金納米顆粒表面電荷密度介導(dǎo)的納米生物效應(yīng)研究

張銘倚

(國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作天津中心, 天津，300304)

金納米顆粒表面電荷密度介導(dǎo)的納米生物效應(yīng)研究

張銘倚

(國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作天津中心, 天津，300304)

本文由11-巰基十一烷酸(MUA)和1-辛硫醇(OT)組成的混合自組裝單層構(gòu)建表面電荷密度不同的 GNPs(33%，50%，67%和100% MUA GNPs)，并研究了它們與血清蛋白的相互作用以及對巨噬細(xì)胞的活性影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，33%和50% MUA GNPs 在培養(yǎng)基環(huán)境中保持良好的穩(wěn)定性，67%和100% MUA GNPs 在培養(yǎng)基環(huán)境中穩(wěn)定性顯著降低，且100% MUA GNPs 穩(wěn)定性最差。100% MUA GNPs造成巨噬細(xì)胞RAW264.7新陳代謝活性異常增高，并且引起DNA損傷。

納米顆粒；表面電荷密度；納米-蛋白相互作用；DNA損傷

1 引言

表面修飾是納米材料降低表面勢能的重要方式之一，同時也為其引入新的性質(zhì)和功能用途。在納米醫(yī)藥領(lǐng)域，調(diào)控表面性質(zhì)可用于影響納米顆粒與蛋白的熱力學(xué)和動力學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致其生物效應(yīng)的不同[1]。目前納米顆粒在醫(yī)藥領(lǐng)域最大的使用屏障是如何能降低其非特異性蛋白吸附，從而避免被單核吞噬系統(tǒng)識別和清除，以保證其在體內(nèi)的靶向性。例如，將納米顆粒表面修飾上中性配體PEG是目前最有效和常用的阻止蛋白吸附的方法[2，3]。研究證明，顆粒表面的電荷性質(zhì)調(diào)控其進(jìn)入細(xì)胞的途徑和效率，例如，正電荷顆粒具有較強(qiáng)的膜粘附性，因?yàn)榧?xì)胞表面的負(fù)電荷基團(tuán)豐富(如唾液酸、磷脂分子頭部的極性基團(tuán)等)，導(dǎo)致正電荷納米顆粒可以首先通過靜電吸附作用吸附在細(xì)胞表面，然后通過誘導(dǎo)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。負(fù)電荷納米顆粒雖然與細(xì)胞的粘附性稍差，但是也可以通過非特異性途徑進(jìn)入細(xì)胞[4]。除了電性質(zhì)，表面電荷密度的調(diào)節(jié)也會影響納米顆粒的細(xì)胞攝取。例如，Villanueva等[5]用肝素和二巰基丁二酸(DMSA)修飾氧化鐵得到負(fù)電荷密度不同的納米顆粒，并作用于宮頸癌細(xì)胞(Hela)，DMSA-氧化鐵顆粒的細(xì)胞攝取率明顯低于肝素包被的顆粒，且后者進(jìn)一步引起細(xì)胞有絲分裂紡錘體形貌異常。但是由于兩種分子的結(jié)構(gòu)差異明顯，因此無法確定導(dǎo)致這些差異的根本原因和機(jī)理。這里，我們利用金原子和巰基之間的配合作用，在金納米顆粒(GNPs)表面修飾上不同比例的11-巰基十一烷酸(MUA)和1-辛硫醇(OT)，二者結(jié)構(gòu)相近，一個帶有負(fù)電荷羧基，一個是中性分子。我們從蛋白分子和細(xì)胞層面，初步探討不同負(fù)電荷密度的納米顆粒表面的生物效應(yīng)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 金納米顆粒修飾

將18nm金納米顆粒(實(shí)驗(yàn)室自己合成)與巰基化合物混合，室溫下氮?dú)夥障路磻?yīng)過夜。其中，巰基化合物由不同比例的11-巰基十一烷酸(MUA)和1-辛硫醇(OT)組成(購自Sigma美國公司)，根據(jù)MUA比例的不同將樣品分別記為33%MUA GNPs，50%MUA GNPs，67%MUA GNPs和100%MUA GNPs。

2.2 不同表面修飾GNPs與血清的相互作用

將33%MUA GNPs，50%MUA GNPs，67%MUA GNPs和100%MUA GNPs分別與含有10%胎牛血清的Hanks(均購自AmrescoInc, USA)緩沖液在37℃下孵育半小時和24小時，然后用UV-Vis(普析通用，中國)掃描400-800 nm范圍。

將金納米顆粒與FBS在37℃下孵育30分鐘后，在1%瓊脂糖凝膠上120 V電泳18分鐘。

2.3 細(xì)胞活性檢測

RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞(北京協(xié)和細(xì)胞庫)活性用CCK-8試劑(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)檢測，酶標(biāo)儀上450 nm讀數(shù)。

