小鼠的肺泡灌洗液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞計數(shù)、IL-6、TNF-α水平均高于對照組(P<0.05)，實驗組A的肺泡灌洗液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞計數(shù)、IL-6、TNF-α水平均高于模型組、實驗組B(P<0.05)；模型組小鼠的肺組織中GATA3蛋白表達水平均高于對照組(P<0.05)，實驗組A肺組織中GATA3蛋白表達水平高于模型組、實驗組B(P<0.05)。結論 外源性心鈉素會進一步加劇過敏性哮喘小鼠模型的氣道炎癥反應，與激活炎性細胞、炎癥因子釋放及增強肺組織中GATA3蛋白表達有關。

心鈉素；哮喘；小鼠；外源性；氣道炎癥；作用機制

過敏性哮喘是一種常見的慢性氣道疾病，具有持續(xù)存在的氣道炎癥和氣道高反應性等特征，多由嗜酸粒細胞、T 淋巴細胞、中性粒細胞、肥大細胞、氣道上皮細胞等以及各種細胞組共同參與，但其作用機制仍不完全清楚[1-2]。有研究表明，心鈉素在肺臟免疫及炎癥反應的調節(jié)過程發(fā)揮著重要作用，進而參與了過敏性哮喘的發(fā)生和發(fā)展過程，但具體作用機制并不明確[3-4]。為此，本研究建立了過敏性哮喘小鼠模型，并分別給予外源性心鈉素0.5 μg/g和等量生理鹽水進行干預，檢測了各組小鼠炎癥因子水平及肺組織中鋅指轉錄因子(GATA3)蛋白表達情況，并觀察了小鼠肺組織病理變化，進一步探討了外源性心鈉素對過敏性哮喘小鼠模型氣道炎癥的影響作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

A：對照組；B：模型組；C：實驗組A；D：實驗組B

圖1 HE染色觀察各組小鼠的肺組織情況(HE染色，×200)

1.1.1 實驗動物 選取48只SPF級BALBc小鼠，平均體質量(20.0±1.8)g，6～8周齡，購買自南京建成科技有限公司，動物許可證號(SCXK)2014-005，所有動物喂養(yǎng)于光照12 h，室溫23～25 ℃，相對濕度45%～60%的實驗環(huán)境中。

1.1.2 藥品與儀器 卵清蛋白(OVA)溶液、小鼠心鈉素、小鼠心鈉素受體拮抗劑(A71915)均購自美國Sigma公司，小鼠GATA3抗體購自美國 Proteintech公司；白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及心鈉素檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司。酶標儀購自德國拜發(fā)儀器公司，型號為880；顯微鏡購自日本奧林巴斯生產，高速離心機購自德國IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法 將48只SPF級BALBc小鼠隨機分作4組，即對照組、模型組、實驗組A和實驗組B，每組各12只小鼠，其中模型組、實驗組A和實驗組B建立過敏性哮喘模型，方法如下：第0、12天分別腹腔注射OVA溶液，劑量為每只0.1 mL，并于第18～25天連續(xù)霧化吸入濃度為5%的OVA溶液進行激發(fā)，每次霧化20 min。對照組以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替OVA溶液進行處理，其他與模型組相同。記錄各組小鼠的反應情況，若出現(xiàn)精神異常(煩躁不安、易驚或精神萎靡、反應遲鈍)、口唇發(fā)紺、呼吸急促或呼吸困難伴腹肌抽搐、大小便失禁等任何一種情況則表示造模成功。實驗組A小鼠在每次霧化刺激前30 min經鼻滴入心鈉素溶液(0.5 μg/g)，其余操作不變；而實驗組B小鼠在經鼻滴入心鈉素溶液之前30 min經腹腔注射A71915(0.5 μg/g)，其他操作與實驗組A小鼠相同，模型組和對照組僅給予等量生理鹽水進行干預。所有小鼠均在最后一次霧化激發(fā)實驗24 h后進行肺功能檢測，并收集支氣管肺泡灌洗液和眼眶血約5 mL。

1.2.2 HE染色 將小鼠脫頸處死后取小鼠肺組織，以4% 中性甲醛溶液固定后作連續(xù)切片，HE 染色后進行病理檢測。

1.2.3 Western blot技術 取部分小鼠肺組織制備蛋白樣，并取約75 μg以10% SDS-PAGE進行電泳，分離后轉移至孔徑為 0.45 μm 的PVDF 膜，置于5% 脫脂奶粉中封閉2 h；隨后加入一抗后 4 ℃孵育過夜，以0.5% TBS-T 溶液洗膜 3 次后再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗進行反應，再以0.5% TBS-T 溶液洗膜 3 次后用化學發(fā)光底物試劑(Cell Signaling，Beverly，MA) 進行孵育，最后利用X 射線片顯出條帶，并采用軟件進行吸光度值分析，計算GATA3蛋白β-actin的吸光度比值。

