微流體裝置線性去除豬MII期卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)研究

周新麗 楊 云 戴建軍 張德福 邵文琪 衣星越 陶樂(lè)仁

1(上海理工大學(xué)生物熱科學(xué)研究所，上海 200093)2(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106)

微流體裝置線性去除豬MII期卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的實(shí)驗(yàn)研究

周新麗1*楊 云1戴建軍2張德福2邵文琪1衣星越1陶樂(lè)仁1

1(上海理工大學(xué)生物熱科學(xué)研究所，上海 200093)2(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106)

低溫保存后的卵母細(xì)胞在使用前必須要去除冷凍保護(hù)劑，目前常用的分步法去除步驟繁瑣，容易丟失細(xì)胞，而且會(huì)對(duì)細(xì)胞造成致命的滲透損傷。為減小細(xì)胞滲透損傷，設(shè)計(jì)制作適合卵母細(xì)胞保護(hù)劑去除的微流體裝置，研究微流控線性法去除豬MII期卵母細(xì)胞低溫保護(hù)劑時(shí)在不同時(shí)間(6、8、10 min)下卵母細(xì)胞的體積變化，以及對(duì)卵母細(xì)胞存活率與發(fā)育率的影響；并與傳統(tǒng)的去除方法(一步法和分步法)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，采用微流體裝置線性去除冷凍保護(hù)劑，8 min為實(shí)驗(yàn)中的最優(yōu)去除時(shí)間；線性法能夠明顯減小細(xì)胞的滲透損傷，其最大歸一化滲透膨脹體積為1.12±0.07，卵母細(xì)胞的存活率、卵裂率及囊胚率分別達(dá)到83.6%、72.4%、21.5%，均顯著高于一步法和分步法(P<0.05)。因此，微流控線性去除冷凍保護(hù)劑能夠顯著減小細(xì)胞的滲透損傷，為卵母細(xì)胞低溫保存技術(shù)提供新思路。

微流體；混合；卵母細(xì)胞；冷凍保護(hù)劑；滲透損傷

引言

卵母細(xì)胞的低溫保存在人類(lèi)的輔助生殖領(lǐng)域及優(yōu)良品種畜禽種質(zhì)資源的保存方面都具有重要的意義[1-2]。在細(xì)胞低溫保存過(guò)程中，需要添加冷凍保護(hù)劑來(lái)抑制冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷[3]。然而，由于保護(hù)劑自身具有化學(xué)毒性，復(fù)溫后的細(xì)胞不能直接使用，必須要將保護(hù)劑稀釋或去除。冷凍保護(hù)劑的去除過(guò)程與加載過(guò)程一樣，由于胞內(nèi)外滲透壓的變化，大量的水或保護(hù)劑會(huì)快速流入或流出細(xì)胞，從而引起細(xì)胞體積的劇烈變化，對(duì)細(xì)胞造成明顯的滲透損傷[4-6]。目前，研究者對(duì)冷凍保護(hù)劑的加載過(guò)程已經(jīng)做了大量的優(yōu)化研究，包括保護(hù)劑濃度、添加步驟、每一步的平衡時(shí)間、溫度等[7-9]。與加載過(guò)程相比，去除過(guò)程的研究就顯得薄弱很多。Liu等和Coticchio等模擬發(fā)現(xiàn)，冷凍保護(hù)劑的去除過(guò)程對(duì)細(xì)胞的滲透損傷要遠(yuǎn)大于其他步驟，縮短冷凍保護(hù)劑的去除程序可能會(huì)減少細(xì)胞的滲透損傷[10-11]。因此，有必要對(duì)細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的去除方法進(jìn)行改進(jìn)，從而進(jìn)一步提高其低溫保存的效果。

