三氧化二砷通過(guò)Akt信號(hào)通路抑制HGC-27細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡

張順同，孟 宇，寧怡蒙，宋 敏

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南鄭州450052

三氧化二砷通過(guò)Akt信號(hào)通路抑制HGC-27細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡

張順同，孟 宇，寧怡蒙，宋 敏

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南鄭州450052

目的 探討三氧化二砷對(duì)HGC-27細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法 用1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L的三氧化二砷作用于胃癌細(xì)胞HGC-27、MKM28、SGC7901，同時(shí)以只加入二甲基亞砜(DMSO)溶液的細(xì)胞作為對(duì)照組，噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，篩選出受到抑制作用最大的細(xì)胞繼續(xù)研究，并計(jì)算三氧化二砷半數(shù)抑制濃度。用三氧化二砷半數(shù)抑制濃度作用于人胃癌細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表達(dá)水平。用50 ng/ml的Akt信號(hào)通路激活劑胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)及半數(shù)抑制濃度的三氧化二砷聯(lián)合作用于人胃癌細(xì)胞作為聯(lián)合組，以半數(shù)抑制濃度的三氧化二砷作用組作為對(duì)照，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Western blotting檢測(cè)Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表達(dá)水平。結(jié)果 1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L 的三氧化二砷能夠抑制胃癌細(xì)胞 HGC-27、MKM28、SGC7901 的生長(zhǎng)，抑制作用從強(qiáng)到弱依次為:HGC-27、MKM28、SGC7901，半數(shù)抑制濃度依次為:(9.34±1.57)μmol/L、(12.92±1.08)μmol/L、(13.24±1.34)μmol/L，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用9 μmol/L的三氧化二砷作用于HGC-27細(xì)胞。9 μmol/L的三氧化二砷作用后細(xì)胞凋亡率從(6.35±2.14)% 提高到(39.32±6.54)%，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3升高，p-Akt水平降低。聯(lián)合組細(xì)胞較單用三氧化二砷組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3水平降低，p-Akt水平升高。結(jié)論 三氧化二砷能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，激活A(yù)kt信號(hào)通路能夠部分逆轉(zhuǎn)三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

三氧化二砷;胃癌;凋亡;Akt信號(hào)通路

胃癌的發(fā)病率在全部惡性腫瘤中位居第2位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)，胃癌的死亡率在全部惡性腫瘤中位居第2位，發(fā)病率在全部惡性腫瘤中位居第3位［1］。胃癌發(fā)病隱匿、早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時(shí)一般已經(jīng)是胃癌晚期。據(jù)統(tǒng)計(jì)，胃癌5年內(nèi)的生存率只有30%［2］。目前常用的治療胃癌的方法為手術(shù)治療，但是手術(shù)治療已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足人們的需求，尋找有效的治療方法是目前急需解決的問(wèn)題。