1.2.4 血液細胞學及肺泡灌洗液細胞學檢查方法 檢測并比較血液中嗜酸性粒細胞(EOS)、淋巴細胞、中性粒細胞；檢測并比較各組肺泡灌洗液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞、IL-6、TNF-α。分別取 20 μL 灌洗液和血液與0.38 mL EOS 計數(shù)液混勻后在光學顯微鏡進行 EOS 計數(shù)。取灌洗液以1 000 r/min離心10 min后收集上清液，沉淀物涂片后固定，瑞姬染液染色后在顯微鏡下讀取200 個白細胞，分別統(tǒng)計各類白細胞個數(shù)并計算各類白細胞所占百分比；上清液利用酶標儀采用酶聯(lián)免疫吸附法測定IL-6和TNF-α水平，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。取少量血液涂片后固定，瑞姬氏染液染色后在顯微鏡下讀取200 個白細胞，分別統(tǒng)計各類白細胞個數(shù)并計算各類白細胞所占百分比。

2 結 果

2.1 病理學觀察 對照組小鼠支氣管、肺泡結構清楚，未見炎癥細胞浸潤(圖1A)；模型組可見支氣管黏膜充血水腫比較明顯，周圍組織間隙充滿脫落的上皮細胞、大量的炎癥細胞浸潤在支氣管組織周圍(圖1B)；實驗組A炎癥反應程度較模型組更加嚴重(圖1C)，實驗組B炎癥反應程度較實驗組A有所減輕(圖1D)。

2.2 各組小鼠血液炎癥細胞學檢查水平比較 模型組小鼠的血液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞所占比例均高于對照組(P<0.05)；實驗組A的血液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞所占比例均高于模型組、實驗組B(P<0.05)；實驗組B血液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞所占比例與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組小鼠血液炎癥細胞學檢查水平比較，%)

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組和實驗組B比較。血液白細胞分類因為比較少，用百分比方便統(tǒng)計

2.3 各組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞、細胞因子水平比較 模型組小鼠的肺泡灌洗液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞計數(shù)、IL-6、TNF-α水平均高于對照組(P<0.05)；實驗組A的肺泡灌洗液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞計數(shù)、IL-6、TNF-α水平均高于模型組、實驗組B(P<0.05)；實驗組B肺泡灌洗液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞計數(shù)、IL-6、TNF-α水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液中炎癥細胞、細胞因子水平比較±s)

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組和實驗組B比較。灌洗液IL-6、TNF-α必須用計量單位表示，為單位一致，白細胞分類也用計量單位表示

2.4 各組小鼠肺組織中GATA3蛋白表達水平比較 模型組小鼠的肺組織中GATA3蛋白表達水平(0.422±0.115)均高于對照組(0.241±0.095)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；實驗組A肺組織中GATA3蛋白表達水平(0.609±0.146)高于模型組、實驗組B(0.431±0.097)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，實驗組B肺組織中GATA3蛋白表達水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，各組間GATA3蛋白水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=51.209，P<0.01)，見圖2。

1:對照組；2:模型組；3:實驗組A；4:實驗組B

圖2 Western blot檢測結果

3 討 論

過敏性哮喘是一種常見的頑固性慢性呼吸道疾病，多是由反復的呼吸道感染后吸入花粉、動物毛發(fā)等過敏原，或是食用引起過敏的食物或藥物后誘發(fā)，具有氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑等特征[5-7]。研究表明，氣道炎癥是導致氣道高反應性和氣道重塑的基礎，而多種炎性細胞特別是EOS、肥大細胞和T淋巴細胞的浸潤與氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展有著密切關系，但是對于過敏性哮喘的具體發(fā)病機制目前仍不完全清楚[8-9]。

心鈉素又稱心房利鈉肽，是由心房肌細胞合成并釋放的肽類激素，主要由28個氨基酸殘基組成，其受體是細胞膜上的一種鳥甘酸環(huán)化酶[10-11]。心鈉素是一種血管活性肽，其主要作用是使血管平滑肌舒張和促進腎臟排鈉、排水，并且能調節(jié)細胞增殖和縮血管作用[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，心鈉素信號在呼吸系統(tǒng)中也廣泛分布，并且發(fā)揮著重要的調節(jié)作用，如影響肺表面活性物質的產生和功能等[13]。也有研究表明，哮喘患者血漿中的心鈉素水平較緩解期明顯升高，但其與哮喘發(fā)病和發(fā)展的關系及具體機制目前尚不清楚[14]。為此，本研究建立了過敏性哮喘小鼠模型，并分別給予外源性心鈉素0.5 μg/g、外源性心鈉素0.5 μg/g+A71915、等量生理鹽水進行干預。研究發(fā)現(xiàn)，實驗組A小鼠的炎癥反應較模型組更為嚴重，而實驗組B小鼠在添加外源性心鈉素拮抗劑后炎癥反應明顯較實驗組A較輕，提示外源性心鈉素與過敏性哮喘的發(fā)病和發(fā)展有著密切關系。