近年來(lái)，為減小保護(hù)劑去除過(guò)程對(duì)細(xì)胞的滲透損傷，提高細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的去除效率，研究學(xué)者也提出了一些新方法。張曉光等采用透析法來(lái)去除紅細(xì)胞滲透性低溫保護(hù)劑(甘油)，結(jié)果表明該方法能夠快速有效地去除紅細(xì)胞內(nèi)的低溫保護(hù)劑，去除后紅細(xì)胞的回收率為(89.17±2.46)%，血紅蛋白回收率為(84.93±4.64)%，細(xì)胞懸浮液的滲透壓(殘留甘油的含量)為(340.33±20.56)mOsm[12]。Mata等和Hanna等[15]提出采用微流體裝置去除臍帶血低溫保護(hù)劑，分別制作了水平兩流和垂直三流的微流體裝置，驗(yàn)證了微流體裝置去除冷凍保護(hù)劑的效率[13-15]。結(jié)果表明，微流體裝置能夠通過(guò)擴(kuò)散作用實(shí)現(xiàn)保護(hù)劑的去除，但是要達(dá)到較大處理量和95%以上的去除率則需要采用多級(jí)串聯(lián)的方式。與傳統(tǒng)的離心去除法相比，這些方法明顯減小了細(xì)胞的丟失率，改善了胞內(nèi)保護(hù)劑的去除效率，但僅適用于處理大量的小體積細(xì)胞，對(duì)于卵母細(xì)胞并不適合。因?yàn)槁涯讣?xì)胞體積較大，直徑大于100 μm，在臨床上多以單個(gè)細(xì)胞操作。目前，對(duì)于卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，通常采用分步去除的方法。盡管分步法對(duì)細(xì)胞的損傷小于一步法，但是分步法的實(shí)際操作程序比較繁瑣，同時(shí)細(xì)胞在不同的溶液間不斷轉(zhuǎn)移，容易造成細(xì)胞丟失，而且細(xì)胞仍然會(huì)經(jīng)歷多次的體積驟變[16]。關(guān)于微流體裝置用于卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑去除，這類(lèi)的相關(guān)研究還未見(jiàn)報(bào)道。

筆者設(shè)計(jì)制作了一個(gè)特殊的微流體裝置，用于豬MII期卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑(Me2SO)的去除研究。首先，對(duì)微流體線性法去除時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，分析了不同去除時(shí)間(6、8、10 min)下卵母細(xì)胞的體積變化，以及對(duì)卵母細(xì)胞存活率與發(fā)育率的影響；然后，比較了不同去除方式(一步法、兩步法、三步法、微流體線性法)下卵母細(xì)胞的體積變化，以及對(duì)卵母細(xì)胞存活率與發(fā)育率的影響，確定微流體裝置用于卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑去除的有效性，以期為卵母細(xì)胞保護(hù)劑去除方案的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

組織培養(yǎng)液(tissue culture medium 199, TCM199)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)、二甲基亞砜(Me2SO)、蔗糖、山梨醇、醋酸鈣、醋酸鎂，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購(gòu)自Gibco公司，美國(guó)。實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑除特別說(shuō)明外，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 玻璃化冷凍/解凍液

實(shí)驗(yàn)中所用溶液的溫度為37℃，濃度為體積比濃度?；A(chǔ)液：TCM199+20% FBS。玻璃化冷凍液：(VS1)基礎(chǔ)液+15% Me2SO；(VS2)基礎(chǔ)液+30% Me2SO。一步法解凍液：基礎(chǔ)液。兩步法解凍液：(WS1)基礎(chǔ)液+1 mol·L-1蔗糖，(WS2)基礎(chǔ)液。三步法解凍液：(WS1)基礎(chǔ)液+1 mol·L-1蔗糖，(WS2)基礎(chǔ)液+0.5 mol·L-1蔗糖，(WS3)基礎(chǔ)液。微流控線性法解凍液：基礎(chǔ)液+1 mol·L-1蔗糖。