三氧化二砷是一種提取至砒霜中的有效成分，其最初被用于治療急性早幼粒細(xì)胞型白血病，隨著不斷的深入研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)也具有一定的抑制作用，并且能夠通過(guò)抑制實(shí)體瘤細(xì)胞增殖進(jìn)而抑制其體外裸鼠成瘤的能力［3-5］。蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，而三氧化二砷是否通過(guò)作用于Akt信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，本研究中首先探討三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的作用，進(jìn)一步運(yùn)用Akt信號(hào)通路激活劑胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)作用于胃癌細(xì)胞，研究三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制是否與Akt信號(hào)通路有關(guān)，以期為胃癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 胃癌細(xì)胞 HGC-27、MKM28、SGC7901均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要儀器及試劑 青霉素、鏈霉素、RPMI 1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Hyclone;新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide，DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma;Cleaved Caspase-3單克隆抗體、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)單克隆抗體、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó) CTS;NorapathTM酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自日本BID-KAD;CKX41倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus;FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞 HGC-27、MKM28、SGC7901細(xì)胞培養(yǎng)參照參考文獻(xiàn)［6］，細(xì)胞培養(yǎng)液均采用含有青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml、100 g/L新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，飽和濕度，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱，觀察細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，用含2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞1 min，1 000 r/min離心10 min后，以1∶3的比例接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每隔2～3 d進(jìn)行1次傳代。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 觀察人胃癌細(xì)胞HGC-27、MKM28、SGC7901培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用含有2.5 g/L的胰蛋白酶消化細(xì)胞后，以每孔中加入5×104個(gè)細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100 μl的細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)過(guò)夜。棄上清液，加入含有三氧化二砷濃度為 1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組中只加入等量的DMSO溶液，以不加細(xì)胞組為空白組。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μl的含有噻唑藍(lán)(methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT)濃度為5 g/L的溶液，放在37℃反應(yīng)4 h，吸除上清液，加入DMSO溶液150 μl，震蕩反應(yīng)10 min，觀察結(jié)晶物完全融化后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處檢測(cè)每孔的吸光度值，分析細(xì)胞增殖情況。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將胃癌細(xì)胞HGC-27以1×105ml-1接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2 ml的細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)過(guò)夜后，更換為含有三氧化二砷半數(shù)抑制濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃室溫培養(yǎng)48 h后，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline，PBS)懸浮細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，收集1 ml的細(xì)胞懸浮液，加入400 μl的緩沖液混合后，依次加入5 μl碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)和膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)混合后，在避光、室溫條件下反應(yīng)20 min，加入200 μl的緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表達(dá)水平 胃癌細(xì)胞HGC-27經(jīng)三氧化二砷半數(shù)抑制濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液作用48 h后，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，加入裂解液，按照細(xì)胞蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞中的總蛋白，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量檢測(cè)。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液充分混合，混合比例為4∶1，在100℃的水浴鍋中煮沸5 min，使蛋白樣品變性。在凝膠上樣孔中每孔加入50 μl的變性蛋白樣品，電泳初始電壓為80 V，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，把電壓調(diào)整到120 V直至電泳結(jié)束。蛋白凝膠在100 V電壓，4℃轉(zhuǎn)膜90 min，用50 g/L脫脂奶粉在37℃封閉90 min后，依次與一抗(600倍稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜)和二抗(1 200倍稀釋?zhuān)?7℃孵育90 min)結(jié)合后，滴加顯色液，放置于暗室中顯影，分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 Akt信號(hào)通路激活劑對(duì)細(xì)胞增殖影響 檢測(cè)含有三氧化二砷半數(shù)抑制濃度和50 ng/ml的IGF的細(xì)胞培養(yǎng)液作用于胃癌細(xì)胞HGC-27作為聯(lián)合組，同時(shí)以半數(shù)抑制濃度的三氧化二砷作用于胃癌細(xì)胞HGC-27作為對(duì)照，培養(yǎng)48 h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Western blotting檢測(cè)細(xì)胞中 Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表達(dá)水平，步驟參照1.4、1.5、1.6。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果 如表1所示，人胃癌細(xì)胞HGC-27、MKM28、SGC7901 經(jīng) 1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L 的三氧化二砷作用后細(xì)胞增殖能力下降，計(jì)算三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞HGC-27、MKM28、SGC7901的半數(shù)抑制濃度依次為:(9.34 ±1.57)μmol/L、(12.92 ±1.08)μmol/L、(13.24±1.34)μmol/L。三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞抑生長(zhǎng)作用由強(qiáng)到弱依次為:HGC-27、MKM28、SGC7901。后續(xù)研究中選用受到抑制作用最強(qiáng)的HGC-27細(xì)胞繼續(xù)研究，三氧化二砷濃度選用半數(shù)抑制濃度9 μmol/L繼續(xù)研究。

表1 三氧化二砷作用48 h后的胃癌細(xì)胞吸光度值Tab 1 Absorbance of gastric cancer cells after arsenic trioxide for 48 hours

2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞HGC-27凋亡的影響，結(jié)果如圖1所示，對(duì)照組和三氧化二砷組細(xì)胞凋亡率分別為(6.35±2.14)%、(39.32±6.54)%。提示三氧化二砷能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