2.4 彗星電泳

將細(xì)胞用GNPs處理12小時后，按下述步驟進(jìn)行堿性彗星電泳[7]：在載有正常熔點(diǎn)的瓊脂糖磨砂載玻片上，加入含有10 μL的細(xì)胞和90 μL0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖，加蓋玻片，置4℃下冷卻10分鐘，使膠凝固。去蓋玻片后再鋪一層低熔點(diǎn)瓊脂糖。凝固后，放于新鮮配制的裂解液(2.5M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 10, 用前加入1%TrionX-100和10%DMSO)中2小時(4℃)。將載玻片取出，用清水洗兩遍后放入預(yù)冷的堿性電泳液中(1 mM EDTA和300 mM NaOH)解螺旋20 min，在25 V、300 mA條件下電泳20 min。電泳結(jié)束后，用中和液(400 mM Tris-HCl緩沖液,pH 7.4)洗滌兩次，每張載玻片加30 μL GelRed并加蓋玻片染色5 min。每張片子上隨機(jī)觀察至少80個細(xì)胞。用CASP軟件分析細(xì)胞的尾力矩，并用SPSS16.0(美國IBM公司)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 表面羧基化程度不同GNPs與血清蛋白的相互作用

根據(jù)Mie散射理論[6]，當(dāng)金屬納米顆粒穩(wěn)定性降低，顆粒間距減小到粒徑量級時，顆粒會在更長的光波處發(fā)生表面等離子體共振吸收(Surface Plasmon Resonance, SPR)，導(dǎo)致吸收峰的紅移和波譜展寬。18 nm GNPs的SPR吸收峰在520 nm附近，當(dāng)分散性降低時，SPR吸收峰發(fā)生紅移，波帶展寬。利用這一原理，我們觀察GNPs在含有10%FBS的Hanks液中的穩(wěn)定性。吸收光譜結(jié)果(圖1)顯示33%和50%MUA GNPs在培養(yǎng)基中穩(wěn)定性良好，孵育24小時后，光譜沒有出現(xiàn)展寬和波峰紅移。67%MUA GNPs在培養(yǎng)基中孵育0.5小時后出現(xiàn)波峰小范圍紅移，孵育24小時后半峰展寬。100%MUA GNPs在培養(yǎng)基中穩(wěn)定性最差，加入樣品的瞬間金顆粒溶液顏色由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色，吸收光譜結(jié)果顯示波峰出現(xiàn)明顯的紅移，且隨著時間的延長，半峰寬增大。以上結(jié)果表明，在10%FBS培養(yǎng)基環(huán)境中，33%和50%MUA GNPs的分散性沒有受到影響。但隨著MUA比例進(jìn)一步增加，67%MUA GNPs SPR吸收峰出現(xiàn)小范圍紅移和半峰展寬。說明血清蛋白結(jié)合在該樣品上，并對該樣品的分散性產(chǎn)生一定的影響。100%MUA GNPs加入到培養(yǎng)基環(huán)境中短時間內(nèi)顏色發(fā)生明顯變化，SPR吸收峰出現(xiàn)大范圍紅移，半峰展寬，說明該樣品與血清蛋白能快速的形成復(fù)合物，導(dǎo)致樣品分散性急劇降低。

圖1 表面電荷密度不同GNPs分別在Hanks液(含10%FBS)中孵育不同時間后的SPR吸收峰位置變化。上端插入圖為100%MUA GNPs的光譜掃描結(jié)果

當(dāng)GNPs吸附蛋白后，其電泳行為必定受到影響，進(jìn)一步使用凝膠電泳法觀察血清蛋白對表面電荷密度不同的GNPs電泳行為的影響(圖2)。33%和50%MUA GNPs與FBS孵育后，顆粒的遷移率與原樣品幾乎相同(條帶1-4)。其中，50%MUA GNPs與血清孵育后，條帶4較條帶1顏色淺，且在上方能看到極淺的擴(kuò)散條帶(粉色框標(biāo)示)，說明該組分樣品能夠少量的吸附蛋白，從而小范圍的影響其電泳行為；67%MUA GNPs中這一現(xiàn)象更加明顯(橘色框)，且條帶5和6之間出現(xiàn)明顯的距離。條帶7和8之間的距離最大，且有一部分樣品阻滯在點(diǎn)樣孔附近。

圖2 凝膠電泳檢測血清蛋白對GNPs電泳性質(zhì)的影響。1,3,5,7分別是33%，50%，67%和100%MUA GNPs的電泳條帶；2,4,6,8分別是相應(yīng)的GNPs與100%FBS孵育20分鐘后的電泳條帶