1.3 豬卵母細(xì)胞的采集及MII期卵母細(xì)胞的獲得

從上海市嘉定區(qū)某屠宰場(chǎng)采集新鮮豬卵巢組織，放在37℃含1 000 μg/mL的雙抗生理鹽水中，1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用生理鹽水沖洗2～3次，選擇卵巢表面直徑為2～ 6 mm的卵泡，用10 mL的一次性注射器將卵母細(xì)胞復(fù)合體連同卵泡液一起吸出。將抽出的液體置于10 mL的離心管中，在39.5℃的恒溫水浴中靜置15～20 min，移除上清液。 取胞質(zhì)均勻且有3層以上致密卵丘細(xì)胞的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，即GV期卵母細(xì)胞。將GV期卵母細(xì)胞洗滌3次后，置于已平衡4 h以上的成熟培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液為T(mén)CM199+10% FBS+10% 豬卵泡液+0.1% 血清促性腺激素(PMSG)+ 0.1% 人絨毛膜促性腺激素(hCG)，然后再放入CO2培養(yǎng)箱((39±0.5)℃、5% CO2，BC-J160S，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，中國(guó))中，成熟培養(yǎng)44 ～ 46 h，得到MII期卵母細(xì)胞。 MII期卵母細(xì)胞用0.1%透明質(zhì)酸酶消化，以去除卵丘細(xì)胞，再用TCM199洗滌3 ～ 5次備用。

1.4 微流體芯片的設(shè)計(jì)與制作

用于卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑去除的微流體芯片如圖1(a)所示，主要包括流體混合通道、細(xì)胞分析腔、細(xì)胞出入通道等。蛇形混合通道的尺寸為長(zhǎng)100 mm×寬150 μm×高150 μm，解凍液和基礎(chǔ)液在通道內(nèi)層流擴(kuò)散混合，實(shí)現(xiàn)解凍液濃度的連續(xù)線性變化。細(xì)胞分析腔的尺寸為長(zhǎng)1 200 μm×寬1 000 μm×高150 μm，卵母細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞通道導(dǎo)入細(xì)胞分析腔。為了防止卵母細(xì)胞被流體沖走，在細(xì)胞分析腔的內(nèi)部加工了兩排直徑為100 μm的柱狀障礙物，障礙物之間的間距為50 μm，如圖1(b)所示。

圖1 用于卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑去除的微流體裝置結(jié)構(gòu)。(a)微流體芯片；(b)細(xì)胞分析腔Fig.1 The structure diagrams of microfluidic chip used oocyte unloading for CPA. (a)Microfluidic chip; (b)Oocyte analysis chamber

微流體芯片是通過(guò)模塑法來(lái)制作的。首先在硅晶片上利用光刻膠得到微流控芯片結(jié)構(gòu)的光刻模具，再將PDMS和固化劑混合均勻并澆注在模具上，等完全固化后將PDMS材料從模具上剝落下來(lái)，得到刻有微通道的微流控芯片基片；將PDMS基片和PDMS蓋片對(duì)齊符合完成封接，然后放在75℃的烘箱中加熱10 min，得到牢固的PDMS芯片；最后在芯片的制定位置處用鉆孔器打4個(gè)直徑為0.6 mm的孔，用塑料管連接注射泵和口吸器，使流體和細(xì)胞順利進(jìn)出微流體芯片。

1.5 用于卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑連續(xù)去除的微流控實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

圖2是實(shí)現(xiàn)卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑連續(xù)去除的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，主要由微量注射泵(Pump 11 Plus微量注射泵，Harvard，美國(guó))、微量進(jìn)樣器(1 mL微量進(jìn)樣器，上海高鴿工貿(mào)有限公司，中國(guó))、倒置熒光顯微鏡(TS100倒置熒光顯微鏡，Nikon，日本)、微流體芯片以及廢液瓶等組成。在導(dǎo)入卵母細(xì)胞之前，先將1 mol·L-1的蔗糖溶液充滿(mǎn)混合通道，然后將加載過(guò)Me2SO的卵母細(xì)胞吹進(jìn)細(xì)胞分析腔內(nèi)并開(kāi)啟注射泵，通過(guò)注射泵分別將解凍液和基礎(chǔ)液注入微流體芯片內(nèi)。由于蔗糖溶液的黏度較大，為保證溶液在微通道內(nèi)順暢流動(dòng)，并實(shí)現(xiàn)解凍液濃度的線性變化，實(shí)驗(yàn)中選擇混合通道內(nèi)溶液的總流量為5 μL/min，即控制基礎(chǔ)液的流量從0 μL/min增加到5 μL/min，同時(shí)解凍液的流量從5 μL/min減小到0 μL/min，去除時(shí)間為8 min。在去除過(guò)程中，連續(xù)記錄細(xì)胞體積的變化。去除結(jié)束后，將卵母細(xì)胞從細(xì)胞腔內(nèi)吸出，進(jìn)行細(xì)胞存活率及發(fā)育率的實(shí)驗(yàn)。