2.3 細(xì)胞中 Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 如圖2所示，三氧化二砷作用后的胃癌細(xì)胞HGC-27中Cleaved Caspase-3水平升高，p-Akt水平降低，Akt水平無(wú)顯著性變化。以GAPDH為內(nèi)參，統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和三氧化二砷組中Cleaved Caspase-3水平依次為0.15±0.02、0.86±0.21，p-Akt表達(dá)水平依次為:0.23±0.03、0.08±0.04，Akt水平依次為:0.94 ±0.06、0.95 ±0.05。提示三氧化二砷能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞Cleaved Caspase-3的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞中p-Akt表達(dá)水平。

圖1 三氧化二砷對(duì)細(xì)胞凋亡影響結(jié)果Fig 1 Effects of arsenic trioxide on apoptosis

圖2 三氧化二砷對(duì)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表達(dá)影響結(jié)果Fig 2 Effect of arsenic trioxide on expressions of Cleaved Caspase-3，Akt and p-Akt in cells

2.4 激活A(yù)kt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖的影響 用三氧化二砷和Akt信號(hào)通路激活劑共同作用于胃癌細(xì)胞HGC-27，檢測(cè)細(xì)胞中Akt磷酸化水平，如圖3、表2所示，以單用三氧化二砷作用組作為對(duì)照，三氧化二砷和Akt信號(hào)通路激活劑聯(lián)合作用后的細(xì)胞中Akt磷酸化水平升高。檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，如表2所示，以單獨(dú)用三氧化二砷作用組作為對(duì)照，三氧化二砷和Akt信號(hào)通路激活劑聯(lián)合作用后的細(xì)胞A值升高，說(shuō)明Akt信號(hào)通路激活劑能夠部分拮抗三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

2.5 激活A(yù)kt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 進(jìn)一步檢測(cè)三氧化二砷及Akt信號(hào)通路激活劑聯(lián)合作用后的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖4、表3所示，加入Akt信號(hào)通路激活劑后的胃癌細(xì)胞凋亡率從(45.21±3.64)%降低至(34.62±4.39)%。如圖5、表3所示，加入Akt信號(hào)通路激活劑后的胃癌細(xì)胞中Cleaved Caspase-3表達(dá)水平從1.05±0.09降低至0.21±0.06。Akt信號(hào)通路激活劑能夠逆轉(zhuǎn)三氧化二砷誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡。

圖3 Akt信號(hào)通路激活劑對(duì)三氧化二砷誘導(dǎo)的Akt磷酸化水平降低的影響Fig 3 Effect of Akt signaling pathway activator on the level of Akt phosphorylation induced by arsenic trioxide

表2 Akt信號(hào)通路激活劑及三氧化二砷聯(lián)合作用48 h后細(xì)胞吸光度值及細(xì)胞中p-Akt、Akt表達(dá)水平(±s)Tab 2 Absorbance and p-Akt，Akt levels in the cells after the combined action of the signal pathway activator and arsenic trioxide for 48 hours(±s)

表2 Akt信號(hào)通路激活劑及三氧化二砷聯(lián)合作用48 h后細(xì)胞吸光度值及細(xì)胞中p-Akt、Akt表達(dá)水平(±s)Tab 2 Absorbance and p-Akt，Akt levels in the cells after the combined action of the signal pathway activator and arsenic trioxide for 48 hours(±s)

注:與三氧化二砷組比較，*P＜0.01。

組別 吸光度值 蛋白相對(duì)表達(dá)水平p-Akt Akt三氧化二砷組0.83±0.03 0.34±0.05 1.05±0.08聯(lián)合組 1.12±0.02* 0.78±0.06*1.07±0.03

圖4 激活A(yù)kt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡影響Fig 4 Activation of Akt signaling pathway on apoptosis

圖5 激活A(yù)kt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3表達(dá)影響Fig 5 Effect of activation of Akt signaling pathway on Cleaved Caspase-3 expression in cells

表3 Akt信號(hào)通路激活劑及三氧化二砷聯(lián)合作用48 h后細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中Cleaved Caspase-3表達(dá)水平(±s)Tab 3 The apoptosis rate and the expression level of Cleaved Caspase-3 in the cells after the combined action of the signal pathway activator and arsenic trioxide for 48 hours(±s)