進一步觀察發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的血液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞所占比例均高于對照組，而實驗組A的血液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞所占比例均高于模型組、實驗組B。提示心鈉素能激活過敏性哮喘小鼠血液中炎癥細胞，且能提高淋巴細胞的中性粒細胞的比例，進而促進炎癥反應的發(fā)展。模型組小鼠的肺泡灌洗液中EOS、淋巴細胞、中性粒細胞計數(shù)、IL-6、TNF-α水平均高于對照組，而實驗組A的肺泡灌洗液中各項水平均高于模型組、實驗組B，提示心鈉素能激活過敏性哮喘小鼠肺組織中炎癥細胞，且能提高淋巴細胞的中性粒細胞的比例，進而促進炎癥反應的發(fā)展，其機制可能是提升IL-6、TNF-α等促炎癥因子的水平。

有研究表明，特異性轉錄因子GATA3的表達與Th2細胞分化及功能成熟有著密切關系，其能促進局部IL-4細胞因子的合成分泌，并能形成有利于Th2細胞分化和成熟的微環(huán)境[15]。GATA3還能調節(jié)IL-5、IL-13等過敏相關性細胞因子的表達，并能誘導導嗜酸細胞在氣道的趨化浸潤，從而參與過敏性氣道炎癥反應的調節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的肺組織中GATA3蛋白表達水平均高于對照組，而實驗組A肺組織中GATA3蛋白表達水平高于模型組、實驗組B，提示心鈉素能促進肺組織中特異性轉錄因子 GATA3的表達，這可能也是心鈉素參與過敏性哮喘發(fā)生和發(fā)展的機制之一。

本研究通過對過敏性哮喘小鼠添加心鈉素干預后發(fā)現(xiàn)，心鈉素確實能通過提升炎癥細胞數(shù)量。促進GATA3的表達等機制來加劇過敏性氣道炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展，而通過調節(jié)心鈉素拮抗劑后可明顯減輕此類反應，這也許能為尋找過敏性哮喘的新靶點提供一定的依據。但本研究限于研究樣本的，對于心鈉素在哮喘治療中的潛能仍需作進一步的深入研究。

綜上所述，外源性心鈉素會進一步加劇過敏性哮喘小鼠模型的氣道炎癥反應，與激活炎性細胞、炎癥因子釋放及增強肺組織中GATA3蛋白表達有關。

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Effect of exogenous atrial natriuretic peptide on airway inflammation in mice with allergic asthma and its mechanism*

LiuZhenkuan,XingXiaoli,LiNa

(DepartmentofRespiration,TianjinMunicipalFifthCentralHospital,Tianjin300450,China)

Objective To investigate the effect of exogenous atrial natriuretic peptide on airway inflammation in allergic asthma mice model and its mechanism.Methods A total of 48 SPF 48 BALBc mice were selected and randomly divided into the normal group (equal quantity normal saline intervention),model group (equal quantity normal saline intervention),experimental group A (exogenous atrial natriuretic peptide 0.5 μg/g) and experimental group B(exogenous atrial natriuretic peptide 0.5 μg/g+A71915).The model group,experimental group A and B were given the corresponding treatment measures after successfully constructing the model,at 24 after the last provocation test,serum and bronchoalveolar lavage fluid in each group were collected for detecting inflammation factors.The HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue,the expression level of GATA3 protein in lung tissue was detected by Western blot technology.Results The blood EOS,lymphocyte and neutrophil ratio in the model group were higher than those in the normal group (P<0.05),which in the experimental group A were higher than those in the model group and experimental group B (P<0.05);bronchoalveolar lavage fluid EOS,lymphocytes,neutrophil ratio,IL-6,TNF-α levels in the model group were higher than those in the normal group (P<0.05),alveolar lavage fluid EOS,lymphocyte,neutrophil count,IL-6 and TNF-α levels in the experimental group A were higher than those in the model group and experimental group B (P<0.05);the expression level of GATA3 protein in lung tissue of the model group was higher than that in the normal group(P<0.05),the expression level of lung tissue GATA3 protein in the experimental group A was higher than that in the model group and experimental group B (P<0.05).Conclusion Exogenous atrial natriuretic peptide can further aggravate airway inflammation reaction in allergic asthma mice model,which is related to the activation of inflammatory cells,the release of inflammatory cytokines and the increase of GATA3 protein expression in lung tissue.

atrial natriuretic factor;asthma;mice;exogenous;airway inflammation;action mechanism

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.22.004

天津市衛(wèi)生局資助基金項目(tj20150823)。 作者簡介：劉振寬(1976-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事過敏性哮喘的研究。

R361+.2

A

1671-8348(2017)22-3036-03

2017-01-10

2017-03-20)