圖2 微流體裝置用于冷凍保護(hù)劑去除的系統(tǒng)Fig.2 The system diagram of CPA unloading with microfluidic device

1.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了研究冷凍保護(hù)劑去除過(guò)程對(duì)豬MII期卵母細(xì)胞滲透損傷的影響，以下兩組實(shí)驗(yàn)中冷凍保護(hù)劑(30% (V/V) Me2SO)的加載都采用相同的方法——兩步法，就是將卵母細(xì)胞從基礎(chǔ)液中轉(zhuǎn)移至15% (V/V) Me2SO中平衡3 min，然后移至30% (V/V) Me2SO中平衡30 s，完成冷凍保護(hù)劑的加載，備用。

實(shí)驗(yàn)1：對(duì)微流控線性法去除冷凍保護(hù)劑的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)注射泵控制流體流量，使腔體內(nèi)胞外解凍液的濃度分別在6、8、10 min內(nèi)，從1 mol·L-1線性減小到0 mol·L-1，具體的去除程序如圖3(a)所示。

圖3 實(shí)驗(yàn)方案。(a)不同時(shí)間的線性法去除方案;(b)4種不同的保護(hù)劑去除方式Fig.3 Experiment protocols in this study. (a) Linear protocols to different unloading duration; (b) Four different CPA unloading protocols

實(shí)驗(yàn)2：采用一步法、兩步法、三步法、線性法4種不同的方式去除卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，具體的去除程序和去除時(shí)間如圖3(b)所示。一步法：將卵母細(xì)胞直接轉(zhuǎn)移至基礎(chǔ)液中平衡8 min。兩步法：將卵母細(xì)胞移至1 mol·L-1蔗糖溶液中平衡2 min，然后移至基礎(chǔ)液中平衡6 min。三步法：將卵母細(xì)胞移至1 mol·L-1蔗糖溶液中平衡2 min，再移至0.5 mol·L-1蔗糖溶液中平衡3 min，然后轉(zhuǎn)移至基礎(chǔ)液中平衡3 min。線性法：將卵母細(xì)胞導(dǎo)入細(xì)胞分析腔內(nèi)，控制胞外解凍液濃度從1 mol·L-1線性減小到0 mol·L-1，去除時(shí)間設(shè)定為8 min。

1.7 細(xì)胞圖像采集與數(shù)據(jù)處理

在冷凍保護(hù)劑去除過(guò)程中，用帶有圖像采集系統(tǒng)的顯微鏡連續(xù)記錄并獲取整個(gè)過(guò)程中細(xì)胞(n=5)的體積變化圖片。假設(shè)卵母細(xì)胞為理想球體，利用圖像分析軟件測(cè)量細(xì)胞的二維投影面積，再通過(guò)球體體積與投影面積的換算關(guān)系式(V=0.752S3/2)，計(jì)算得到細(xì)胞的體積變化。

1.8 細(xì)胞存活率與發(fā)育率判斷

按照實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的方案去除冷凍保護(hù)劑后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，放入CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，然后將一部分細(xì)胞用熒光素雙醋酸酯(fluorescein diacetate, FDA)染色5 min，再用TCM199洗3～5遍，在倒置熒光顯微鏡下觀察是否著色。有強(qiáng)熒光反應(yīng)的為活卵，無(wú)熒光反應(yīng)或弱熒光反應(yīng)的為死卵?；盥褦?shù)與細(xì)胞總數(shù)之比為存活率。將另一部分細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活，激活后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)液中，然后放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)的第2、7天觀察細(xì)胞卵裂率和囊胚率。