表3 Akt信號(hào)通路激活劑及三氧化二砷聯(lián)合作用48 h后細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中Cleaved Caspase-3表達(dá)水平(±s)Tab 3 The apoptosis rate and the expression level of Cleaved Caspase-3 in the cells after the combined action of the signal pathway activator and arsenic trioxide for 48 hours(±s)

注:與三氧化二砷組比較，*P＜0.01。

組別 細(xì)胞凋亡率(%)蛋白相對(duì)表達(dá)水平三氧化二砷組45.21±3.64 1.02±0.09聯(lián)合組 34.62±4.39* 0.21±0.06*

3 討論

三氧化二砷是一種劇毒物質(zhì)，微量的三氧化二砷能夠?qū)е侣灾卸?，?yán)重的可以引發(fā)癌癥。最近的研究表明，極少量的三氧化二砷能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且三氧化二砷在體內(nèi)的代謝較快，在血漿內(nèi)幾乎沒(méi)有殘留［7］。三氧化二砷能夠抑制腫瘤細(xì)胞的DNA和RNA合成，阻礙細(xì)胞內(nèi)核酸物質(zhì)的代謝途徑，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制［8-10］。三氧化二砷能夠阻滯胃癌細(xì)胞SGC-7901的細(xì)胞周期，增加靜止期的細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而導(dǎo)致增殖期細(xì)胞數(shù)量減少，抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［11-14］。本研究中，選用了三種胃癌細(xì)胞株HGC-27、MKM28、SGC7901，用不同濃度為三氧化二砷作用于胃癌細(xì)胞，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷能夠降低胃癌細(xì)胞株HGC-27、MKM28、SGC7901的增殖能力，這與之前的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞HGC-27的抑生長(zhǎng)作用最為明顯，計(jì)算其半數(shù)抑制濃度為(9.34±1.57)μmol/L，后續(xù)研究中選用9 μmol/L的三氧化二砷作用于HGC-27細(xì)胞。

癌細(xì)胞凋亡是癌癥發(fā)生過(guò)程中的重要生物學(xué)現(xiàn)象，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡是癌癥治療的有效途徑之一［15］。癌細(xì)胞凋亡與Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)，Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的效應(yīng)因子，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行因子，Caspase-3活化后意味著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段［16］。之前的研究表明，三氧化二砷能夠通過(guò)作用于NF-κB促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡［17］。本研究中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞HGC-27凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，凋亡率從(6.35±2.14)%提高至(39.32±6.54)%，與之前的研究結(jié)果一致。本研究中還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷作用后的HGC-27細(xì)胞中Caspase-3活化增多。以上結(jié)果均提示，三氧化二砷能夠作用于Caspase-3的活化水平促進(jìn)胃癌細(xì)胞HGC-27的凋亡。

Akt信號(hào)通路是目前研究較多的與癌細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路［18］。已經(jīng)有研究［19］表明，Akt在肺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌等多種癌癥中異?；罨?，癌組織中Akt磷酸化水平升高。50 ng/ml的IGF能夠激活A(yù)kt信號(hào)通路，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［20］。本研究中，首先發(fā)現(xiàn)三氧化二砷作用后的胃癌細(xì)胞HGC-27中Akt磷酸化水平降低，用Akt信號(hào)通路激活劑IGF和三氧化二砷聯(lián)合作用于人胃癌細(xì)胞HGC-27后，與單用三氧化二砷作用后的胃癌細(xì)胞相比，增殖能力增強(qiáng)，凋亡數(shù)量減少。提示，激活A(yù)kt信號(hào)通路能夠部分逆轉(zhuǎn)三氧化二砷誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡增多和增殖能力減弱。

綜上所述，三氧化二砷能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞HGC-27凋亡，抑制胃癌細(xì)胞HGC-27增殖，而激活A(yù)kt信號(hào)通路能夠部分逆轉(zhuǎn)三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞增殖凋亡的影響。這為進(jìn)一步研究三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為治療胃癌提供了新的理論依據(jù)。

［1］Dixon M，Mahar AL，Helyer LK，et al.Prognostic factors in metastatic gastric cancer:results of a population-based，retrospective cohort study in Ontario［J］.Gastric Cancer，2016，19(1):150-159.