隨著表面MUA比例的增加，血清蛋白對顆粒的凝膠阻滯現(xiàn)象越來越明顯。值得關(guān)注的是100%MUA GNPs與血清孵育后的兩條條帶(泳道8)，一條在點(diǎn)樣孔附近，一條與原顆粒樣品間距比其他三個樣品都大。結(jié)合SPR吸收峰結(jié)果，一方面說明100%MUA GNPs樣品表面負(fù)電荷密度最大，另一方面也說明該樣品對血清蛋白的吸附作用最強(qiáng)，導(dǎo)致其表面電荷性質(zhì)受到強(qiáng)烈干擾。

3.2 納米顆粒對細(xì)胞活性的影響

CCK-8檢測細(xì)胞活性的原理是，通過直接檢測線粒體內(nèi)脫氫酶的酶活性間接說明細(xì)胞的活性變化。因此，CCK-8直接測定的是細(xì)胞的新陳代謝活性。結(jié)果表明GNPs在1-8 nM范圍內(nèi)(圖3)，沒有造成巨噬細(xì)胞新陳代謝活性的明顯降低。但是，100%GNPs樣品在高濃度造成活性明顯增高。我們推測，當(dāng)大量顆粒進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞較強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞的代謝能力明顯增強(qiáng)。

圖3 不同濃度GNPs處理后，巨噬細(xì)胞的新陳代謝活性。每個樣品重復(fù)5遍，P<0.05。

3.3 納米顆粒對細(xì)胞DNA的損傷效應(yīng)

檢測表面電荷密度不同的GNPs對RAW 264.7 DNA穩(wěn)定性的影響，彗星電泳結(jié)果顯示(圖4)顆粒濃度為2 nM時，只有100%MUA GNPs造成明顯的DNA單鏈損傷。100%MUA GNPs大量進(jìn)入細(xì)胞后，引起線粒體等細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)受損，可能是該樣品在低濃度下即造成DNA損傷的原因。

圖4 堿性彗星電泳檢測GNPs對RA264.7細(xì)胞DNA穩(wěn)定性的影響。上圖為彗星電泳結(jié)果示意圖：a-對照，b-33%MUA GNPs，c-50%MUA GNPs，d-67%MUA GNPs，e-100MUA GNPs。處理濃度為2 nM。下圖為統(tǒng)計分析后得到的彗尾力矩結(jié)果，每個樣品中至少分析細(xì)胞數(shù)80個，每個樣品重復(fù)三遍，p<0.01。

4 結(jié)論

早期在進(jìn)行混合自組裝單層的研究中，發(fā)現(xiàn)將帶有相反電荷的兩種表面活性劑分子共吸附在金平面上，能有效阻止蛋白的非特異性吸附[8]。在此基礎(chǔ)上，Ji Jian等將10-巰基十烷基磺酸和10-巰基十烷基溴化銨按3:7、5:5和7:3混合吸附到16 nm GNPs上，發(fā)現(xiàn)三種顆粒也能很好的阻止血清蛋白吸附[9]。本文研究了表面羧基化程度不同的金納米顆粒的生物效應(yīng)。得到以下結(jié)果：使用疏水/親水性不同的1-辛硫醇(OT)和11-巰基十一烷酸(MUA)構(gòu)建不同電荷密度的GNPs，抵抗血清蛋白吸附順序如下33%MUA GNPs>50%MUA GNPs>67%MUA GNPs>100%MUA GNPs。33%和50%MUA GNPs在培養(yǎng)基環(huán)境中保持良好的穩(wěn)定性，兩種表面修飾能有效阻止血清蛋白在顆粒表面的吸附，大大降低巨噬細(xì)胞對兩種顆粒的識別和吞噬。67%和100%MUA GNPs在培養(yǎng)基環(huán)境中穩(wěn)定性顯著降低，其中100%MUA GNPs穩(wěn)定性最差。血清蛋白在兩種表面的吸附逐漸增加，彗星電泳結(jié)果表明該樣品2nM即可造成DNA明顯損傷。

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Surface charge densities-mediated nano-bio effect of GNPs

ZHANGMing-yi

(Patent Examination Cooperation Tianjin Center of the Patent Office. SIPO, Tianjin, 300304，China)

A mixed SAMs containing 11-mercaptoundecanoic acid (MUA) and 1-octanethiol (OT) was used to construct GNPs with different surface charge densities. The interaction between GNPs and fetal bovine serum get stronger when more MUA was adsorbed on the nanoparticle surface. 100% MUA GNPs caused an abnormal increase of metabolic activity as well as DNA damage. These results indicated that it is feasible to control the interaction of nanoparticles with bovine serum by regulation their surface charge densities, which influenced their cellular uptake process by macrophages and subsequent bio-effects.

nanoparticles;surface-charge density;nano-protein interaction;DNA damage

2017-05-06.

張銘倚(1985-)，女，博士，E-mail:zhangmytracy@126.com.

2095-7386(2017)02-0041-04

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.02.008

O 614.123

A