1.9 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Mean±SD表示，并用SPSS Statistics 13.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同去除時(shí)間下卵母細(xì)胞體積變化

圖4 微流控線性法不同去除時(shí)間下MII期豬卵母細(xì)胞的體積變化Fig.4 Volumetric responses of MII porcine oocyte to different unloading duration with linear method

圖4表示微流控線性法不同去除時(shí)間下卵母細(xì)胞的體積變化?？梢钥闯?，在采用3種不同的去除時(shí)間時(shí)(6、8、10 min)，細(xì)胞體積都呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(shì)，其中最大歸一化滲透膨脹體積依次分別為1.18±0.02、1.12±0.07、1.07±0.01。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到滲透平衡時(shí)，6和8 min處理后細(xì)胞的體積基本能夠恢復(fù)到初始體積。然而，對(duì)于10 min去除方案來(lái)說(shuō)，從150 s之后細(xì)胞體積開(kāi)始突然減小，其最終歸一化體積為0.87±0.03。因此，8 min去除時(shí)細(xì)胞體積的改變量較小，細(xì)胞受到的滲透損傷較小，該時(shí)間為實(shí)驗(yàn)中的最佳去除時(shí)間。2.2 不同去除時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞存活率與發(fā)育率的影響

表1呈現(xiàn)了微流控線性法不同去除時(shí)間對(duì)卵母細(xì)胞存活率與發(fā)育潛能的影響?？梢钥闯?，線性法處理后細(xì)胞的存活率和發(fā)育潛能都顯著低于新鮮組，說(shuō)明該方法仍會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷。8 min去除方案下細(xì)胞的存活率和卵裂率分別為88.7%、72.5%，都顯著高于另外兩種去除方案(6和10 min)。然而，8 min去除方案下卵母細(xì)胞的囊胚率為21.5%，略高于6 min(20.2%)和10 min(18.4%)，但三者之間并無(wú)顯著性差異。

表1 微流控線性法不同去除時(shí)間對(duì)MII期豬卵母細(xì)胞存活率與發(fā)育率的影響

Tab.1 Effects of the different unloading durations with microfluidics on the survival rate and development rate in vitro of MII porcine oocytes

組別存活率/%卵裂率/%囊胚率/%對(duì)照組(n=127)97.7±4.2a85.4±3.4a30.7±6.1a6min(n=121)72.9±0.5b64.6±0.4b20.2±1.8b8min(n=118)88.7±6.8c72.5±3.9c21.5±3.7b10min(n=88)79.5±2.2d54.4±6.2d18.4±9.4b

注：不同字母表示組之間有顯著性差異，P<0.05。

Note: Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05).

圖5 4種不同去除方式下豬MII期卵母細(xì)胞的體積變化Fig.5 Volumetric responses of MII porcine oocyte under four different CPA unloading protocols

2.3 不同去除方式下卵母細(xì)胞的體積變化

圖5表示采用不同的方式去除胞內(nèi)保護(hù)劑Me2SO時(shí)卵母細(xì)胞的體積變化?？梢钥闯?，用一步法、兩步法、三步法和線性法去除冷凍保護(hù)劑時(shí)，細(xì)胞體積都呈現(xiàn)先增大后逐漸減小的變化趨勢(shì)。采用一步法去除保護(hù)劑時(shí)，卵母細(xì)胞的歸一化最大滲透體積達(dá)到了1.92±0.04，同時(shí)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到滲透平衡時(shí)，其體積也不能恢復(fù)到初始體積。與一步法相比，分步法和線性法去除冷凍保護(hù)劑時(shí)，卵母細(xì)胞體積的膨脹程度明顯減小，細(xì)胞的最大歸一化滲透體積分別為1.33±0.05、1.12±0.07。線性法去除冷凍保護(hù)劑時(shí)，細(xì)胞體積的變化曲線更平緩，說(shuō)明微流體法對(duì)細(xì)胞的滲透損傷要小于一步法和分步法。2.4 不同去除方式對(duì)卵母細(xì)胞存活率與發(fā)育率的影響