［2］邢立凱，王杰，張勇，等.華蟾素聯(lián)合化療治療中晚期胃腸道腫瘤的Meta分析［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2016，25(7):779-786.

Xin LK，Wang J，Zhang Y，et al.Cinobufacini combined with chemotherapy for advanced gastrointestinal cancer:a Meta-analysis［J］.Chin J Gastroenterol Hepatol，2016，25(7):779-786.

［3］Hoffman EA，Gizelska K，Mirowski M，et al.Arsenic trioxide downregulates cancer procoagulant activity in MCF-7 and WM-115 cell lines in vitro［J］.Contemp Oncol(Pozn)，2015，19(2):108-112.

［4］Lo-Coco F，Avvisati G，Vignetti M，et al.Retinoic acid and arsenic trioxide for acute promyelocytic leukemia［J］.N Engl J Med，2013，369(2):111-121.

［5］Chiu HW，Tseng YC，Hsu YH，et al.Arsenic trioxide induces programmed cell death through stimulation of ER stress and inhibition of the ubiquitin-proteasome system in human sarcoma cells［J］.Cancer Lett，2015，356(2):762-772.

［6］Kwon CH，Moon HJ，Park HJ，et al.S100A8 and S100A9 promotes invasion and migration through p38 mitogen-activated protein kinasedependent NF-κB activation in gastric cancer cells［J］.Mol Cells，2013，35(3):226-234.

［7］Karsy M，Albert L，Murali R，et al.The impact of arsenic trioxide and all-trans retinoic acid on p53 R273H-codon mutant glioblastoma ［J］.Tumour Biol，2014，35(5):4567-4580.

［8］Zheng C，Lam S，Li Y，et al.Combination of arsenic trioxide and chemotherapy in small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2013，82(2):222-230.

［9］Beauchamp EM，Kosciuczuk EM，Serrano R，et al.Direct binding of arsenic trioxide to AMPK and generation of inhibitory effects on acute myeloid leukemia precursors［J］.Mol Cancer Ther，2015，14(1):202-212.

［10］Nakaoka T，Ota A，Ono T，et al.Combined arsenic trioxide-cisplatin treatment enhances apoptosis in oral squamous cell carcinoma cells［J］.Cell Oncol(Dordr)，2014，37(2):119-129.

［11］Yu Y，Yang Y，Wang J.Anti-apoptotic and apoptotic pathway analysis of arsenic trioxideinduced apoptosis in human gastric cancer SGC-7901 cells［J］.Oncol Rep，2014，32(3):973-978.

［12］Chen Z，Zhang H，Yang L，et al.Construction of a metabolomics profile of arsenic trioxide effect in gastric carcinoma cell line SGC7901 ［J］.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)，2016，48(5):474-481.

［13］Wang B，Lin S，Shen Y，et al.Pure total flavonoids from Citrus paradisi Macfadyen act synergistically with arsenic trioxide in inducing apoptosis of Kasumi-1 leukemia cells in vitro ［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2015，16(7):580-585.

［14］Meister MT，Boedicker C，Graab U，et al.Arsenic trioxide induces Noxa-dependent apoptosis in rhabdomyosarcoma cells and synergizes with antimicrotubule drugs ［J］.Cancer Lett，2016，381(2):287-295.

［15］Aires V，Brassart B，Carlier A，et al.A role for peroxisome proliferator-activated receptor gamma in resveratrol-induced colon cancer cell apoptosis［J］.Mol Nutr Food Res，2014，58(9):1785-1794.

［16］Gao W，Xiao F，Wang X，et al.Artemisinin induces A549 cell apoptosis dominantly via a reactive oxygen species-mediated amplification activation loop among caspase-9，-8 and-3［J］.Apoptosis，2013，18(10):1201-1213.