為了探究微流體法用于卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑去除的有效性，比較了一步法、兩步法、三步法及線性法4種不同的去除方式對(duì)豬MII期卵母細(xì)胞存活率和發(fā)育潛能的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。兩步法和三步法去除保護(hù)劑時(shí)卵母細(xì)胞的存活率、卵裂率、囊胚率分別為(62.5%、48.6%、10.3%)和(71.4%、50.3%、12.7%)，都顯著高于一步法(15.2%、0、0)。然而，兩步法和三步法在卵母細(xì)胞的發(fā)育率方面無(wú)顯著性差異，說(shuō)明分步步數(shù)的增加并不能改善細(xì)胞的發(fā)育率。采用線性法去除冷凍保護(hù)劑后，卵母細(xì)胞的存活率、卵裂率及囊胚率分別為83.6%、72.4%、21.5%，均顯著高于一步法和分步法，說(shuō)明線性法對(duì)細(xì)胞的滲透損傷最小，用于卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的去除是有效的。

表2 冷凍保護(hù)劑不同去除方式對(duì)MII期豬卵母細(xì)胞存活率與發(fā)育率的影響

Tab.2 Effects of different CPA unloading protocols on the survival rate and development rate in vitro of MII porcine oocytes

組別存活率/%卵裂率/%囊胚率/%對(duì)照組(n=176)(96.8±2.1)a(85.8±1.0)a(41.46±1.5)a一步法(n=121)(15.2±3.6)b0.0±0.0b0.0±0.0b兩步法(n=104)(62.5±1.0)c(48.6±8.4)c(10.3±2.5)c三步法(n=117)(71.4±1.2)d(50.3±14.6)c(12.7±2.2)c線性法(n=72)(83.6±6.1)e(72.4±3.9)e(21.5±3.7)e

注：不同字母表示組之間有顯著性差異，P<0.05。

Note: Values with different superscripts in the same column are significantly different (P<0.05).

3 討論

本研究首先對(duì)微流體線性法去除時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著去除時(shí)間的增加，細(xì)胞體積的改變量越小，說(shuō)明細(xì)胞所受的滲透損傷越小，這是因?yàn)殡S著去除時(shí)間的延長(zhǎng)，胞外緩沖液濃度(蔗糖濃度)的變化梯度減小，縮小了胞內(nèi)外滲透壓差，從而減小了細(xì)胞膨脹所帶來(lái)的滲透損傷[17]。但采用10 min方案去除冷凍保護(hù)劑時(shí)，反而會(huì)對(duì)細(xì)胞造成更大的損傷，處理后卵母細(xì)胞的存活率、卵裂率及囊胚率分別僅為79.5%、54.4%、18.4%。究其原因，是10 min去除使得微通道內(nèi)解凍液流量過(guò)小，流體雷諾數(shù)變小，層流邊界層變厚，溶液黏性力變大，有可能造成流體流動(dòng)形態(tài)的改變[18]，從而使高濃度解凍液在細(xì)胞腔內(nèi)聚集，導(dǎo)致細(xì)胞在高濃度溶液中暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。另外，去除時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，冷凍保護(hù)劑的洗脫效率下降，細(xì)胞在高濃度保護(hù)劑中暴露的時(shí)間太長(zhǎng)，保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的毒性損傷作用抵消了細(xì)胞體積變化小帶來(lái)的優(yōu)勢(shì)，反而不利于細(xì)胞的低溫保存[17]。

采用不同方式去除胞內(nèi)保護(hù)劑時(shí)，一步法的效果最差，細(xì)胞的最大滲透膨脹體積超過(guò)了其臨界體積[19-20]，從而造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞骨架系統(tǒng)的損傷，處理后細(xì)胞的存活率、卵裂率、囊胚率分別為15.2%、0、0。采用兩步法和三步法去除時(shí)，細(xì)胞體積的膨脹要明顯減小一步法，說(shuō)明分步法顯著減小了細(xì)胞的滲透損傷[10,21]。Wang等比較了四步法添加、一步法和兩步法去除對(duì)牛MII期卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響[22]，結(jié)果表明兩步法去除后細(xì)胞的卵裂率(62.6%)與一步法(60.4%)無(wú)顯著性差異，但囊胚率(11.1%)要顯著高于一步法(9.5%)。但分步去除冷凍保護(hù)劑時(shí)，細(xì)胞暴露在1 mol.L-1蔗糖溶液中，細(xì)胞的體積會(huì)出現(xiàn)先膨脹后收縮的現(xiàn)象，其原因可能是Me2SO分子快速流出細(xì)胞，使胞外溶液的濃度高于胞內(nèi)，細(xì)胞開(kāi)始逐漸脫水，與此同時(shí)，胞外的Me2SO分子與蔗糖分子相結(jié)合，抑制了水流入細(xì)胞。線性法去除對(duì)細(xì)胞的滲透損傷最小，處理后細(xì)胞的存活率、卵裂率、囊胚率都顯著高于一步法和分步法，這一結(jié)果與Song等采用微流體裝置加載并去除肝細(xì)胞低溫保護(hù)劑的方法[23]類(lèi)似，處理后肝細(xì)胞的存活率比一步法高25%，比兩步法高10%。

4 結(jié)論

1)在37℃條件下，對(duì)于微流控線性法不同去除時(shí)間(6、8、10 min)，卵母細(xì)胞的體積都呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(shì)，其中8 min為實(shí)驗(yàn)中的最優(yōu)去除方案。該方案下細(xì)胞的存活率和卵裂率分別為88.7%、72.5%，均顯著高于6 min(72.9%、64.6%)和10 min(79.5%、54.4%)(P<0.05)，但囊胚率為21.5%，略高于6 min(20.2%)和10 min(18.4%)，三者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2)線性法去除冷凍保護(hù)劑，卵母細(xì)胞的體積變化曲線比較平緩，其最大歸一化滲透膨脹體積為1.12±0.07，明顯小于一步法(1.92±0.04)和分步法(1.33±0.05)。用線性法處理，卵母細(xì)胞存活率、卵裂率及囊胚率分別達(dá)到了83.6%、72.4%、21.5%，均顯著高于一步法和分步法(P<0.05)，說(shuō)明微流控線性法去除保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的滲透損傷最小，用于卵母細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的去除是有效的。

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Experimental Study of Linear Removing Cryoprotective Agents from MII Porcine Oocytes with Microfluidics Device

Zhou Xinli1*Yang Yun1Dai Jianjun2Zhang Defu2Shao Wenqi1Yi Xingyue1Tao Leren1

1(InstituteofBiothermalTechnology,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China)2(AnimalandVeterinaryResearchInstitute,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai201106,China)

Cryoprotective agents (CPAs) must be removed from cryopreserved oocytes before used in clinic. Step-wise methods usually lead to the cell loss due to complicated operating steps, and may cause fatal osmotic injury to oocytes during CPAs removal process. In order to minimize the osmotic injury to oocytes, a microfluidic device for unloading CPAs from oocytes was designed and fabricated in this study. CPAs were linear unloaded from MII porcine oocytes with microfluidic device under different durations (6 min, 8 min and 10 min), the cell volume changes and the effects on the survival and developmental rate of oocytes were investigated, and then compared with that obtained by the conventional step-wise methods. Results showed that 8 min duration was optimal for linear unloading CPAs with microfluidic device. The linear method remarkably reduced the osmotic injury to oocytes during the removal of CPAs. The highest normalized swelling volume of oocyte only reached 1.12±0.07. The survival, cleavage and blastocyst rate of oocytes were 83.6%, 72.4% and 21.5%，respectively, which were significantly higher than those of one-step method and step-wise methods (P<0.05). In conclusion, linear unloading CPAs with the microfluidic method can significantly alleviate the osmotic damage to oocytes, which may provide a new path for oocyte cryopreservation.

microfluidics; mixing; oocyte; CPA; osmotic injury

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 04.008

2016-09-20， 錄用日期:2017-04-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(51376132)

R318

A

0258-8021(2017) 04-0442-07

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: zjulily@163.com