［17］Manu KA，Shanmugam MK，Ramachandran L，et al.Isorhamnetin augments the anti-tumor effect of capeciatbine through the negative regulation of NF-κB signaling cascade in gastric cancer［J］.Cancer Lett，2015，363(1):28-36.

［18］楊大運(yùn)，邢亞威，張?jiān)禄ǎ?老年非小細(xì)胞肺癌中 Raf激酶抑制蛋白與p-AKT的表達(dá)及意義［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2016，36(3):644-645.

Yang DY，Xing YW，Zhang YH，et al.Expression and significance of Raf kinase inhibitor protein and p-AKT in elderly patients with non-small cell lung cancer［J］.Chin J Gerontol，2016，36(3):644-645.

［19］Gu H，Ji R，Zhang X，et al.Exosomes derived from human mesenchymal stem cells promote gastric cancer cell growth and migration via the activation of the Akt pathway［J］.Mol Med Rep，2016，14(4):3452-3458.

［20］Zhao X，Li X，Ren Q，et al.Calycosin induces apoptosis in colorectal cancer cells，through modulating the ERβ/MiR-95 and IGF-1R，PI3K/Akt signaling pathways［J］.Gene，2016，591(1):123-128.

(責(zé)任編輯:李 健)

Arsenic trioxide inhibits HGC-27 cell proliferation and promotes apoptosis through Akt signaling pathway

ZHANG Shuntong，MENG Yu，NING Yimeng，SONG Min
Department of Oncology，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

ObjectiveTo investigate the effect and its mechanism of arsenic trioxide on proliferation and apoptosis of HGC-27 cells.Methods1 μmol/L，2 μmol/L，4 μmol/L，8 μmol/L，16 μmol/L of arsenic trioxide were injected into gastric cancer cells HGC-27，MKM28，SGC7901，at the same time，only the DMSO solution was added to the control group.Cell proliferation was detected by MTT.The cells with the greatest influence were screened and the half inhibitory concentration was calculated.Half inhibitory concentration of arsenic trioxide was calculated.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.Western blotting was used to detect the levels of Cleaved Caspase-3，Akt and p-Akt in cells.The combination of 50 ng/ml Akt signal pathway activator IGF and half inhibitory concentration of arsenic trioxide on human gastric cancer cells were recorded as a combined group.Arsenic trioxide group with half inhibitory concentration was as control.Cell proliferation was detected by MTT.Apoptosis was detected by flow cytometry.Western blotting was used to detect the levels of Cleaved Caspase-3，Akt，p-Akt.Results1 μmol/L，2 μmol/L，4 μmol/L，8 μmol/L，16 μmol/L of arsenic trioxide could inhibit the growth of gastric cancer cells HGC-27，MKM28，SGC7901.The inhibitory effects from strong to weak were HGC-27，MKM28，SGC7901.The half inhibition concentrations were(9.34±1.57)μmol/L，(12.92±1.08) μmol/L，(13.24±1.34) μmol/L.The following experiments were conducted with 9 μmol/L arsenic trioxide on HGC-27 cells.The rate of apoptosis was increased from(6.35 ±2.14)%to(39.32 ±6.54)%by the action of arsenic trioxide at a dose of 9 μmol/L，Cleaved Caspase-3 was increased in cells，p-Akt level was decreased.The proliferation ability of the combined group was higher than that of arsenic trioxide group，cell apoptosis was decreased，the level of Cleaved Caspase-3 was decreased in cells，p-Akt level was increased.ConclusionArsenic trioxide can inhibit the proliferation of gastric cancer cells and promote the apoptosis of gastric cancer cells.The activation of Akt signaling pathway can partly reverse the effects of arsenic trioxide on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells.

Arsenic trioxide;Gastric cancer;Apoptosis;Akt signaling pathway

R735.2

A

1006-5709(2017)08-0910-05

2017-02-22

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.019

張順同，碩士研究生，研究方向:消化道腫瘤基礎(chǔ)與臨床。E-mail:doctor_z163@163.com

宋敏，教授，主任醫(yī)師，研究方向:消化道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床。E-mail:minsong2011@163.com